乳酸菌检测方法

乳酸菌检测方法 一、乳酸菌检测方法 植物乳杆菌的检验 1原理 植物乳杆菌能在相应的厌氧培养条件下，于MRS培养基表面生长成白色、细密、圆形光滑突起的菌落，根据长出的菌落数和稀释倍数，计算出活菌数。 2仪器与试药 2.1 仪器 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱、电冰箱、恒温培养箱(60??1?)、恒温水浴锅、显微镜(10x—100x)、架盘天平(0—500g，精确至0.5g)、250ml锥形瓶、250ml盐水瓶、灭菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)、灭菌平皿(直径90mm)、灭菌试管(15mm×160mm)、灭菌L型玻璃棒等。 2.2 试药 酪蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、琼脂等均为生化试剂;无水乙酸钠、柠檬酸三胺、硫酸镁、硫酸锰、葡萄糖、磷酸氢二钾、碳酸钙、吐温-80、氯化钠等均为纯;水为双蒸馏水，其他化学试剂均为分析纯。 2.3 MRS琼脂培养基的组成与制备 2.3.1培养基的组成 酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺3g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、磷酸氢二钾2.0g、碳酸钙20g、吐温-801ml、琼脂15g、蒸馏水1000ml。 2.3.2培养基制备 将上述的各组分在80,90?加热使溶解，校正pH6.2，加蒸馏水至1000ml中，摇匀，分装于盐水瓶，每瓶100ml。在121?高压灭菌20分钟，冷却后备用。 2.4营养琼脂平板的制备 取冷至45?左右的MCA琼脂培养基，在无菌的条件下倒入无菌的培养皿中，每平皿各约15ml，待冷却凝固后，备用。 2.5无菌生理盐水的制备 称取氯化钠9.0g，用蒸馏水溶解并定容于1000ml量瓶中，摇匀，分装于250ml三角瓶中，每瓶装90ml. 在121?高压灭菌20分钟，冷却后备用。 3供试品溶液的制备 以无菌操作法取检品10.0g，加入盛有90ml无菌生理盐的三角瓶中，充分振荡10分钟，制成1:10样品悬液。再用无菌吸管吸取1:10的样品悬液1ml，注入盛有9ml无菌生理盐 -2-3-4水的试管中，充分振荡，制成1:10的稀释液。 按上述操作程序依次制成1:10、1:10、 -5-6-71:10、1:10、1:10等的稀释液，作为供试品溶液。 4 测定方法 -4-64.1 涂布分别吸取稀释级为10,10的样品稀释液各0.2ml，用无菌L形玻璃棒均匀涂布于固体培养基平板上，每稀释级重复2,3个平板。 4.2 培养 倒置，于35,37?厌氧培养24,48小时后，计算单个菌落。 5.3 计数 选取菌落数在30—300个平板进行有效活菌计数，并计算同一稀释级的平均数。 5 计算 计数后按下式进行样品中活菌的计算: N×D×10 植物乳杆菌数(cfu/g)=———— 0.2×W N:平板中菌落数(同一稀释级数的平均值，cfu); D:稀释倍数; W:取样量(g)。 6结果报告 上述测定的植物乳杆菌含量为每1g样品中的活菌数量。 二、乳酸菌的作用 名称 含量 功能特点 使用方法 粪链球菌 200亿cfu/g 1、产生乳酸、维生素、酶及抑菌物将本品均匀混合于颗粒饲料或 质。 粉料中直接饲喂。每吨配合饲料 2、抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄添加料参考如下: 色葡萄球菌的生长。 1、鸡、鸭、鹅:50克，全场全 3、饲料中添加，可大量减少抗生素期使用。(1-7日龄加倍使用效果 和酶的用量。 更佳) 4、提高免疫力，提高防病抗病能力，2、猪:50克，连续使用10-15 减少消化道、呼吸道疾病 。 天，全程使用效果更好。断奶前 5、降低粪便氨氮浓度，改善养殖环后一周连续使用，按每吨100-150 境。 克添加，可有效防止断奶腹泻。 嗜酸乳杆菌 200亿cfu/g 1、代谢产生乳酸、酶及抑菌物质。 在饮水中使用或混合于饲料中。 2、抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长，将本品均匀混合于颗粒料或粉 减少肠炎与腹泻。 料中直接饲喂，每吨配合饲料添 3、使消化道、呼吸道疾病减少，防加量参考如下: 病抗病能力提高。 1、鸡、鸭、鹅:50克，全场全 4、增强机体抗氧化能力，提高免疫期使用。(1-7日龄加倍使用效果 力 。 更佳) 5、降低粪便氨氮浓度，改善养殖环猪:50克，连续使用10-15天， 境。 全程使用效果更好。断奶前后一 周连续使用，按每吨100-150克 添加，可有效防止断奶腹泻 植物乳杆菌 200亿cfu/g 1、产生乳酸、维生素、酶及抑菌物将本品与其他益生菌混合均匀 质。 后，用于发酵饲料，每吨发酵饲 2、在发酵饲料中添加，既增加饲料料添加量参考如下:每吨发酵饲 的风味，促进动物的食欲，又有防腐料按1公斤添加。 作用。 3、抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长， 减少肠炎与腹泻。 4、提高免疫力，提高防病抗病能力， 减少消化道、呼吸道疾病 。 5、降低粪便氨氮浓度，改善养殖环 境。 四、乳酸菌的生产 大多数乳酸菌属于兼性厌氧和异养菌，不像双歧杆菌那样要求严格厌氧条件，对营养要求也不如双歧杆菌高，许多菌可以在MRS培养基、牛乳、胡萝卜汁、番茄汁及其他蔬菜汁中良好地生长。对厌氧条件要求不高的乳酸菌，在小规模培养时可以采用静止培养或间歇搅拌的方式进行培养。 1、平板培养复壮:将在冰箱保藏的乳酸菌斜面种子采用划线的接种方法在乳酸菌平板 培养基上划线接种，于38?培养12h，使乳酸菌复壮，并形成单菌落; 培养基为按下述比例的混合物:酪蛋白胨1%、葡萄糖2%、酵母浸粉0.7%、牛肉 膏0.5%、柠檬酸三铵1.5%、磷酸氢二钾0.2%、无水乙酸钠0.5%、吐温-80 0.1%、 琼脂粉2%，pH自然，121?，灭菌20Min，备用。 2、制作摇瓶种子 将在平板中培养的乳酸菌菌落挑选典型的单菌落，接种到乳酸菌液体培养基中，采 用常规方法在1000ml三角瓶液体培养基上于37?培养8-12h,得到乳酸菌摇瓶种子; 所述培养基为按下述比例配置的混合液:大豆蛋白胨1%、葡萄糖1%、酵母浸粉 0.7%、牛肉膏0.5%、无水乙酸钠0.6%、磷酸氢二钾0.5%、柠檬酸三铵1.5%、吐 温-80 0.5%，pH自然，115?，灭菌20Min，备用。 (有条件可加入西红柿汁10%、 胡萝卜汁10%、蘑菇汁5%具体制法:将西红柿、 胡萝卜、蘑菇按照2:2:1比例加 入水中煮沸后，慢火煮20Min后 ，过滤去渣，最 后用自来水补齐所需要的溶液。) 3、生产一级种子液:按照以下配方配制一级种子培养基，经121?，灭菌45Min，pH 自然，冷却到40?以下，将上述步骤得到的摇瓶种子以8%(体积分数)的接种量， 接种于生产用的一级种子罐中，37?培养8-12小时， 原料 % 100mL/g 1L/g 1ooL/kg 1KL/Kg 豆粕粉(80目) 0.5 0.5g 5g 0.5kg 5kg 鱼粉(80目) 0.5 0.5g 5g 0.5kg 5kg 鱼蛋白胨 0.5 0.5g 5g 0.5kg 5kg 乳糖 0.2 0.2g 2g 0.2kg 2kg 玉米面(80目) 0.5 0.5g 5g 0.5kg 5kg 葡萄糖 1 1g 10g 1kg 10kg 氯化钠 0.1 0.1g 1g 0.1kg 1kg 磷酸氢二钠 0.15 0.15g 1.5g 0.15kg 1.5kg 增效剂 0.05 0.05g 0.5g 0.05kg 0.5kg 消泡剂 0.03 0.03g 0.3g 0.03kg 0.3kg 4、二级发酵(生产发酵):将得到的乳酸菌一级种子，以10%体积比例接种到生产发 酵培养液的发酵罐中，发酵液培养液的配方和控制条件同生产一级种子液，发酵 12h，得到发酵菌液。最后按照乳酸菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对乳 酸菌发酵液的活菌含量进行常规平板计数检测。 5、三级发酵: 在工业生产时，当需要更大规模(20T以上发酵罐)的生产量时，还需要进行三级 发酵。 6、根据发酵活菌含量检测结果和目标菌数，计算出投料量。 7、投料搅拌: 8、喷雾干燥: