慢呼抗口服液中黄芩苷及绿原酸在鸡体内药代动力学研究（可编辑）

慢呼抗口服液中黄芩苷及绿原酸在鸡体内药代动力学研究（可编辑） 慢呼抗口服液中黄芩苷及绿原酸在鸡体内药代动力学 研究 : : . /: : :.: : : : 目 录 目 录 摘要? 英文摘要?.. 引言??. .鸡毒支原体病的最新研究进展? ..鸡毒支原体病的流行现状?。. ..鸡毒支原体病的诊断方法?.. ..中药治疗鸡毒支原体病的优点 ..鸡毒支原体病的经济影响?.. .慢呼抗口服液的理论基础??.. ..慢呼抗口服液简介?. ..慢呼抗口服液主要化学成分概述?一 .药代动力学的研究进展.. ..中药药代动力学研究进展?.. ..黄芩苷药代动力学研究进展,. ..绿原酸药代动力学研究进展一 ..药物代谢动力学在药理学研究中的应用.黄芩苷及绿原酸的检测方法研究 进展? ..黄芩苷的检测方法?. ..绿原酸的检测方法?. .生物利用度的研究进展 ..生物利用度概述..生物利用度的评定? ..影响生物利用度的因素..提高生物利用度的方法.本试验研究目的和意义 .与方法??. .材料. ..药品与试剂.. ..试验仪器与设备?:.. .方法. ..同时检测黄芩苷及绿原酸色谱条件的确立. ..内标物的选择 ..血浆样品处理东北农业大学农学硕.学位论文 ..血浆样品处理方法学考察? ..动物试验..数据处理 ..绝对生物利用度的计算.结果与??. .血浆样品提取方法的优化.黄芩苷检测方法的方法学验证数据?.. ..标准曲线的建立??. ..专属性考察?一..精密度及准确度试验 ..稳定性试验.. ..方法检出限及定量限试验? .绿原酸检测方法的方法学验证数据?.. ..标准曲线的制备..专属性考察?. ..精密度和准确度试验 ..稳定性试验.. ..方法检出限及定量限试验? .慢呼抗口服液的药动学研究?. ..慢呼抗口服液在鸡体内血药浓度及药时曲线??. ..药动学参数.. .生物利用度的计算..中药复方中黄芩苷的生物利用度? ..中药复方中绿原酸的生物利用度? .讨论?一 . 检测方法的建立.. ..色谱条件的优选..内标物的选择 ..血浆样品处理方法优化.中药复方慢呼抗在鸡体内药动力学特征??.. ..慢呼抗口服液中黄芩营的药动学特性??. ..慢呼抗口服液中绿原酸的药动学特性??. ..慢呼抗口服液的绝对生物利用度? .结论?. 致谢 参考文献??, 目 录 攻读硕士学位期间发表的学术论 文....?.??.??............................?.........?..........,....。 ?..?...........?...............?.?...?.....:??. . ............?。.............. ...........,.................................,........... ...................................................... .. ..................... .. .................................?........... . .........,..........,,..........,...........,,........... .. ........?................................................... .. .。..。.。。........,.....。。..。。. ............................................................................................. .。 ................................................,............ .. ................:.....?.?..........?....?.......?................ .. ........................,..................................... ..??.. . ...,...。...... .....................................?........................?..... .. ?.......?..........?...?.?.........?..........。...?........ 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?...............?...............?..............: .............................,................................... ...........,.................................... .??.?.?..??..?.?.??.?. ................................................................ 研究生学位论文独创声咧和使用授权书 声 明 独 创 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成 果。掘我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人 已 经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得 洼麴逡直墓丝孟蔓缱型壹塑笪奎拦要窒.或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 年孑月易日 日期: 学位论文作者签名:烈寸赵 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适 用本授权书 学位论文作者签名: 日期:弘年月石日 西博 签 名: 期:少哆年万月/日 导 师摘要 摘 要 鸡毒支原体病是近年来危害养鸡产业的重要传染病之一,该病病程长,复发 率高。目前, 国内外对该病主要采用抗生素治疗,但抗生素的大量使用,易导致病原的耐药性逐渐增加。 同时,国际残留限量的使抗生素的应用受到了相应的限制。中草药因其独特的优势,越 来越受到“人学者的青睐。慢砰抗口服液是用于治疗鸡毒支原体病的纯中兽药制剂,方剂配 伍、:艺优选、体外治疗及药物化学基础等研究表明,该药具有很好的抗鸡毒支原体病的疗 效。冈此,本试验将开展慢呼抗口服液在鸡体内血浆药物代谢动力学特性的研究以进一步完 善该药物的体内试验,为临床应用奠定基础。 首先建立鸡血浆中复方慢呼抗口服液主要成分黄芩菅和绿原酸含量测定的高效液相色谱 法法。选择流动相为乙腈一%冰醋酸,梯度洗脱 ,黄芩茁和绿原酸的检测波 、 分别为 ,流速 /。黄芩营及绿原酸相应同归方样分别为:. .,.:,. .,.。黄芩苷及绿原酸最低检测限分别为. /,. ./。结果选刖甲醇乙腈混合溶剂蛋白沉淀法处理血浆,黄芩苷及绿原酸血浆 样品提取同收率分别为.%署 .%。方法专属性好,灵敏度高,准确可靠,已成功应用 丁.海兰鸡口服及静注慢呼抗口服液后血浆中黄芩苷和绿原酸的药代动力学研究。 将只海兰鸡随机分成组,分别为.、、‖三个剂量灌胃组, /注射组及 、.、.、.、、.、、、、、、 对照组。分别丁.给约前 和给药后. 采集并分离得到血浆样品,根据所建立的方法测定黄芩苷和绿原酸的血药浓度,通过 药动学软件计算相应的药动学参数,通过比较口服液不同浓度的黄芩营与绿原酸药动学 参数及相对生物利用皮,探讨其在鸡体内的药动学特征,为指导临合理用药,减少药物不良 反应,确保药物安全以及为慢呼抗口服液提供可靠的理论依据及临床数据。本实验将海兰鸡 口服不同剂量的慢呼抗口服液后体内的黄芩营及绿原酸的主要药动学参数如达峰浓度、达峰 时间、约.时曲线卜.面积和消除半衰期等药代动力学数据进行比较分析。结果表明,.、、 .、, .、 /二个剂量给药后黄芩苷主要药动学参数分别为:么%删为, .、. .、. . . . ‖;,分 /?:。。。分别为. . .、. .、. 别为. ;.、、‖三个剂量给药后绿原酸主 .、. .、. . /.;。 要药动学参数分别为:。为. 、 .、. . .、. 分别为. /;/:分别为.士.、. .土. ; /静脉注射给药组黄芩苷和绿原酸主要药动学参数分别为:.叫为: .、. . 。慢呼抗服 .、. . . /.:/:分别为. 液中黄芩茁和绿原酸在鸡体内的绝对生物利用度分别为.%.%和.%.%。 慢呼抗服液中黄芩茁在鸡体内分布较厂、‘,消除较慢,有效的血药浓度维持 时间较长。 慢呼抗口服液中绿原酸在鸡体具有吸收较好、血药浓度较高、消除较慢的动 力学特征。 关键词黄芩茁:绿原酸;血药动力学:高效液相色谱法; , ,. , , . , , . ,.,. .,, ., , , . , , , .一% , , ./. :. .,.;. .. ... /. ? ./,.. . .% .%. ,东北农业大学农学硕士学位论文 . .、、 /,. ,. ,.,.,.,,.,,,,, , . , , , , ..、、 / : . . .。 .,.士.,. /?; . . . . .,. . ./;,,: .,. . 士. : : . .. .士. . ., .士 /?,、 . .,. .,. /;“ .士.,. . .土 .; / . . . ., ,.。 /?,; . ..士. . / .%士.% .%士 .%,. , , ,. , : ;; ;; : : : 引 言 引 言 支原体是目前发现的最小的无细胞壁单细胞原核生物,仅由一层胞浆包裹。 支原体.泛 存在丁人、多种动植物及昆虫体内,对能影响细胞壁合成的抗生素有抵抗作 川。随着各国学 者对支原体的深入研究,鸡毒支原体 ,受到大家应有的重视。 疾病的产生是不可避免的,我们针对必须认真对待。首先要以预防为主,然而 菌株的变 异常常导致疫苗免疫的失败,因此,治疗作用刻不容缓。在我国,中医承载着五千年的光辉 历史,有着深厚的文化底蕴,中药的开发与利用在我国当代以及世界得到充分的支持与发展。 中药复方药物动力学研究对丁阐明中药复方的组方原理、作用机制,促进临床合理用药 等都具有十分重要的意义,冈而备受关注。本文现从鸡毒支原体病的研究进展、慢呼抗口服 液的理论基础、约代动力学、检测方法及生物利用度等方面进行概述。 .鸡毒支原体病的最新研究进展 是一种缺乏细胞肇的革兰氏阴性菌,具有一般支原体形态特征,主要引起鸡呼吸道 症状为主的慢性呼吸道病 ,现已分布于世界各国】。近年来已 成为危害养鸡业生产的重要传染病之一。临床上以异常呼吸音、咳嗽、流鼻液、呼吸困 难等为主要特征。病鸡和带菌鸡是本病的传染源,主要经飞沫、污染的饲料、饮水和蛋传播, 各种年龄的鸡均可感染。临床警慢性经过,且病程长,常与其他病原混合感染,导致病鸡呼吸 道症状加剧,死亡率增高;并由丁.感染鸡生长发育受阻,胴体的残次品废弃率提高,产蛋率 降低,给养鸡业造成严重威胁?。 ..鸡毒支原体病的流行现状 予世纪年代首次发现了】。根据相关文献报道,我国鸡群的感染阳 性率约为%以上【。鸡群感染后,雏鸡弱雏率将增%左右、蛋鸡产蛋率下降‰%, 肉鸡体重减少%,饲料转化率降低%】。因此,感染后对养殖户经济产生相当巨大 的影响。发病鸡群以及隐性感染的携带病毒正常鸡群是本病的主要传染源,病原体存在于病 鸡和带菌鸡的呼吸道、卵巢、输卵管和精液中。因此,本病除了可以水平传播又能垂直传播 】。研究者在深入研究传播途径的过程中发现通过空气中的尘埃或飞洙途经呼吸道感染、 同时也可经被污染的饲料及饮水由消化道感染【】。带菌鸡胚可垂直传播给后代,公鸡可通过 交配将疾病传给母鸡或者后代,鸡胚通过市场流通至各个地区,可使疾病在全国呈多发显现。 根据疾病的流行性较为广泛以及疾病的传播途径可知,鸡群一旦染病便很难彻底根除。在垂 直传橘研究中,研究者发现最重要的传播途径是经卵传播,感染初期以及感染导致 病程时间、症状较为严重的鸡群经卵的传播率居高不下,因此,感染后经过垂直传播 导致本病的不断流行。的感染在不同的季节感染率有所不同,寒冬及初春季 诲较为多发,东北农业大学农学硕士学位论文 ~月为多发期。本病可感染鸡和火鸡,且各种年龄段的鸡均易感,~周龄雏鸡最为严重【引。 ..鸡毒支原体病的诊断方法 感染根据病理变化及临床症状特征可进行初步诊断。在临床上应注意和禽流感、传 染性鼻炎、传染性支气管炎、黏膜型鸡痘以及维生素缺乏症等其他疾病相区别。通过传播途 径可知,呼吸道及输卵管病变会产生相应临床病理变化,单纯感染的病鸡,鼻孔、鼻窦、 气管和肺出现比较多的黏性液体或卡他性分泌物,气管壁轻度水肿。随着感染程度的加深, 气囊逐渐浑浊,气囊肇出现干酪样渗出物,开始如珠状,严重时成堆成块状。现实中的感染 多为混合感染,如伴有人肠杆菌、传染性喉气管炎、传染性支气管炎、鼻窦炎等混合感染, 有时可见纤维索性肝周炎和心包炎与混感。组织学变化比较特殊,由于单核细胞浸润及 黏液腺的增生而使病变组织黏膜显著增厚,黏膜下常见淋巴细胞、网状细胞和浆细胞浸润。 呼吸道的组织损伤表现为纤毛上皮的肥人、增生和不同程度的水肿。在肺部除了肺炎和淋巴 滤泡反应外,有时还出现肉芽肿?。 的分离鉴定是诊断本病的可靠方法,但操作较复杂。在实验室中,由于病原分离较难 实现,所以血.清学方法是临床诊断支原体病应用最普遍的方法,由于操作简便,更适合于群 体检测【。血清学方法分为:囱.清平板凝集试验、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试 验、微鼙免疫荧光等试验方法。是目前应用最广泛的群体检测方法之一,该方法 操作简单、易观察、重复性较好,可用丁.早期诊断。但存在非特异性反应和交叉反应?,即 可能显现假卧陛反应。具有特异性好、准确性高等优点,相对来说是目前比较可靠的检测 感染的方法但敏感性较差,常用于检测诊断的特异性。法较敏感性稍 低,但特异性较强,为以后更多的试验方法奠定了方法学基础。微量免疫荧光法特异 性高,可用于分类鉴定等相关检测项目。 生化及分子生物学方法也是检测感染的有效方法,包括十二烷基磺酸钠.聚丙烯酰胺 凝胶电泳.法、限制性核酸内切酶分析法、核酸探针法、聚合酶链式反应 等,在检测感染中起到重要作用。 ..中药治疗鸡毒支原体病的优点 通过感染病鸡的病理变化我们可以看出,肺组织的病变、坏死及咳喘等症状是邪实 的表现。饲养环境恶化、管理不善、抵抗力降低,导致机体正气受损,据此本病应属虚证范 畴,综上,本证属正虚邪实,故戍扶正祛邪,以补肺润肺以扶正,平喘化痰、清热解毒以祛 邪。 中药是取白火白然的天然物质,完整保留了自然结构及生物学活性,中药属于纯天然药 物,其中含有多糖苜类、低聚糖、生物碱、酶类、有机醇、鞣质、多酚类色素和挥发油等活 性成,并且含有淀粉、蛋自质、氨基酸、纤维素、脂肪、维生素等营养成分,在治疗鸡毒支 原体病方面有着独特的优势引。中药目前以 复方组合方剂的形式给药,每种中药会含有多 引 言 种成分,针对疾病以及预防方式的不同,我们可以发现中药的不同作用,其中营养、调节、 抗应激、抗病原体、增强免疫等作用不容忽视。 抗生素治疗感染,易产生耐药性,而中药成分复杂和多靶点的作用机理,使细菌不 易产生耐药性。因为中药防治主要是通过扶正去邪,调整阴阳,增强动物免疫 力为主,当免 疫细胞大量吞噬病原体后,使机体恢复阴刚平衡而达到药到病除的目的引。 对于抗生素和化学合成药物来讲,中药成分均为生物体有机物,其毒副作用小的这个巨 火的特点是中药发展的优势,感染后,病鸡精神状态不佳,抵抗力减弱,进食及饮水都 会收到影响,因此,毒副作用的产生对病鸡的治愈会产生一定影响,所以,中药得天独厚的 优势可见一斑。故研发中药治疗感染具有很好的应用价值和良好的市场前景。 ..鸡毒支原体病的经济影响 鸡毒支原体病不仅影响鸡群的健康,并且在短期内给养殖户经济造成严重破坏。其中产 蟹量、成活率、饲料转化率、医药费以及相应管理成本的降低都严重威胁了养殖户的收益。 。欧洲及亚洲南美洲 感染呈现全球分布,目前已经成为危害全球养鸡业重大疾病之一【 等发达国家、发展中国家及小部分不发达国家都报道过有关感染的相关信息。美国鸡群 感染的鸡群也呈逐年增加的趋势。 由于抗生素的滥用以及饲养环境的破坏,导致与其他病毒如新城疫病毒、 传染性支气管炎、传染性囊病病毒、传染性喉气管炎、大肠杆菌等 病毒混合感染。这会鸡群病情,增加死亡率。因此,医疗费是不可忽视的经济支出,死 亡率的增加也导致出栏率的降低,从而影响经济效益。 然而对于蛋鸡来说,产蛋数量、开产时间、蛋重等指标尤为重要,从每项生产指标来看, 似乎差距不太明显,但从各个生产指标综合考虑,即综合经济来看不同水平所造成的差异巨 人。在实际生产中,尤其是小规模的个体饲养户,总认为自己的条件不够,没有信心去提高 自己的养殖水平。然而养殖户可以从以下两方砸即提高饲料营养水平及提高饲养管理环境来 增加经济效益,持之以恒才能取得乐观的利润。 .慢呼抗口服液的理论基础 ..慢呼抗口服液简介 慢呼抗口服液是由黄芩、金银花、百部、紫菀和甘草等纯中药组成的中药复方制剂。主 要用于治疗感染所引起的气短、咳嗽、气喘等慢性呼吸道疾病。已有大量研究员对慢呼 抗口服液药效学、最小抑菌浓度、体外实验、、质量控制等方面进行深入研究。 鲁成武等对慢呼抗口服液的急性毒性和长期毒性进行研究,试验采用灌胃给药,测定慢 给药后,大鼠体重、采食量、血液生化指标、 呼抗口服液的急性毒性和最大耐受量,经过 病理变化等与对照组比较均无明显差异,表明慢呼抗口服液的安全性良好引。该研究员对慢 东北农业大学农学硕士学位论文 呼抗服液最小抑菌浓度的研究结果表明,灌胃剂量为. /时,会对鸡毒支原体产 生抑制作用。镇咳试验显示慢呼抗口服液可延长小鼠对引起咳嗽的潜伏期。化痰试验显 示慢呼抗口服液能显著增加气管酚红排泌量。平喘试验显示慢呼抗口服液能明显延长豚鼠引 喘的潜伏期。抗炎试验显示慢呼抗臼服液对二甲苯所致小鼠耳壳炎症也具有明显的抑制作。 降温试验显示降低由酵母所致的大鼠体温升高。通过试验可以表明慢呼抗口服液具有良好的 镇咳、化痰、平喘、抗炎、解热作用。石乔等对药效学迸一步研究,结果表明复方中金银 花的作用最为明显引。 李继昌等对慢呼抗口服液的治疗试验研究显示当药物浓度为.%、.%时,连续给约 天,可明显改善发病鸡群的疫情,显著减小血清抗体反应阳性率,降低气囊损伤率,该药的 治愈率达%左右,有效率达到%以上,增重率分别为.%及.%训。李继吕等采 用法,单独检测了复方中的黄芩营含量,为质量控制提供参考基础 。潘晓影及陈春 丽对慢呼抗口服液艺及质量控制等方面进行研究,筛选出最佳提取.:艺及黄芩营、绿原酸 的检测方法【?。盛尊来等对慢呼抗口服液的药效物质基础及质量控制方法进行研究,构建了 慢呼抗口服液的体外指纹图谱,并用同样的色谱条件建立了血清指纹图谱,通过体外指纹图 谱与血清指纹图谱比对,确立了慢呼抗体内作用的物质基础,为慢呼抗口服液的深入研究作 。 出了贡献【 ..慢呼抗口服液主要化学成分概述 慢呼抗口服液由五种中药成分组成,由于慢呼抗口服液中黄芩为复方中君药,而金银花 药效作用又十分显著,因此我们把黄芩及金银花作为慢呼抗口服液的重点研究对象。黄芩 是唇形科植物黄芩 的干燥根。始载于《神农本 草经》列为中品。在历代本草中均划属清热解毒药,性寒,味苦,归肺、胆、脾、大肠、小 肠经,具有清热燥湿、泻火解毒,止血,安胎的功效引。 黄芩中化学成分主要为黄酮类成分,此外还含有挥发油、苯乙醇苷类、甾醇、氨基酸、 生物碱和微量元素等,但种类最多、生物活性最显著的是黄酮类化合物【引。黄芩苷 。 是黄芩中具有抗菌作用的主要有效成分,是黄芩素位羟基与葡萄糖醛酸结合而成的苷 金银花 。的干燥花 为忍冬科植物忍冬蕾或带初开的花 ,又名双花。作为历史悠久的中国传统中药之一,金银花具有有清热解毒, ?散风热之功效。几千年传统医学、现代药理实验及临床应用显示金银花对多种致病菌有较 强的抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝、止血、抗氧化等多种药理作用?。金银花含有挥发 油类、机酸类、黄酮类、三萜类、环烯醚萜类化合物、醇类、微量元素等成分。侯冬岩等从 金银花挥发油中分离并确定出种化学成分,其中主要成分为酸类化合物,占挥发油总量的 。%,另外,酮类化合物占。%,醇类化合物占.%,萜类化合物占.%,萜类 氧化物占.%,醛类化合物占.%,烷烃化合物占.%,共占金银花中挥发油总量的 .%引。王国亮等从河南栽培金银花千花蕾挥发油中共绿原酸类化合物是金银花的主要有 引 言 效成分,包括绿原酸和异绿原酸】。黄雄等采用高效液相 色谱法同时证明了不同种金银花中含有多种黄酮类成分】。 .药代动力学的研究进展 药物代谢动力学也称“药动学”、“药代动力学”等,是应用动力学 的原理与数学处理方法,定量地描述药物通过各种给药途径进入机体后的吸收、分布、代谢 和排泄等过程的动态变化规律,即研究给药后药物在体内的位置、数量、疗效与时间之问的 关系】。其中“代谢”含义包括了药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄。药物动力学是一 门新兴的介于药学与数学之间的边缘学科,目前已成为生物制药、临床药学、药理学、分子 药理学、毒理学、药剂学、病理学、生物化学等学科的基础【,并与之紧密结合促进了这些 学科的蓬勃发展。 ..中药药代动力学研究进展 中药药代动力学是近几十年来迅速发展起来的以中医药基本理论为指导,用药物动力学 方法研究中药在动物或人体内的吸收、分布、代谢和消除过程的一、新兴边缘学科,目前已 有大量关于中药药代动力学的报道,现研究方向主要有体内药物浓度法和生 物效应法及其他 方法。血药浓度法【】是研究药代动力学的经典方法之一,也是较为普及的方法,常被一些学 者广泛应用。本试验也是通过该方法进行的慢呼抗口服液药代动力学研究。 目前,由于中药复方中成分较为复杂、检测方法难度大,所以针对中药复方的药代动力 学研究较少,许多中药到目前为止其有效成分和作用机制还不是很清楚,加之中药中的一些 有效成分含量很少,并且还有不少结构相似的类似物,无论复方还是单方都是个复杂的系统, 药物中多种成分相互拮抗和协同作用都有待深入研究。随着科技水平的提高及对研究者对 中药的关注和投入,中药药动学研究将会有更大的发展空间,同时对药代动力学的重视也促 进与丰富了中药的整体观。 今后,我们可以从以下几方面深入研讨。首先要研究中药复方成分,对于单味中药来说, 成分较为简单,而多味中药组成的复方,成分较为复杂。其次我们除了注重药物本身外,还 要重点研究检测方法,提高灵敏度,使试验结果更加有效、准确,为临床用药提供依据。再 次,中药讲究的是整体观,我们要对中药化学成分有整体观的概念,深入研究 作用机制。在 这个基础上发扬中药的优点,期待中药能在世界的舞台上发扬光大。 ..黄芩苷药代动力学研究进展 黄芩早在《神农本草经》中就有详细记载,在我国分布‘泛,适应性强.冈此产量较高 。黄芩苷是黄芩中黄酮中含量较高的成分,也是黄芩及其制剂的主要质量控制指标,同时 也是服药后体内浓度的控制指标,因此近几年来研究者对黄芩菅的研究较为深入。在对黄芩 东北农业大学农学帧士学位论文 苷药代动力学研究中,药理的作用机理及代谢过程对于指导新药设计与合成、增强药物疗效、 用药安全以及科学地制定药物质量标准均具有重要意义。 高荣等 比较银黄注射液和银黄口服液中黄芩苷在大鼠体内的的药物动力学特征。结果 显示,火鼠静脉注射银黄注射液后,血浆中能够检测出黄芩苷,其中黄芩苷的药.时曲线变化 警二室开放模型;大鼠口服银黄口服液后,而黄芩苷的药.时曲线呈多峰现象,其绝对生物利 用度为 .%。因此,不同的给药途径,黄芩苷在大鼠体内所表现的药物动力学特征相差很 火。邢杰等?采用//全扫描二级质谱方式,测定了大鼠血浆、胆汁、尿样 和粪便中黄芩苷及其代谢产物的含量。结果表明黄芩苷在口服吸收过程中经历了强的首过代 谢,黄芩营在小肠不被吸收,肝肠循环在黄芩苷的体内代谢过程中占有重要地位,肝消除也 不影响黄芩营的吸收入体循环的过程。 毛风斐等驯通过柱层析分离法,采用紫外分光光度计,对累积尿药数据进行处理,研究 黄芩茁口服及肌注后在人体内吸收消除情况。结果表明,药物通过肌注比口服吸收及消除更 快,生物利刚度高。从不同给约方式的肾排泄率可以看出,黄芩苷是对肝脏直接起作用而发 挥药效。张志荣等圳采刚反相高效液相色谱法测定口服单剂量银黄冲剂黄芩苷在家兔体内代 , 谢动力学规律。结果显示黄芩营的药一时曲线呈多峰现象,其,。。。分别为.、、、 其绝对生物利用度为 .%,通过药代动力学参数可以看出,黄芩苷在家兔体呈二室开放模 型分布,与毛风斐等 得出的黄琴营单一成分给药的代谢规律大致相同。由此可以看出,黄 芩营在体内代谢基本上不受复方制剂中其它组分的影响,并且黄芩苷在体内有一定的积累作 用。 何心等采用高效液相色谱法,以电化学方法测定黄芩苷在大鼠体内的药动学参数。结 ,. 果表明黄芩苷在大鼠体内掣二窒模耍分布,其药动学参数为%. /,. /,. /,. /,,,. //,胪. ‖/,彳嬲. .//。由 此可见,黄芩苷在大鼠体内代谢消除极快,生物半衰期只有. 。小桥恭一等【?,对黄芩 苷在消化道内的吸收进行研究,结果表明黄芩苷在消化道内很难被直接吸收,而经过肠内微 生物水解成其苷元黄芩素。车庆明纠对黄芩苷的药物代谢产物进行研究,从口服 黄芩菅的人尿液中,发现并鉴定了二个主要代谢产物的化学结构,结果表明黄芩苷苷元是主 要药物代谢产物的中间体,他们在体内共存,构成黄芩苷的药效。 李新中等研究了黄芩苷在家兔获得脑水肿前后,体内药代动力学参数的变化。测定方 法采用法,实验表明:黄芩苷进入家兔体内后,快速分布,代谢过程符合二室模型, 分布相半衰期为数十分钟,消除半衰期为 ,家兔经百日咳菌液感染而获得脑水肿模型后, 其身体正常机能遭到破坏,血.液流变学发生改变,对黄芩营在家兔体内的分布,代谢产生一 定的影响。 从以上研究者对药代动力学的研究我们可以看出,通常动物试验以大鼠、兔、犬较为常 见为常用,给药途径一般为单剂晕给药,其中以口服灌胃、静脉注射、灌肠居多。检测方法 多为液相色谱法、分光光度法、液相色谱与质谱仪串联法等等,主要通过血药浓度法、尿药 排泄数据法进行研究,并且不同的给药方式会导致药物吸收及代谢的不同。 引 言 ..绿原酸药代动力学研究进展 。绿原酸 绿原酸 又名咖啡鞣酸,是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸 在全国分布比较广泛、抗氧化作用强,是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种 苯丙素类化合物引。绿原酸药动学研究的常用方法主要是血药浓度法、尿药排泄数据法。 血药浓度法是药动学研究的经典方法,其原理是利用绿原酸在血中的浓度与其药理效应 大体呈平行关系,测定给药后体内的血药浓度,使用药代动力学软件,建立药动学模型,计 算药动学参数,了解绿原酸在体内的变化规律。尿药排泄数据法是通过测定尿液中绿原酸的 累积量,研究绿原酸在体内的经时过程。获得的药动学参数较少,是对血药浓度法的补充。 根据研究动物或试验结果需求的不同我们选择合适的方法进行研究。在血药浓度法研究中, 血浆处理方法是决定试验成果的基础,除蛋白的过程对结果及液相色谱柱影响极大,因此, 研究者对除蛋白过程深入研究发现,加入有机溶剂,如乙腈、甲醇除蛋白效果较好。加入强 酸,例如%三氯乙酸、高氯酸等进行蛋白沉淀,同样能达到一定效果。郑春英 采用改良 水浴法,在血样中加入%甲醇除蛋白后,用热水浴法破坏血样中内源性物质对检测成分的 干扰,水浴避免温度过高,过高易导致绿原酸受热分解。 胡樱等 比较了大鼠尾静脉注射绿原酸和含等剂量绿原酸的双黄连粉针剂后发现,单用 和复方绿原酸在大鼠体内的主要药动学参数。卅、、呦都有显著差异,而,则不 存在显著差异。表明复方和单用绿原酸在大鼠体内的药动学差异并不产生于 其消除过程,而 是其分布过程。因此,血浆蛋白结合率以及转运蛋白的改变等原因可能造成双黄连粉针剂中 的绿原酸的清除率减小,血药浓度增大。梅林等”用测定金银花中绿原酸在豚鼠中的 药代动力学。结果显示,金银花中绿原酸在豚鼠体内的吸收呈二室模型分布。其药代动力学 ,. 参数是. ,./,. /,. /,/. ‖/,. //,. ?/。结论:金银花在体内 时吸收最强。陈敏】用 分析方法,比较了金银花三种注射液中绿原酸在家兔体内的药动学差异。健康家兔肌注金银 花单提注射液,金银花、连翘混合提取注射液,金银花、连翘单提合并注射液后, 绿原酸在家兔体内的药动学过程均符合一级吸收二室模型。表明金银花配伍连翘后能促进绿 原酸在体内吸收分布,迅速达到血峰浓度,对消除半衰期的影响不大。与中绿原 酸的药动学参数差异不显著,表明连翘与金银花配伍时,不管是混提还是单提后合并,对绿 原酸在家兔体内的药动学特征无明显影响。 大部分文献报道的绿原酸总体水平模型多为二室开放模型也有一些报道绿原酸的体 内代谢水平符合三室开放模型??,由于动物种属的差异性以及药物间的协同与拮抗作用的不 同导致结果的差异。除了以上两点,我们还需注意试验人员仪器操作及实验规范性,避免误 差的出现。 绿原酸的药动学研究方法局限性很高,如鸡体内的药代动力学研究方法尿液很难收集, 因此,只能采用血药浓度法。所以,我们要不断创新,建立学科与学科之间的关系,建立适 合中药的药动学一药效学?模型,探讨浓度一效应.时间三维关系,为中药的深入研究提 东北农业大学农学硕士学位论文 供量化标准。中药的现代化发展不容忽视,因此,我们要开拓创新,设计及优化给药、 进行科学制药,为试验结果的准确性提供了重要的理论依据。 ..药物代谢动力学在药理学研究中的应用 药物经过机体吸收分布到靶部位,使药物维持一定浓度,并与作用部位产生受体.药物相 互作用,才能产生一定的药理作用。通过.研究可以发现药物的作用机制。受机体内外 环境因素的影响药物体内过程不同。评价新药或新制剂开发研究的前景也是研究药代动力学 的原因【 。药物作用部位及药物浓度是影响药理作用的重要因素,这与血药浓度的关系比 剂量关系更密切,不同个体使用相同剂量的药物达到的血药浓度各不相同,同~种属动物对 某种药物和受体部位之间的个体差异很小,但有时个体差异使结果产生较大差异时,淘汰著 异个体。药物的浓度不同则药理作用不同,因此为了防止剂量不足或药物中毒,药物治疗的 关键就在丁使局部药物浓度维持在最低有效浓度以上和最低中毒浓度以。卜.手性药物单体. 布洛芬具有抗炎镇痛作用,而.对映体则没有活性,药物代谢研究表明口服消旋体布洛芬后, 一对映体在胃肠内部分构象发生改变,间接发挥其药理作用,并且药物在胃肠道内停留时间 越长,转化程度越大,实验也证实体内两对映体的比率与药物从制剂中的吸收速率呈显著相 关性,这可能是由于肠壁异构酶参与了吸收过程 。所以经过药物代谢动力学研究我们可以 发现,不同的研究导致疗效的不同,有时伴随不良反应的发生,因此,药代动 力学研究能很 好的指导临床用药研究。 .黄芩苷及绿原酸的检测方法研究进展 ..黄芩苷的检测方法 目前,检测黄芩苷及绿原酸的主要方法有紫外分光光度法、二阶导数光谱法、可见分光 光度法、阻抑一催化褪色光度法、差示导数光谱法、二阶导数差示脉冲极谱定量分析法、胶束 薄层色谱法、流动注射化学发光分析法、毛细管区带电泳法、薄层色谱扫描法法、高 效液相色谱法法、反相高效液相色谱法.法、系数倍率法、导数极谱法和 法与其它方法的联用等【。在研究检测方法阶段,国内学者建立了许多简便快捷实用 的方法,但主要检测方法为分光法、色谱法,有些方法虽能检出成分,但分离纯化过程比较 繁琐,不利于操作。 色谱法是检测黄芩苷的最常用方法。张岩等卯,建立高效液相色谱法测定黄芩营在大鼠 血浆中的药物动力学行为。黄芩萤最低定量浓度为././,线性范嗣.~. /, 精密度与准确度符合生物样品分析要求。所建立的方法简便、快捷,适用于黄芩营的血药浓 度测定及药物动力学研究。年,徐凯建等【】用紫外分光光度法对种不同基 质配方和.: 艺的双黄连栓剂中的主要有效成分黄芩苷为代谢指标,测定了药动学参数和生物利用度。引 言 王弘等【 利用高效液相色谱法研究了黄芩苷在大鼠胃、离体小肠上的吸收情况。采用 柱,流动相:甲醇水乙酸::,检测波长为 ,内标为呋喃苯胺酸。黄芩 苷在~ /范围内线性关系良好.。通过实验考察了在不同值下,在人鼠 胃及离体大鼠小肠中黄芩苷的吸收情况。王弘等接着用同样的方法对人血浆中黄芩苷的血 浆蛋白结合率进行了测定。在、、 /范围的回收率为.%、.%、。%。人 血浆中黄芩苷与血浆蛋白的结合率测定,为设计合理的给药方案提供了实验依据。仇峰等【】 采用.法测定家兔血浆中黄芩苷的浓度。方法刖乙腈沉淀蛋白,取上清液直接进样 ,以对 测定。选择作色谱柱,流动相为甲醇.水一磷酸::.,检测波长为 硝基苯甲酸为内标物。结果表明:在黄芩营浓度为.~ /范同内线性关系良好 .,日内、日间分别小丁..%,平均同收率为.%。本法简便快速,适用丁. 黄芩菅的血药浓度测定及药代动力学。阴健等【用法建立了家兔血浆中黄芩营测定方 法,选择芦丁作为内标物。测定条件:选 柱,流动相:甲醇.水一四氢呋喃.磷酸 :::.,检测波: 。黄芩营高浓度的线性在.~.灶‖范 围内.:低浓度的线性在.. /范同内.,最低检测限为 。 平均回收率为:.%。实验结果表明:流动相中加入四氢呋喃能增加其溶解皮,加入磷酸 抑制其解离,并能防止色谱峰拖尾,起剑改善峰形的作川,选择芦’为内标物,因为芦丁与 黄芩苷均为黄酮苷,溶解度性质与色谱性质近似,检测方法更准确,操作简便。阴健等【引 在建立了以上方法后们,又对黄芩营及其在清开灵注射液中的药代动学进行了研究,实验表 明:黄芩苷是含羟基的黄酮类化合物,极性较强有利于盔中的快速消除,而且黄酮类化合 物的胆汁排泄是排泄的重要途径,可经小肠再吸收发生肝肠循环,引起血药浓度回升,因此, 黄芩营在体内代谢可能存在肝肠循环。复方配伍对黄芩营的体内排泄未产生明显影响。单 独静注黄芩苷,在其体内代谢过程符合三室模型,给予清开灵注射液后,黄芩营的体内代谢 过程变成二室模型,可能是由于清灵注射液中桅子、胆酸影响了黄芩苷的体内体内过程,但 在两种情况下的统计矩参数无明显变化。口服黄芩苷的血药浓度曲线呈多峰现象,且血药 浓度很低,其生物利用度仅为.%,说明黄芩苷吸收较差,建议采用非口服给药,提高疗 效。 ..绿原酸的检测方法 ...分光法 紫外分光光度法是光度法的主要检测方法,有紫外吸收的药物都可以用此方法进行检测。 张军利用乙酸乙酯.甲酸.水::作为展开剂对样品进行分离、定位,然后用紫外线 分光光度法测定其含量,并将测定结果与法和法比较发现,该法测定含量比单纯 的法测定准确,与高效液相色谱法结果基本一致,同收率达到%,精密度为. %。 刘汉清等【曾建立紫外分光光度法测定银黄制剂中绿原酸的生物利用度。最近的研究表 东北农业大学农学硕士学位论文 量曼曼 ? 皇曼曼曼曼曼曼量皇曼曼曼曼舅喜皇曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量曼 一 明,金银花的提取物中存在结构与绿原酸相似的化合物,这种化合物在~ 波长区 域内的吸收光谱与绿原酸相同,因此,分光光度法定量绿原酸的准确性有待提高,所以紫外 分光光度法应用范围较窄引。 ...色谱法 在色谱法的研究中,薄层色谱扫描法法、高效液相色谱法法、反相高效液 相色谱法.法较为常见,其中.法是目前文献中涉及较多的分析方法。流 动相多选用甲醇.酸一水系统或乙腈.酸.水系统引。使流动相酸化能抑制绿原酸羟基解离,防 卜解离后的绿原酸与吲定相上残留的金属离子结合产生拖尾现象。 魏英勤?等建立了法测定金银花提取物中绿原酸含量测定方法。采用 ×. 椁 ,肛,乙腈..%磷酸溶液:,/作为流动相,检测波长为 , 进样量?。结果表明,绿原酸能获得良好分离,在.~. /内线性关系良好, 平均同收率.%。该法简便、快速、准确,适于金银花提取物中绿原酸的测定。法 测定绿原酸同样有不足之处,色谱柱容易污染且很难再生困难是不可避免的 缺陷;其次,由 于中药成分的复杂多样性,即使采刖梯度洗脱技术,也很难实现药物成分的完全分离,且分 析时间长、分离效率低。 薄层色谱法可以较准确的确定中药中是否添加了其他化学药物及添加了何种化学药物, 专属性较强,而且与高效液相法相比更加简便快捷,可作为快速检测中药降糖药非法添加化 学药物的理想方法。但是中药成分复杂,某些非添加成分不能确定,给供试品的前处理及对 照品的选定带米了许多困难,所以供试品的前处理过程应处理得当。 郭晓吲引对金银花中绿原酸常见检测方法进行了对比研究。金银花中的有效成分为绿原 酸和异绿原酸等。由丁化学结构相似,分离难度大,用分光光度法只能测定一些相似结构成 分的总量,不能区分异构体等成分的干扰。结论:高效液相色谱法因其高精确度、准确性和 高效性多用于定量分析,而薄层色谱法更适于快速定性鉴别分析。 ...其它方法 随着检测技术的不断发展,多谱联用已成为分析成分复杂样品的重要工具。高效液相色 谱一质谱法?、超高效液相色谱一串联质谱法./、高效液相色谱一电化学 检测法?、高效液相色谱.二极管阵列分析法.等方法均用于绿原酸的 药动学分析。戴传云以黄连口服液为样本,利用法测定绿原酸含量,同时进行近红 外光谱定,建立了绿原酸含量的预测模型,结果发现,该方法预测模型准确可靠, 可做为双黄连口服液的快速质量评价控制方法。 .生物利用度的研究进展 ..生物利用度概述 引 言 是指药物被机体吸收进入体循环的相对量和速率,用 生物利用度, 表示,/?%。为药物直接进入体循环所能达到的浓度,为口服相同药物剂 量后体循环所能达到浓度。生物利用度分为绝对和相对两种:绝对生物利用度是药物吸收 进入体循环的量与给药剂量的比值,即血管外给药制剂与静脉注射的药.时曲线下面积 的比值:相对生物利用度是同一种药物不同制剂之间比较吸收程度与速度而得到的生物利用 度。人们对生物利用度的关注有利于防止中毒事件的发生,同时,人们了解药物在体内的 吸收程度与代谢速率,很好的推动了药物的研发。随着中药现代化的快速发展,对中药生物 利用度的研究逐年增加,因此为探讨中医药理论、归经学说的本质和中药制 剂的剂型改进及 新药的研制提供了重要的科学依据