【doc】尿中性肽链内切酶：一种新的肾小管损伤指标

【doc】尿中性肽链内切酶：一种新的肾小管损伤指标 尿中性肽链内切酶:一种新的肾小管损伤指 标 诊断学理论与实践2003年第2卷第4期 ? 论着? 尿中性肽链内切酶:一种新的肾小管损伤指标 陈楠张智王伟铭史浩 上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科(200025) 任红1陈晓农张文周文达 上海第二医科大学医学检验重点实验室(200025) 目的:建立尿中性肽链内切酶(NEP)检测,并应用于肾小管损伤的判断.方法:应用明治ELISA法和荧光 法检测尿NEP.对两种方法的检测效果予以评价.并比较两种方法在帮助诊断肾小管疾病中的符合率及差异性.对 各种肾脏疾病患者与正常对照组尿NEP进行比较.并在各组内对尿NEP与其他代表肾小管损伤的指标进行比较. 结果:两者符合率大致相等.在各组中两种方法检测结果的差异无显着性.在急性肾小管损伤组中,尿NEP明显高于 正常对照组:在慢性肾小管损伤组,马兜铃酸肾病组,慢性肾功能衰竭组,尿NEP均明显低于正常对照组,且尿NEP 与尿微量蛋白呈不同程度的负相关;在单纯肾小球疾病组,尿NEP与 正常对照组差异无显着性,与尿微量蛋白不相 关.结论:尿NEP在肾脏疾病的不同病程中出现双向的变化,当结合 其他尿微量蛋白检测时,可以帮助判断肾小管损 伤处于急性期还是慢性期.从而有助于选择治疗和评估预后 关键词肾小管上皮细胞肾小管疾病中性肽链内切酶酶联免疫吸附 中图分类号:R692.6;R446.12文献标识码:A文章编 号:1671—2870(2003)04—0275.04 UrinaryNeutralEndopeptidase:aNewMarkerforRenalTubularInjuryCHENNan,ZHANGZhi,WANG Weiming,eta1.DepartmentofNephrology,RuijingHospital,ShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai(200025) objective:Toestablishmethodsofmeasuringurinaryneutralendopeptidase(NEP)andtojudgetherenaltubular injury.Methods:SandwichELISAandtwo—stepfluorimetricassaywereus edtodeterminetheurinaryNEP.Theaccuracy andrepeatabilityofbothmethodswereinvestigated.UrinaryexcretionofNEPwasdetectedin149hospitalizedpatients withdifferentkindsofrenaldiseasesandnormalcontrolsandtheresultswerecomparedwithothermarkersoftubular injury.Results:TherewerenosignificantdifferencesofurinaryNEPlevelsdeferminedbythetwoassaysbetween patientswithrenaldiseasesandbetweennormalcontrols.Butthelevelinpatientswithacutetubularinjurywasmuch higherthanthatofnormalcontrolgroup,whilethosewithchronictubularinjury,Aristoloehieacidnephropathyorchronic renalfailureweremuchlower.Moreover,NEPenzymuriapositivelycorrelatedwithindividualcreatinineclearancevalues andnegativelycorrelatedwithurinarymicro—proteinslevels.Conclusion: UrinaryNEPchangesindifferentprocessesof renaltubularinjury,anditmaybeusefulforestimatingtheacutetubularinjuryorchronictubularinjurytogetherwith othertubularmarkers. KeywordsRenaltubularepithelialcellRenaltubulardiseaseNeutralendopeptidaseELISA 中性肽链内切酶(neutralendopeptidase,NEP) 是哺乳动物细胞表面的一种含锌金属肽酶【1_.是NEP 酶家族中的一员.属?型完整膜蛋白.在调节肽类代 谢中起重要作用.NEP在肾脏和肺组织中含量最丰 富,3种NEP的mRNA(I型,1Ia型和1Ib型)在肾 的近端小管均有表达,其中1Ib型表达最高.这种 肽链内切酶大量地位于近端小管上皮刷状缘膜上, 在生理状态下只以顶膜片段形式少量地排人尿液. 处理出现在肾小管液中的滤过出来的肽类.与其他 近端小管上皮细胞膜表面的蛋白质如丙氨酸氨基肽 酶(AAP),一谷氨转肽酶(一GT)一样,NEP在肾小管 细胞受损时才大量地释放入尿液. 基金项目:本课题获上海市卫生局专业领先学科(983009),上海市 医学发展基金(2003ZD002)资助 本研究采用两种方法分别测定了正常对照组 和患者组尿中NEP的量,同时检测其他肾小管损 伤的指标和多项临床指标,进行综合比较,以探讨 尿NEP的检测在诊断肾小管损伤中的意义. 资料与方法 1.受试对象 患者组共分为5组,包括急性肾小管损伤组(A 组),慢性肾小管损伤组(B组),马兜铃酸肾病组(C 组),单纯肾小球疾病组(D组),肾小球疾病所致的 慢性肾功能衰竭(CRF)组(E组).所有病例来自 2002年1,10月在上海第二医科大学附属瑞金医院 住院患者,均经病理诊断或临床确诊.临床诊断主要 依据病史,体检和实验室检查,其中除常规检查外. 同时检测患者的尿常规,尿仅.微球蛋白(仅.MG),尿 转铁蛋白(TRU),尿视黄醇结合蛋白(RBP),尿N.乙 酰.B.D.氨基葡萄糖苷酶(NAG),尿免疫球蛋白G (IgG),尿肌酐(UCr),血,尿渗透压,血清肌酐(SCr), 24h尿电解质,尿可滴定酸和尿铵,血B2-MG,血仅, MG,尿B:.MG,尿.MG,尿氨基酸,尿糖,尿蛋白电 泳,尿浓缩稀释实验等.正常对照组均系本院健康医 务人员和上海第二医科大学健康在校生 2.尿NEP的测定方法 人肾NEP纯品由FacuhedeMedecine,Univer. siteLibredeBruxellesfULB).Pr0f.M.Deschodt, Lanckman惠赠. (1)ELISA法./J,鼠抗人NEP单抗,兔抗人NEP 多抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠免疫 球蛋白抗体均为基因公司产品.应用ELISA法检测 尿样,结果用其相应的尿肌酐值校正,即以尿NEP 与UCr的比值表示(g/mmolCr). (2)荧光法[41:采用底物fSuc.Ala.Ala.Phe.AMC. Sigma)发光法进行检测,在A=367nm,A=440nm 处得到荧光度.尿样检测结果以尿NEP与UCr的 比值表示(Ixg/mmolCr). 3.其他指标的测定 患者于实验前日留取24h尿,检测UCr,电解 质,l—MG,TRU,RBP,NAG,IgG,渗透压,可滴定酸, 并检测SCr等.内生肌酐清除率(CCr)由Cockcrofl— Gauh公式计算得到:男性CCr=(140一年龄)×体重/ (72xSCr),女性CCr=(140一年龄)×体重/(85xSCr). 4.统计学处理 用SAS6.12软件及Excel进行相关性分析, Wilcoxin秩和,符号秩检验和描述性分析. 结果 1.正常对照组尿NEP的检测结果 正常对照组尿NEP的95%可信区间为46.29 89.52Ixg/mmolCr.男女尿NEP差异无显着性( JDiagnConceptsPraet2003,Vo1.2,No.4 0.9356,P>0.05),<60岁组和?60岁组尿NEP差 异无显着性(Z=I.5483,P>O.05,表1). 表1正常对照组尿NEP的检测结果(ug/mmolCr) 2.患者组与正常对照组尿NEP比较 A组尿NEP明显高于正常对照组(P<0.01);B 组,C组和E组尿NEP明显低于正常对照组(P< 0.01).而D组尿NEP与正常对照组之间差异无显 着性f表2). 表2患者组与正常对照组尿NEP的比较(pg/mmolCr) 3.各组尿NEP两种检测方法的差异性比较 由表3可见,各组两种检测方法之间的差异无 显着性(P均>0.05). 表3两种尿NEP检测方法的比较(pg/mmolCr) 4.各组尿NEP与CCr,微量蛋白的相关性 A组尿NEP与尿NAG呈正相关(P<O.05):B 组尿NEP与CCr,NAG呈正相关,与尿RBP,仅..MG 呈负相关(P均<0.05);C组尿NEP与Ccr,NAG呈 正相关,与尿仅..MG呈负相关(P均<0.05);D组尿 NEP与CCr及尿微量蛋白均无相关性:E组尿NEP 与CCr呈正相关,与尿RBP,仅rMG呈负相关(P 表4尿NEP与CCr,微量蛋白的相关性分析 诊断学理论与实践2003年第2卷第4期 均<O.O5,表4). 5.NEP两种检测方法的符合率比较 符合率是一项能同时反映灵敏度和特异度的 指标,符合率:(真阳性率+真阴性率)/总病例数.为 了比较ELISA法和荧光法检测尿NEP的效果.以 尿NAG活性,尿仅.一MG作为肾小管损伤的参考指 标,对两种检测方法进行符合率比较,结果见表5. 检验显示:各患者组两种方法检验的符合率差异 均无显着性(P>0.05). 表5两种方法检测尿NEP符合率的比较 讨论 肾脏中.NEP主要存在于近端肾小管刷状缘膜 上.从人尿中分离出来的NEP是可溶性的,在血 中含量极微,且其相对分子质量较大(94000),不 能自由通过肾小球基底膜.因此,尿中的NEP主要 是由近端小管排出的.尿中NEP量可实际反映近 端小管顶端残留的未受损的刷状缘的比例14,6].NEP 在正常人群中的参考值各家报道不一,可能由于操 作方法,健康人群的选定,检测仪器的差异所致.本 研究检测100名健康正常人,尿NEP的中位数为 68.41lxg/mmolCr.与Lanchman等报道的大致相 近.男女间无差异,各年龄组间亦无差异17]. 本研究显示.A组尿NEP的量明显高于正常 对照组,而B组,C组,E组尿NEP均明显低于正常 对照组.D组尿NEP的量与正常对照组无差异.在 A组尿NEP与尿NAG呈正相关,而与其他几种尿 微量蛋白间无相关性.其他几组的尿NEP与CCr 呈正相关.与尿微量蛋白呈负相关.在D组的尿 NEP与尿微量蛋白无明显相关性.这种现象可能的 解释是,在缺血,中毒等引起急性肾小管损伤时,近 端小管刷状缘大量脱落,NEP随脱落的刷状缘排人 尿中.尿中NEP明显增加.此时部分肾小管重吸收 功能下降,而部分肾小管重吸收功能却代偿性增 加.因此.反映近端肾小管重吸收功能的尿微量蛋 白尚无明显变化.与尿NEP无明显相关性:进入慢 性损害期的肾小管.已不能再提供NEP释放人尿 液中.其尿中的NEP降低.同时其肾小管损伤的程 度越重.肾小管的重吸收功能就越差,因而,尿内排 出的微量蛋白就越多.尿NEP与尿微量蛋白之间 出现程度不等的负相关I. 本研究发现A组尿NAG与尿NEP均明显增 高且呈正相关.B组和C组尿NAG与尿NEP均减 低并呈不同程度的正相关.这可以理解为在急性肾 小管损伤时.近端小管细胞破坏,脱落,NEP和 NAG亦随破坏的肾小管细胞进入尿液,在尿中同 时增加;而当肾小管损伤进入慢性期.上皮细胞萎 缩,脱落减少.尿中的NEP和NAG排出亦减少. TRU和IgG属大分子蛋白,两者在尿中增加主要反 映肾小球滤过功能严重损害.在本研究中未发现它 们与尿NEP有相关性.这些与DialechtiVlaskou等 学者的研究结果是一致的19]. Fine等?认为,肾功能进行性减退的共同病理 途径就是肾小管上皮的慢性损伤.而不管其原发病 是哪一种肾脏疾病.本研究发现,在B组,C组及E 组,其尿NEP与CCr均呈不同程度的正相关.在D 组,虽未发现尿NEP与CCr有相关性,但在肾小球 疾病晚期进入肾功能不全的E组却发现尿NEP与 CCr呈正相关.这从一个侧面证实慢性严重肾小管 损伤势必会引起肾小球滤过功能相应的降低. 本研究选取了l3例马兜铃酸肾病患者,男5 例.女8例.服用马兜铃酸半年至5年,其中8例有 肾活检病理.光镜下表现为广泛的少细胞性肾间质 纤维化,肾小管萎缩,缺失,以近端小管受累为主. 每例均检测其尿NEP,尿微量蛋白及其他临床指 标.结果发现.此组尿NEP显着低于正常对照组, 尿NEP与CCr和NAG呈正相关,与尿仅.一MG呈负 相关因此.结合病史检测尿NEP有助于诊断马兜 铃酸引起的慢性肾小管损伤I”】. 本研究中单纯肾小球疾病组尿NEP与正常对 照组无明显差异.可见在肾小球疾病尚未引起肾小 管病变时,尿NEP无变化.尿NEP与肾小管的损伤 是密切联系的,而与肾小球病变无关. 本研究还同时对两种检测尿NEP的方法进行 了比较.统计学分析发现,在各组中两种检查方法 结果均无差异.荧光法的符合率略高于ELISA法, 但经统计学检验其差异均无显着性.通过比较发 现.急性肾小管损伤组尿NAG与尿NEP的符合率 较高.因为尿NAG主要反映近端肾小管的急性损 伤,而尿仅MG在肾小管早期急性期损伤时尚无明 显增高.这也尿NEP可以较早地反映肾小管的 急性损伤;在慢性肾小管损伤组,尿仅MG与尿 278? NEP有较高的符合率,表明在尿ol广MG明显异常的 患者中,肾小管重吸收功能严重受损,其尿NEP也 多数低于正常.正是由于尿NEP在不同病程中出现 双向的变化,结合其他尿微量蛋白检测时,可以帮 助我们判断肾小管损伤处于急性期还是慢性期.从 而有助于对治疗方案的选择和对预后进行估计. 参考文献 1.TurnerAJ,IsaacRE,CoatesD.Theneptilysin(NEP)fam— ilyofzincmetalloendopeptidases:genomicsandfunction 【J].Bioessays,2001,23(3):26l一269. 2.TurnerAJ,BrownCD,CarsonJA,eta1.Theneprilysinfam— ilyinhealthanddisease[J].AdvExpMedBiol,2000,477: 229—240. 3.LiC,ChenG,GerardNP,eta1.Comparisonofthestruc tureandexpressionofthehumanandratneprilysin(en— dopeptidase24.11)一encodinggenes[J].Gene,1995.164(2): 363—366. 4.NortierJL,Deschodt—LanckmanMM,SimonS.eta1.Proxi— maltubularinjuryinChineseherbsnephropathy:Moni— totingbyneutralendopeptidaseenzymuria[J].KidneyInt, 293. 1997,51(1):288— 5.VlaskouD,HofmannW.GuderWG.eta1.Humanneutral JDiagnConceptsPract2003,Vo1.2,No.4 brushborderendopeptidaseEC3.4.24.1linutine.itsiso— lation,charactetisationandactivityinrenaldiseases【J]. 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