医学毕业论文cdk4、p16在中耳胆脂瘤中的表达及意义

医学毕业论文cdk4、p16在中耳胆脂瘤中的达及意义 X X 大学 毕业论文 CDK4、P16在中耳胆脂瘤中的表达及意义 姓 名:__________ 2014年6月25日 CDK4、P16在中耳胆脂瘤中的表达及意义 【摘要】 观察细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4、细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子P16在中耳胆脂瘤上皮的表达情况，探讨它们在胆脂瘤发病机制中的作 用。方法:采用免疫组织化学技术SABC法检测CDK4、P16在中耳胆脂瘤35 例、正常外耳道皮肤20例中的表达，并结合胆脂瘤对听小骨骨质破坏程度，采 用SPSS11.5软件进行统计学。结果:CDK4、P16均表达于胆脂瘤上皮的棘 细胞层、颗粒层和角质层，阳性率分别为68.6%、88.6%，高于对照组(前者P=0.011, 后者P=0.02)。二者在胆脂瘤上皮的表达有一定的相关性，P,0.05;与中耳胆脂瘤 听小骨骨质破坏程度之间无明显相关性，P,0.05。结论:CDK4与P16在中耳 胆脂瘤发生中是共同而非单独起作用的，从细胞周期的角度可反映胆脂瘤上皮细 胞过度增殖的同时也增强负调控因子来抑制增殖，使凋亡同时加快而达到新的平 衡。但与骨质破坏程度可能无直接关系。 【关键词】 CDK4 P16 胆脂瘤 中耳 免疫组化 ,ABSTRACT, cholesteatoma and to explore their roles in the development of cholesteatoma. canal skin were used in this study. All specimens were stained by an immunohistochemical SABC method to detect the expression of CDK4 and P16. Correlations between the above indexes and between the above indexes and the degree of ossicular destruction were investigated. Result: CDK4 and P16 were expressed in parabasal layers and the upper layer, mainly in the prickle and granular layers of cholesteatoma epithelium. Their positive rates were 68.6% and 88.6%, respectively. Statistical analysis showed that there was a significant difference in positive rates between the normal external ear canal epithelium and the cholesteatoma epithelium(P=0.011, P=0.02), and a positive correlation between CDK4 and P16 in the cholesteatoma group(P,0.05). The statistical results indicated that the expression of CDK4 and P16 did not related to the extent of ossicular damage in cholesteatoma(P,0.05). Conclusion: cholesteatoma epithelium and positively correlate with each other, suggesting that they play a cooperative role in the development of cholesteatoma. The cholesteatoma ation ability and a mechanism of inhibiting the proliferation. The result of immunohistochemical examination is not related to the degree of ossicular destruction. ,KEY WORDS, CDK4; P16; Cholesteatoma, middle ear; Immunohistochemistry 有研究表明，胆脂瘤具有过度增殖性，但它同时还存在着凋亡的增强,1,。 许多细胞因子、癌基因产物、激素可影响细胞周期运行，诱导或抑制细胞增殖或 凋亡，在中耳胆脂瘤发病中起作用,,。p16表达产物P16蛋白与cyclinD竞 争性特异性结合细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和/或CDK6而抑制其活性，对 细胞增殖周期起负性调节作用，即通过影响细胞周期运行速率参与调节细胞凋 亡。近年来已证实CDK4与p16基因在多种肿瘤的发生发展中起重要作用，但 在良性病变中的研究则较少。本研究检测CDK4与P16在中耳胆脂瘤上皮细胞 中的表达状态，可从细胞周期调节角度为探讨胆脂瘤的发病机制、预防与治疗提 供实验参考。 1 资料与方法 1.1 研究对象 实验组标本取自1999年1月至2005年2月在我科行手术 治疗并经病理确诊的慢性胆脂瘤型中耳乳突炎35例，其中男21例，女14例， 10 56岁，平均27岁;后天性33例，先天性2例。并根据手术所见参照saleh 等对听小骨破坏程度分级的建议分成4级,6,:未受损(O0)8例;砧骨被腐蚀、 听骨链中断者(O1)5例;砧骨、镫骨弓同时破坏者(O2)14例;锤骨柄与砧骨缺如、镫骨弓破坏者(O3)8例。挑选其中HE染色的病理切片符合条件的石蜡包埋标本。入选条件是镜下具有胆脂瘤3个基本特征:基质，即上皮组织;基质旁组织，即上皮下结缔组织;囊物，为角化上皮等破碎细胞成分和胆固醇结晶等物质。对照组为正常外耳道皮肤石蜡包埋标本20例，取自最近行鼓膜修补术或乳突根治术的患者。 1.2 试剂 兔抗人多克隆抗体CDK4(浓缩型，BAO310);兔抗人多克隆抗体P16(浓缩型，BAO266);广谱即用型SABC试剂盒;DAB显色试剂盒。均为武汉博士德生物工程有限公司产品。 1.3 方法 所有标本均经10%福尔马林固定、石蜡包埋，作3?μm厚连续切片,贴于涂有0.05%多聚赖氨酸的载玻片备用。常规HE染色。链霉亲和素-过氧化物酶法()免疫组化染色按SABC试剂盒说明进行，用购自该公司的已知阳性片作阳性对照，用PBS取代一抗作空白阴性对照。主要步骤:切片脱蜡、水化，PBS缓冲液洗3次×3?min;3%H2O2 20??10?min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次×3?min;置入0.01?M柠檬酸高温高压抗原修复，自然冷却后蒸馏水洗2次×3?min，PBS洗2次×3?min;滴加抗原修复液?10?min PBS洗3次×3?min;滴加正常山羊血清封闭液20?min甩去多余液体，不洗;滴加稀释后的一抗(CDK4及P16稀释倍数均为1?200)，4??过夜;PBS洗3次×3?min;滴加生物素化山羊抗兔IgG，20??20?min后PBS洗3次×3?min;滴加SABC，20??20?min PBS洗4次×5?min;DAB(3，3′二氨基联苯胺4盐酸)室温下显色，镜下控制反应时间;蒸馏水洗涤，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封固，显微镜观察。 1.4 结果判断 细胞不着色，或呈浅棕色的背景颜色为阴性表达。细胞内棕黄色或褐色颗粒为阳性表达。于400倍视野下随机选取5个不相重叠的着色视野进行观测，参照shimizu改良法,7,进行结果判定及评分:(1)显色程度:基本不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;(2)显色数 量:无阳性细胞为0分，阳性细胞占计数细胞总数比例小于1/3为1分，1/3 2/3为2分，2/3以上为3分。结合显色程度及数量进行综合判断，计算二者相加得分，取平均值，小于3分为(-，阴性)，3分为(+，弱阳性)，4分为(，中等阳性)，5 分为()，6分为()，及为强阳性。 1.5 统计学处理 采用SPSS11.5版软件包进行分析。组间阳性率及表达强度的比较采用，必要时用Fisher精确概率法。两两指标间相关性分析采用Spearman Rank Corrlation 检验，所有结果均以P,0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 CDK4在实验组与对照组的阳性表达都位于细胞浆，呈棕黄色颗粒状。在中耳胆脂瘤上皮中弥漫性分布于基底层以上各层，靠近基底层的部分细胞表达较弱(封三彩图1)。而对照组CDK4表达位于棘细胞层及颗粒层，颜色较淡(封三彩图2)。两组阳性率比较χ2=7.637,P=0.011(差别有统计学意义)。结果表明CDK4在中耳胆脂瘤上皮的表达高于正常外耳道皮肤。P16蛋白阳性产物在胆脂瘤上皮中大部分位于细胞浆、细胞膜，小部分位于细胞核，呈棕黄色细颗粒状弥漫性均匀分布于棘细胞层、颗粒层及角化层，密度高，多在中等阳性以上(封三彩图3、4)。而对照组P16多位于细胞浆，主要分布于角化层及部分颗粒层，密度低，多呈弱阳性(封三彩图5)。两组阳性率比较χ2=6.091, P=0.02(差异有统计学意义)，即P16在中耳胆脂瘤的表达程度明显高于正常外耳道皮肤。CDK4、P16在实验组与对照组的表达情况，见表1。nCDK4-阳性率在中耳胆脂瘤组P16的阳性率(88.6%)明显高于CDK4(68.6%),X=4.158, P,0.05,但从二者的阳性片来看，24例CDK4阳性片中有22例同时表达P16，皆为阴性表达2例;35例实验组二者表达不一致11例。以各例的综合判断评分行Spearman相关性检验，显示二者表达强度呈一定程度的正相关:r=0.288, P,0.05。CDK4、P16表达与听小骨破坏程度分级之间的相关性，见表2。 3 讨 论 已有研究表明，中耳胆脂瘤的发病与上皮细胞过度增殖及凋亡增多有关,1,。而增殖与凋亡的改变最终是通过细胞周期的调控来实现的。也就是说，中耳胆脂瘤的发病与其它许多疾病一样，最终都可汇聚到细胞周期调控机制上来。 细胞的正常分裂、生长一方面需要细胞周期蛋白的正常分泌，需要CDKs的正性调控及许多蛋白来参与正常的活动;另一方面，又需要另一类蛋白如P16蛋白等负性调控因子参与监控细胞周期蛋白的过度表达。二者保持平衡是细胞维持正常生长的必要条件。因此，对调节细胞周期的分子进行研究将有助于理解胆脂瘤上皮细胞增殖与凋亡的发生发展过程。 据报道,8，9,，CDK4在神经胶质细胞瘤、软骨肉瘤、鼻咽癌等多种恶性肿瘤和细胞系中过表达，还有学者,1，10，11,称与PCNA过表达部位相同。也就是说，CDK4过表达与细胞的过度增殖能力相关。CDK4等多种细胞周期物质同样也参与胆脂瘤上皮细胞的过度增殖。Tanaka等,12,研究发现，与正常外耳道皮肤相比，CDK2、CDK4在胆脂瘤上皮中表达增加，特别是在炎症严重的区域表达更高;同时检测出、KGF在炎症区域表达增加，故而推测由于胆脂瘤上皮下的炎症刺激导致炎症细胞表达等细胞因子，这些因子相互作用，上调CDK2/CDK4及其它物质的表达，促进细胞周期进程，导致上皮增殖。我们的研究结果显示，CDK4在胆脂瘤中的阳性率明显高于正常外耳道皮肤(P,0.05),而且从阳性片的表达强度来看，胆脂瘤以强阳性为主，对照组则为阳性及弱阳性(P,0.05)。在胆脂瘤基底层以上阳性表达更明显，表明胆脂瘤上皮除了基底层，其它各层同样具有从G1期进入S期继续分裂的能力，从而可反映胆脂瘤上皮细胞具有过度增殖的能力。然而，胆脂瘤的增殖不象恶性肿瘤一样不受控制。已有研究提示,13,，胆脂瘤上皮细胞的凋亡模式和动力学特征与正常外耳道皮肤相似，即只是Fas蛋白(凋亡诱导蛋白)表达上调，凋亡的细胞数量显著增加，凋亡过程无特殊。而增殖与凋亡的量同时增加重新达到新的平衡，使死亡的细胞数增多从而产生更多的角化物碎屑，排出受阻最终堆积形成胆脂 瘤。 本研究中P16在胆脂瘤上皮的表达阳性率88.6%，高于对照组(P,0.05),而且，阳性片表达强度主要在++以上，而对照组则以弱阳性为主，P,0.05。另者，P16在胆脂瘤的阳性部位主要见于棘层、颗粒层与角化层，与CDK4相似。统计学上还表明，在同一组织连续切片中，CDK4与P16的免疫组化结果中二者的阳性率、染色强度均存在一定程度的正相关(P,0.05)。在陈谦明等,14,对口腔黏膜癌变过程中CDK4与P16的研究中也发现这一结论。由于P16作为CDK4的调节因子只是通过与其结合形成无活性或低活性的复合物，改变其构象来抑制CyclinD与CDK4结合，并不使后者的抗原性或抗原的量发生改变，故推测在胆脂瘤形成过程中CDK4表达的改变，是先于P16的改变，而非后者的结果。因此，可能是由于位于P16下游的CDK4对前者的转录、表达存在某种正反馈调节通路，故CDK4的过表达引发了P16的代偿过程。CDK4是通过什么机制来调节P16的表达呢,通过分析CDK4与P16在细胞周期调控中的作用发现Rb与二者的作用密切相关。Shapiro等,15,报道了肺癌中P16、Rb表达的交互性，认为功能性的Rb能反馈抑制P16的表达。某些病理性刺激因素引起的CDK4过表达导致功能性的非磷酸化Rb减少，Rb对P16的反馈抑制丧失或减弱，故P16水平相应升高，力图以此抑制过表达的CDK4的活性，重新恢复细胞周期的平衡。也就是说，在机体内复杂的细胞周期调控网络中，不仅存在P16??CDK4活性??Rb磷酸化??E2F活性受抑制?细胞周期停滞于G1/S关卡的增殖抑制通路，还存在一个CDK4??磷酸化Rb?，即非磷酸化的活性Rb??P16?的正反馈代偿回路，正是由于这种互相制约的调节体系的存在，才使得对正常细胞周期的精确调控能得以实现。这也从侧面提示P16最终是通过影响CDK4活性而非通过改变CDK4的量来发挥其对细胞周期的调节机能。 从细胞周期上分析，在胆脂瘤上皮细胞中，CDK4表达上调的同时P16表达也增加，P16直接与CyclinD竞争性结合CDK4，使蛋白激酶不能活化，Rb磷酸化受阻不能释放E2F，从而抑制细胞进入S期，阻止上皮细胞增殖分化，诱导细胞凋亡发生。由此可见，胆脂瘤上皮细胞尽管处于过度增殖状态，但并非完全 失控，其负调控机制同时增强，细胞仍具有正常凋亡的能力，这与恶性肿瘤细胞的增殖有着本质的区别(在肿瘤发展过程中，细胞不仅无限增殖而且能抵御凋亡)。且从染色体水平来看,16,，胆脂瘤并无明显的染色体变异性，故无恶变倾向。而在大多数肿瘤的研究中，p16基因多发生缺失、突变或异常甲基化等改变而失活，导致P16蛋白表达减少，失去抑制CDK4的作用，CDK4过表达以致细胞过度增殖。这与本研究中P16在胆脂瘤上皮高表达的结果正好相反。 此外，CDK4、P16与中耳胆脂瘤听小骨破坏程度分级的统计学结果显示两个指标与分级之间均无明显相关性(P,0.05)，说明CDK4、P16参与的细胞周期调节作用只是对胆脂瘤上皮的过度增殖与凋亡起作用，该研究尚不能反映它们与胆脂瘤的骨破坏机制有关系。 总之，从本实验结果可知CDK4及P16在中耳胆脂瘤中均过表达，且存在一定程度的正相关，说明中耳胆脂瘤上皮细胞同时具有很高的增殖能力与凋亡能力。由于机体内细胞周期调控网络中存在正反馈通路，CDK4增高的同时负调控因子P16的表达增强来抑制CDK4活性，诱导凋亡产生，使胆脂瘤高增殖能力处于可控制状态。 【参考文献】 ,1, Olszewska E, Chodynicki S, Chyczewski L. 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