【doc】聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中的应用

【doc】聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中的应用 聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回 收在基因改变检测中的应用 中 Jo 国 urn 组 a 织 lo 工 fC 程 lin 研 ica 究 lR 与 e 临 ha 床 bil 康 ita 复 tive 第 Tiss 77 u 卷 eE 第 ngin 7嬲 eerin 2 g 0 R 07 e — se 0 a 1 r — c 0 h 7出 Ja 版 nuary2…007一.V.o1.”,N..O.1.,】 一 11, 一 等幡隶蠡聋0--0…?簟lll囊一;?-?0:0 聚合酶链反应一单链构象多态性银染后胶回收在 基因改变检测中的应用?. 王琦光,,郭志刚,赖文岩,朱鲜阳’ Applicationofpolyacrylamidegelreclamation8fterpolymerasechainreaction.singlestrand conformationpolymorphism?argentationinthedetectionofgenealteration Abstract AIM--ToinvestigatetheapplicationofpolyacrylamidegeI(PAGE)reclamationafterpolymerasechainreaction(PCR) . single-strandconformationpolymorphismrSSCP)-argentationinthedetectionofgenealteration. 1VEE”rHODS:TheexperimentwasconductedinthelaboratoryofDepartme nt’ofCardiology,NanfangHospitalfmm September2004toOctober2005.Thesampleswerederivedfrom123patientsthatwerediagnosedbycoronaryartery diseasefr0mtheDepartmentofCardiologyofNangfangHospitalbetweenSeptember2004andOctober2005.Theywere alIinaccordancawiththediagnosticcnteria0fWHOf0rcorollaryarterydiseaseanddiagnosedthrough electrocardiogram.echocardiOgramandCT.AIIthepatientswereinformedandagreedtotheexperiment.Thegenetic alterationofA8041geneinpatientswithcoronaryarterydiseasewasdetectedwithPCR-SSCP-argentation.Recoveryof PAGE.repeatedPCRandsequencingwereperformedinonecasewithsuspectofgenealteration. REsIJI:WhendetectingExon7of加 1genewithSSCP,asamplebandwithexitedabnormalwasfound,which wasdetectedwiththemethodofPAGEreclamationafterPCR-SSCP-argentationanddigestedwithrestrictionfragment lengthpolymorphismtodemorlstratethattherewasbasicradicalarerationinthiscaseandnon-denaturingPAGEwith argentationcouldbereclaimedsuccessfully. c0NCLUSION:Thenon-denaturingPAGEwithargentationcouldbe嗽 laimedafterPCR-SSCP-argentation.Themethod 0fPAGEreclamationafterPCR-SSCP-argentationcouldenhancetheaccuracyindetectingthegenealterationwithSSCP; moreover.thismethodismoreacceptablebyexperimenterasitsavirulent,Iowercostandsimplemanipulation. WangQG. conformation GuoZG.LaiWY.Zhu)(Y.Applicationofpolyacrylamidegelreclamationafterpolymerasechainreaction?singlestrand 11(1):29-32(China)[www.zglckf inthedetectionofgenaalteration.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiuyuLinchuangKangfu2007 ? 1/1k-29(ps).pdf] 摘要 目的:探讨聚合酶链反应一单链构象多态性银染后胶回收的在基因改变检测中的应用. 方法:实验于2004-09/2005—10在南方医院心内科实验室完成.样本来源:于2004-09/2005—08选择南方医院心内科收治的 冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)患者123例,均符合WHO冠心病诊断标准,并经心电图,超声心动图,CT确诊.患 者均知情同意.聚合酶链反应一单链构象多态性银染方法检测冠心病患者三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因改变,对t例怀疑 存在基因改变样本的聚丙烯酰胺凝胶采用银染后单链胶回收,以胶回收后的单链聚合酶链反应产物为重复聚合酶链反应 后进行测序. 结果:在对三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因Exon7进行单链构象多态性检测时,发现一样本泳带异常,对其样本进行银染 后胶回收,结合限制性内切酶酶切,证实此样本存在碱基改变,从而验证了非变性聚丙烯酰胺凝胶银染后胶回收的准确性和 可行性. 结论:经聚合酶链反应一单链构象多态性银染后的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶也可进行胶回收.聚合酶链反应一单链构象多态性 银染后胶回收在基因改变检测中可以增强单链构象多态性基因突 变检测的准确性,由于其无毒性,成本低及操作简单等优点, 更易被实验人员所接受. 关键词:聚合酶链反应一单链构象多态性;三磷酸腺苷结合盒转运体A1;基因改变;银染法;胶回收 王琦光.郭志刚.赖文岩.朱鲜阳.聚合酶链反应一单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中的应用【J1.中国组织工程研究与临床康复 2007.11(1):29-32[www.zglckf.com/zglckf/ejoumal/upfiles/07?1/1k-29( ps).pdf] 0引言 DNA样本采用银染后单链胶回收,以其胶回 收后单链聚合酶链反应产物为模板重复聚合 酶链反应后进行测序. 聚合酶链反应一单链构象多态性银染后胶—— 回收的方法是基因检测的重要方法【.但银染1材料和方法 后胶回收聚丙烯酰胺胶回收法的应用与研究 在国内报道较少.本文采用聚合酶链反应一单 链构象多态性银染方法检测冠状动脉粥样硬’ 化性心脏病(简称冠心病)患者三磷酸腺苷结 合盒转运体AI基因突变和单核苷酸多态性 过程中,对1例怀疑有基因变异的冠心病患者 沈阳12oo.邮政信箱110004kf23385083~na.oomw习咖 设计:开放性实验. 单位:解放军沈阳军区总医院先心病内科. 材料:实验于2004—09/2005—10在南方 医院心内科实验室完成.样本来源:于2004- 0912005~08选择南方医院心内科住院确诊的 ‘Departmentof CorlgenitalHeart Disease.GeneraI HospitalofShenyang MiIaryArea CommandofChin髓e PLA.Shenyang 110016.L|旧oning Province.China; =Departmentof Cardogy.Nan . ,, fang Hosp~alSouthen~ MedicaIUniversity. Guangzhou510515. Gu.. angdongProvince China 品吕越ScienceFoundationof China.No.30471929 ReceiVed:2006-09-04 Accepted:2006-10-19 ‘解放军沈阳军区总 医院先病内科.辽 宁省沈阳市 110016;南方医科 大学南方医院心内 聃氰蕉 510515 王琦光?,男,1974 年生,吉林省安图县 人,汉族.20O6年解 放军第一军医大学 毕业,硕士,主治医 师,主要从事先天性 心脏病诊断与介入 治疗厦辨膜病的诊 治研究. doctorqgwang@ yahoocom.cn 通讯作者:郭志刚, 副主任医师,博士, 南方医科大学南方 医院心内科.广东省 广州市510515 guodoctor@ hobnail.com 国家自然科学基金 资助(3o471929) 中圈分类号:R34 文献标识码:B 文章?号:1673-8225 (2007)01.00029-04 收稿日期:2OO6-O9-O4 修田日期:200睁10-19 (O6_50_9.6573?LL) 吨 一 ISSN1673—.8225CN21—.1539/R 王琦光.等.聚合酶链反应一单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中的应用wwwzg/dcf.com/d233~ifla.com 熟点资讯银巷冠心病患者123例,均符合WHO冠心病诊 釜主曼三爹盒篱断标准,并经心电图,超声心动图,CT确诊.链反应一单链构断标准,并经心电图,超声心动图,确诊. 羹粪薯孳蔷患者均知情同意.主要实验仪器:BiometraT1 羹蛊型聚合酶链反应仪(德国Promega公司);凝 差i胶分析系统一UVIPhoto—V?99/UVIBand—V?99 测结果.使该技术(美国);HX一1050恒温循环器(北京博医康实 望震霁集验器有限公司);Bi0一RadXll型垂直电泳槽, 喜蓑羹器薹蔷Bio-RadPowerPAC1000电泳仪(美国Bio一 套警翟盖Rad公司). 检测,肿瘤的突设计,实施,评估者:设计为第一作者,实 嘉盖着施为第一作者,评估为第二作者. 制,各种耐药基+ 因突变检测,微力法: 季奔DNA制备:取冠心病患者外周静脉血3mL, 李学研究等领域乙二胺四乙酸二钠抗凝,用基因组DNA提取 试剂盒(天为时代公司)提取基因组DNA. 聚合酶链反应及产物鉴定:引物由上海英 骏公司合成,聚合酶链反应体系25L,含提取 DNA1L,10xBuffer2.5L,Taq酶1.25U, 2.5mmol/LdNTP2L,10i.~mol/L上,下游 引物各1L.聚合酶链反应条件:95?预变性 120s;94?变性30S,60?退火60S,72?延 伸60S,共35个循环;72?终末延伸10min. 扩增产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳检测. 单链构象多态性银染法分析:以300g/L 聚丙烯酰胺贮存液配成80g/L非变性聚丙烯 酰凝胶.9L聚合酶链反应产物加入1L10× 碱变性液(50mmol/LNaOH,10mmol/L乙二 胺四乙酸),在室温变性10min后,再加入 LoadingBuffer10I-~L(O.5g/L溴酚蓝,0.5g/L 二甲苯青蓝,950g/L甲酰胺,0.5mol/L乙二 胺四乙酸二钠)于98?变性10min后4? 骤冷上样.4?恒温循环水条件下200V电泳 14h左右.以100g/L冰醋酸固定15min,去 离子水冲洗两三次,2g/L硝酸银染色15, 20min,去离子水冲洗两三次,再用30g/L 氢氧化钠(内含0.05g/L甲醛)显色至适度(信 号强,背景浅),结果照像并干胶保存. 银染后胶回收:对银染后泳动异常,怀疑 有基因变异的条带,可保留图像后进行胶回 收,选用DNA凝胶回试剂盒(Vitagene公司), 具体步骤如下:?将目的条带切割下来,装入 1.5mL的EP管中,加入50L双蒸水,置 人—3O?以下的冰箱中,冰冻30rain左右.? 将EP管中凝胶用上样枪头捣碎,加入四五倍凝 胶体积的DE—A溶液,再将EP管置入_30? 以下的冰箱中,冰冻60min左右.?取出EP 管在常温下解冻后,加入约0.5个EP管中液 体体积的DE—B溶液,并加入异丙醇至终浓 度为20%.?再将上述溶液转移至DNA制备 管(离心柱)中,10000r,min离心1min,弃滤 液.?将制备管置回离心管,加入W1溶液 0.5mL,10o00r,min离心1min,弃滤液.?以 同样的方法加入W2溶液0.7mL,10000r/min 离心1min,洗涤两次.?将制备管置回离心管 中,10000r/min离心2min,再将制备管置于 干净的1.5mL的离心管中,在DNA制备膜中 央加入10,15L(根据单链构象多态性条带 的长度及宽度决定)双蒸水,静置5min后,离 心2min,洗脱胶回收后的单链DNA.?再用 此聚合酶链反应产物的原上下游产物,取胶回 收后的单链DNA2L做模板,以相同的聚合 酶链反应条件,行50L体系聚合酶链反应, 琼脂糖凝胶验证后,送样本测序. 测序:样本送至上海英骏公司,使用377 测序仪采用4种ddNTPsDye—Terminators 法进行自动化测序.377型DNA测序仪采用 了美国应用生物系统公司专利的4种 ddNTPsDye—Terminators法,在同一反应管 中完成循环测序反应,然后将其产物在同一电 泳道中分离检测【. 酶切:CviAII酶切反应体系20L,含聚 合酶链反应产物10L,限制性内切酶CviAI1 0.5L,10xNEB缓冲液2L,去离子水7L. 置于25?恒温水浴中16h. 主要观察指标:观察样本的聚合酶链反 应一单链构象多态性在凝胶中是否存在泳带异 常,如存在,则对其进行测序,寻找是否存在变 异碱基位点. 2结果 在对三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因 Exon7进行单链构象多态性检测时,发现一 样本的泳带异常(图1),未行胶回收,直接将 样本的聚合酶链反应产物送至英骏公司测 序,结果为N,波形为双峰(图2),考虑 此样本可能存在基因改变,重复单链构象多 态性后切胶进行两条单链胶回收,重复聚合 酶链反应后,再行测序,结果将原碱基位置的 双峰分为两个单峰,一条链结果为A(图3), 另一条链结果为G(图4).于NCBl网站 Blast后,证实正常序列该位置碱基为A,而 P.0IB似t200,Sheny~g110004.Z3385083@sina.?mwww.zglckf.corn ISSN1673-8225C 翌N21-塑1塑539~R!三堕 . 壹塞兰壁墨婴:兰壁塑壁兰童兰堡墨重量壁堕至至墨蔓堡型!堕 G则为基因变异 营耋嚣落簧静不同电旗条带’B.j碑聩瞎 警盖 性,因而在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳蓑蓍;荤耋譬 时迁移率的不同来舒折DNA单链中的基因突嚣毒 变.称之为”单链构象多态性”其基本原理是T腔,挺 将聚合酶链反应扩增的双链DNA经解链变为萎过巷 单链DNA后,在不含变性剂的中性聚丙烯酰耋警 胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与誊等 DNA单链自身折叠所形成的构象这种构象山孟薹 DNA单链碱基顺序决定.其稳定性靠分子I匈局囊繁 部顺序的相互作用(主要足氯键)来维持相同接童 【乇度的DNA单链因其顺序不同,甚至单个碱 基不同,所形成的构象不同因而电泳迁移率 不同..当靶DNA中发生单碱基置换或碱幕插 入,缺失等改变时.由于迁移率变化会出现泳 动变位.从『fli提示该片段存在有基因突变. r1郝4避洋木在冈藿异.啄f壤音醇链厦直产物杖膊埘幅条 T兽岍M=Marker=榭l~6戳A机1嚣 图5=嚼砬腺苷蛄舍童转运伴基因Exon7烃Cv/AI1 限制性酶毛口电l泳 精晰指甚政壁啦堆他点.站果撖告为G 昙毒链毫要辱蔷道样丰中弟.条莹链艘回牧重复聚 经CviA?限制傩内切酶酶切(AA基因 型可完全切开,AG基型部分切开,GG基因 型不能}刀开),琼脂糖凝胶验证,既进一步证实 此样本存在碱基改变,同时也进一步证实了非 变性聚丙烯酰胺凝胶银染后腔回收的准确性 和可行性(图5),该样本既可见原位聚合酶链 反应产物条带,叉可见酶切后产物条带.证明 为AG基因型,存在G碱基的改变,而对照样 本均被切开,无原位聚合酶链反应产物条带. 证明为AA基凶型.无G碱基改变., 3讨论 聚合酶链反应一单链掏象多态性技术是 此1200岐许110004kf23385083@sinaCOrnWWWzglckf.com Aimsworth等成功地把银染技术用于 聚台酶链反应一单链构象多态性分析,使萁县 有r操作简便,灵敏度高,成本较低等特点, 且所需标本量少.能在24hI得到检测结 果,使该技术的应用得到很快发展,并越来越 多地被应用于遗传性疾病的基因定位,突变 和单核苷酸多态性的检测.肿瘤的突变基因 筛选以及细菌的耐药机制.各种耐药基因突 变检测,微生物的分类鉴定研究,分子流行病 学研究等领域中【 但由于银染方法需靠肉眼观察电泳结果,同评舯史幸 判断带与带之问以及在不J司凝胶上的泳动差为应甩l技木方法 异.可靠性较低,同时银染法的重复性也不甚窆-葺董誓 理想,使许多第一次经单链构象多态性检测出要耋鉴 来的存有变异基因条带因其难以重复.或测序昱慧笔釜 过程中琼脂糖胶回收条带的选择.错过了基因.井稃自T 突变的检测,国内外虽有许多学者提出了改良篓蓦主蓑 方法,但仍不能完全纠正其缺点[B_.薹制披 31 壬琦光,等聚合酶链反应一单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中的应用 ISSN1673—8225CN21—153c虾t ?’fc0mkf2~na.com 曾有人用溴化乙锭或SYBRgreenI染色后进行 单链构象多态性变异条带胶回收以增强单链构象多态 性基因突变检测的准确性.与琼脂糖凝胶不同,聚丙烯 酰胺凝胶灌制时不能加入溴化乙锭,因为此染料会影 响丙烯酰胺的聚合.然而,电泳后可用溴化乙锭进行聚 greenI染色后胶回收相比,增加了染色的敏感度,避 免了实验人员与毒性物质接触,减少了有毒物质对环 境的污染,降低了成本,操作简单等优点,易被实验人 员所接受. 丙烯酰胺凝胶的染色.由子聚丙烯酰胺会猝灭溴化乙4参考文献 锭的荧光,所以检侧DNA的灵敏度降低.此外,溴化 乙锭对单链核酸的亲和力相对较小,所以其荧光产率’ 也相对较低,也使其检测单链构象多态性的敏感度进2 一 步下降,不能检出少于10ng左右的DNA条带,而 银染则能检出少于10ng的DNA条带.核酸染料 SYBRGreenI也不能在聚丙烯酰胺凝胶聚合过程中 掺入到凝胶中,这样会妨碍DNA的迁移并使DNA条4 带变形【1切.虽然其对DNA的检测较溴化乙锭灵敏205 倍以上,但由于其价格昂贵,与溴化乙锭相同也有毒 性,以及操作复杂等缺点,在实践应用受到一定的限. ., 制. 本文证实了银染后的非变性聚丙烯酰胺凝胶也 可以进行胶回收.银染后聚丙烯酰胺胶回收法的应用 在国内尚未见报道.本实验采用了此方法,验证了本9 方法既能增强单链构象多态性基因突变检测的准确lO 性,又简化了胶回收操作过程.与溴化乙锭和SYBR HonoreN.ColeST.Molecularbasisofri怡rnpinresistancein Mycobactedumleprae.AntimicrobAgentsChemother1993;37(3):414-418 GuoZ,InazuA.YuW.ata1.Doubledeletionsandmissensemutationsin thefirstnucleotJde-bindingfoIdoftheATP.bindingCassettetransporter A1fABCA1)geneinJapanesepatientswithTangierdisease.JHum Genet2002:47(6):325-329 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