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布加综合征中载脂蛋白A1及其影响因素的病例对照研究

2017-09-25 32页 doc 58KB 14阅读

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布加综合征中载脂蛋白A1及其影响因素的病例对照研究布加综合征中载脂蛋白A1及其影响因素的病例对照研究 布加综合征中载脂蛋白A1及其影响因素的病例对照研 究 研究生个人简介 姓名:张静性别:女 年龄: 英语:大学英语六级 已修学分:. 学习及工作经历: ..,济宁医学院预防医学专业,获医学学士学位 ..,徐州医学院流行病与卫生统计学专业,获医学硕士学位 研究生期间科研成果及获奖情况: 年,医学理论与实践,论文一篇,己发表 年, ,论文一篇,已发表 年, ,论文一篇,审稿中 年,实用医学杂志,论文一篇,已发表 目录 缩略词表一一 中文摘要? 前 言??一 ...
布加综合征中载脂蛋白A1及其影响因素的病例对照研究
布加综合征中载脂蛋白A1及其影响因素的病例对照研究 布加综合征中载脂蛋白A1及其影响因素的病例对照研 究 研究生个人简介 姓名:张静性别:女 年龄: 英语:大学英语六级 已修学分:. 学习及工作经历: ..,济宁医学院预防医学专业,获医学学士学位 ..,徐州医学院流行病与卫生统计学专业,获医学硕士学位 研究生期间科研成果及获奖情况: 年,医学理论与实践,一篇,己发表 年, ,论文一篇,已发表 年, ,论文一篇,审稿中 年,实用医学杂志,论文一篇,已发表 目录 缩略词表一一 中文摘要? 前 言??一 材料和方法??‘ 材料?一 方法?一 结 果 讨 论??‘ 结 论??‘ 参考文献? 综 述 攻读硕士学位期间发表学术论文?一 附录调查表??一 致 谢 论文独创性声明 论文使用授权声明论文审阅认定书徐州医学院硕士学位论文 缩略词表 缩略词 英文全称 中文全称三磷酸腺苷结合盒转运体 ? . 甲胎蛋白 白蛋白碱性磷酸酶 脚 谷丙转氨酶 载脂蛋白 一 武? 谷草转氨酶 . 等位基因特异性 ? ?抗凝血酶? % 嗜碱粒细胞百分比布加综合征糖类抗原。 糖类抗原癌胚抗原 总胆固醇肌酐 直接胆红素凝血酶原 乙二胺四乙酸凝 血因子酶联免疫吸附测定 ? 徐州医学院硕士学位论文 % 嗜酸粒细胞百分比 蓼 谷氨酰转肽酶 葡萄糖 红细胞比容 高密度脂蛋白 血红蛋白 下腔静脉 】 基因 卵磷脂胆固醇酰基转移酶乳酸脱氢酶低密度脂蛋白% 淋巴细胞百分比淋巴细胞计数 平均血红蛋白浓度 % 单核细胞百分比 群单核细胞计数慢性骨髓增生性肿瘤口促血小板生成素受体 ?【 平均血小板体积 % 中性粒细胞百分比撑 中性粒细胞计数蛋白血小板压积 血小板计数红细胞计数 徐州医学院硕士学位论文 对硝基苯磷酸二钠盐 红细胞分布宽度每分钟转速.清道夫受体总胆红素 甘油三酯总蛋白 ?毽 肌 白细胞计数 徐州医学院硕士学位论文 布加综合征中载脂蛋白及其影响因素的病例对照 中文摘要 浓度及其 目的分析布加综合征患者血浆中载脂蛋白 浓度的多态位点进行基因分型,结合现场流行 影响因素,并对影响 病学调查资料进行分析,探寻我国病因研究新思路,为疾病进一步的机 制研究奠定基础,为临床诊疗提供新依据。 方法本研究采用病例对照研究,收集年月至年月间徐州医 学院附属医院介入科确诊并住院治疗布加综合征患者例作为病例组,健康对 照例来自徐州医学院附属医院体检中心:纳入研究的病例及对照每人采集外 周静脉血,通过试剂盒提取全血,并利用探针对多态位点 进行基因分型;年月至年月收集的例病例与对照每人多抽取 全血,离,取新鲜血浆,利用 浓度, 试剂盒检测血浆中 所有研究对象均进行面对面问卷调查,并收集完整病历和各项实验室检查资 料, 建立数据库并进行统计分析。 结果.例患者血浆 浓度../,健康对照组 浓度../,两独立样本检验差异有统计学意义., .;中不同.分级、不同疾病亚型、新发与复发组、是否合 浓度差异均无统计学意义;饮酒组 浓度高 并肝硬化组间比较 于非饮酒组.,.,与血浆 无关联,多因素回 保护性因素。 归分析高水平、%为血浆 .病例组例 位点基因型分布例,例,例 与健康对照组分布例,例,例差异有统计学意义《., .,病例组等位基因携带率.%低于对照组.%。单因素 徐州医学院硕士学位论文 回归分析以野生纯合子为参照,分析针与关联,.%: ...,.。以为参照,分析与关联,., 无意义。调整年龄、性别、文化水平、经济水平及吸烟饮酒状况后, 与仍有关联,.%:...,.,即携带等位基 因的基因型为的保护性因素。不同亚组中,基因型与下腔静脉型 及女性存在关联。 结论与健康对照相比,血浆中低表达,且这种低表达与肝脏功 浓度无关,血浆高 能受损程度无关,多态位点基因型分布与 浓度保护性因素;个体基因型携带等位基因能够降低 及血浆高%为 易感性。 关键词布加综合征:载脂蛋白;病例对照研究;多态性徐州医学院硕士学位论 文? ?,’,. ,’ . . .. ’.. .士./ 氏.. , ../ ? , ,胗.. ,.% ..//氏.// //. ...,%:.?.. , ,, , , .,% .?.,.. .. . 徐州医学院硕士学位论文;? ; ; 徐州医学院硕士学位论文 前 言 布加综合征. ,是由多种原因引起的较大肝静脉或 肝段下腔静脉部分或完全梗阻性肝静脉一下腔静脉血液回流障碍,导致淤血性门 静脉高压症和下腔静脉高压症两大综合征【】。临床症状复杂多样,以腹部胀痛、腹 水、淤血性肝脾肿大、肝功能损害为主,常伴有腹壁、腰背部静脉曲张、食管胃 底静脉曲张、双下肢静脉曲张及色素沉着、溃疡等,无特异性,易误诊。 病程通常几年到几十年,治疗不及时,预后非常差。该病发病无季节特点,无年 龄特异性,病程长,四季均可发。国内外该病的发病率差异较大,西方国家该病 发病率不足./万,病例均为散发。年代后期,日本报道其发病率约为./ 万,与西方国家接近。然而在尼泊尔,该病发病率在肝脏类疾病中较为靠前,是 肝脏病科入院率最高的疾病【】在我国,近年来文献显示,在黄河和淮河 中下游区域已经成为一种比较常见的疾病,其发病率在苏、鲁、豫、皖交界地区 高达/万【。查阅.年间国内文献报道,我国接受外科手术和介入治 疗的病例已经超过例,其中接受介入治疗患者例数已超过例。徐 州医学院附属医院介入放射科祖茂衡教授近十年收治的患者超过例,并 且呈逐年上升的趋势,详见图。 课题组随机抽取年月入住徐州医学院附属医院介入放射科患者病 历,该月共收治例,其中接受介入术治疗者例,平均花费.元, 李胜利等对例进行临床特征分析发现发病者中.%来自农村【】,高额 的治疗费用为广大患者带来沉重经济负担。成德雷等对例临床特征分析 发现下腔静脉型最常见体征为双下肢水肿%,肝静脉型最常见体征为腹水 %,对其病程长短进行统计分析发现平均病程为个月,最长病程可达徐州医学院硕士学位论文 图徐州医学院附属医院近十年收治情况 年之久【】,长期病痛折磨为患者及其家人带来沉重精神负担,同时也增加了社会经 济负担。 国内对该病的分型通常采用祖茂衡教授提出的方法,即种类型并派生出 种亚型,下腔静脉型:下腔静脉膜型阻塞,下腔静脉节段型阻塞,下腔 静脉阻塞伴血栓形成;肝静脉型:肝静脉局限性阻塞,肝静脉广泛性阻 塞,肝静脉和副肝静脉阻塞;混合型:下腔静脉和肝静脉阻塞,下腔静 脉和肝静脉阻塞伴副肝静脉代偿‘。疾病诊断首选彩色多普勒超声,该法灵敏度高 且费用较低,肝静脉.下腔静脉造影是该病诊断的金标准,但该法具有侵入性,很 少单纯作为诊断方法使用。治疗上国内目前以介入手术为主,该法安全、有效、 创伤较小、恢复快,但术后抗凝药物的长期使用以及血管、植入支架的再狭窄等 问题会为患者带来长期负担。因此,急需探寻导致该病病因,为疾病早期根治 提 供必要的科学依据。 西方国家对于病因方面的研究主要集中在两方面,详见图,即凝 血系统: ,等:慢性骨髓增殖性肿瘤病因研究。凝血因子 苫徐州医学院硕士学位论文 的突变位于其编码基因中最长的,突变发生后位碱 基由变为,编码氨基酸由精氨酸变为谷氨酰胺,突变以后的不能被活化 蛋白灭活,从而产生活化蛋白抵抗,导致血栓形成网。年大样本研究报 道 突变发生率在不同人种间差异较大,欧洲人群中发生率最高可达到 %,但在亚洲人群中几乎为,近来研究人员发现在埃及患者中最常见病 因不是,而是 突变【引,本课题组通过方法对该点进行检 测未发现突变,与国内多项研究成果一致【。,因此推测在国内中开展突 变筛查意义不大。 图 可能病因参考文献自行 凝血酶原凝血因子,的突变在西方国家病因研究中 也备受关注,该突变发生于编码基因 端非翻译区,突变导致鸟嘌呤被腺嘌呤 替代,从而导致血浆中凝血酶原水平升高,致血栓形成。不过由于健康人群中 也 会出现该突变,且在中突变率又比较低,一些研究显示在与健康对照 中比较差异无统计学意义【’,本课题组及林国岭、郑红等均发现中国患 者体内无突变发生【】,因此推测该突变点不可能是中国致病 危险因素。 对于西方国家报道的其他凝血系统危险因素祁兴顺等进行了验证,发现在国 徐州医学院硕士学位论文 内患者中均罕有发生】,故不可能是中国致病因素。 是西方国家的首要病因,最新分析显示西方中 发生率平均为.%】,可以说的病因研究进展在西方国家病因研究 中起到不可替代的作用。年,七个研究小组先后在、 及 等高影响因子杂志报道在中发现一个高突 变率的位点即之,由于为最主要的后天获得性病因,故 该突变位点的发现使的病因研究有了新的突破。该突变位点位于酪氨酸激酶 外显子,?的突变导致第位的缬氨酸被苯丙氨酸替代,使 得/灯通路持续活化产生激活信号导致细胞激增,从而使机体出现 相应临床体征。随后,.年间西方研究人员又在不同亚型真性红 细胞增多症、原发型血小板增多症、原发性骨髓纤维化中陆续发现、 、、.、及.突变位 点【,。本课题组对以上位点通过。进行筛查,发现例中仅有 例发生突变,发生率远远低于西方文献报道,其余位点均未见阳性结 果,该结果与西京医院祁兴顺研究结果一致【】。年多个课题组研究发现 /单体型与易感性有关,紧随其后年等在例中对/ 单体型标签位点进行分型,发现该位点与疾病易感性有关,值可达 .。目前本课题组正在对该单倍型与疾病易感性进行分析,实验结果汇总中。 年月 研究小组研究发现患者血浆中载脂蛋白 低表达。研究小组将所有蛋白表达水平在例布加 , 综合征患者与健康对照者之间进行了比较,筛查之后发现,共有种蛋白在患 者 血浆中出现低表达,经过原子吸收分析发现差异最显著的即为载脂蛋白,其 余 种有待进一步识别。研究人员认为例病例样本量太小,代表性差,故与欧洲 肝血管疾病研究联盟合作,检测来自个国家研究中心例患者及相应对照的 血浆,证实患者血浆中载脂蛋白表达水平下降,而且证实这种降低与肝 脏功能相关性较小最大相关系数为.】。 载脂蛋白主要由肝脏合成,徐州医学 院硕士学位论文 少量由小肠合成,存在血浆和组织中,查询基因库发现该蛋白是由个氨 基酸组成的大分子抗原,编码基因位于号染色体长臂区带到带,全长. ,由个外显子和个内含子组成。它是构成高密度脂蛋白 的主要结构蛋白,在高密度脂蛋白代谢过程中起到关键的作用。 表达研究最多的即启动子区域多态位点,关于该点 目前国内外关于 影响存在较大争议, 查阅各大数据库,目前国内尚未见中有相关 对 浓度,并分析 报道,本研究欲采用病例对照研究通过法检测血浆中 影响其浓度的因素,进而利用探针法对多态位点进行基因分型,探 索中与浓度的关联,并分析多态点与关联,为病因 探索提供新思路。 徐州医学院硕士学位论文 材料和方法 材料 .试剂 提取试剂盒 上海赛百盛基因技术有限公司 美国 试剂盒 生物公司 缓冲液 上海生物科 技有限公司美国 / 美国 上海生物科技有限公司.主要试剂配制 .. 溶液。,.. . . 先加入 的双蒸水搅拌均匀,滴加浓盐酸将值调至.,然后加入双 蒸水将溶液定容至 ,高温高压灭菌后,保存备用。 ../ /】 加入双蒸水后吹打混匀,并于涡旋器上混匀,备用; 徐州医学院硕士学位论文 .仪器 海门市麒麟医用仪器厂 型漩涡混合器 型低温高速离心机 德国公司 型掌式离心机 海门市麒麟医用仪器厂 电子分析天平 上海良平仪器仪表有限公司 微量移液器 德国公司 . 上海精宏仪器制造有限公司 型电热恒温鼓风干燥箱 型快速恒温水箱 常州国华电器有限公司 超纯水系统 上海康路医疗设备厂 立式压力蒸汽灭菌器 医用净化工作台 苏州净化设备公司 酶标仪真空采血管。勉 美国 一?低温冰箱 三星 .?超低温冰箱 微波炉 荧光定量仪 美国 方法 .研究对象 病例组:选取年月至年月徐州医学院附属医院介入科经确诊 并住院的患者,排除因外来肿瘤、囊肿压迫所致继发性,同时排除合并 冠心病、糖尿病、肾病综合征、重度营养不良、肝炎活动期者,入院者经彩色多普 勒超声及肝静脉/下腔静脉造影金标准确诊,共纳入符合标准者例; 对照组:按照成组配对原则选取同期于徐州医学院附属医院体检中心体检的健 康者,要求自述无疾病史,无手术史,体检各指标正常者,共纳入健康对照例; 徐州医学院硕士学位论文 .研究方法 研究技术路线图见图。 图研究技术路线 、 ..病案信息的收集及问卷调查 患者入院当天即对其进行面对面问卷调查,问卷由课题组自行设计,内容涉 及个人基本信息、现病史、生活习惯、既往史、医院各项化验指标包括血常规、 生化检查、凝血功能、病毒全套、癌抗原检测等。健康对照组同样进行面对面问 卷调查,问卷除现病史外,其余内容同病例组问卷。 .. 提取血样收集 例病例及例对照每人抽取肘正中静脉血于真空采血管 .抗凝中,.?低温冰箱保存,以备全血中基因组的 提取; .. 血浆采集 年月至 年月入院的例.及相应 例对照每 人多抽取静脉血,新鲜血液于离心机中,进行水平离 心,离心后巴氏管取上层淡黄色透亮液体分装于冻存管中,.?超低温 徐州医学院硕士学位论文 冰箱冷冻保存备用; ..全血基因组的提取 采用树脂型基因组提纯试剂盒提取。基本原理:在高盐状态下, 纯化树脂专一性地吸附;而在低盐或水溶液状态下,很容易被洗脱下来。 此法快速简便,安全性高无需氯仿等有机试剂,提取的纯度和浓度均较 高。 操作步骤: ?将全血轻轻混匀,转移. 全血到纯化树脂中使用前充分混匀, 颠倒混匀次。室温下温育,其间颠倒混匀一次,快速离心,收集沉淀; ?用 结合液将纯化树脂悬浮,颠倒混匀,快速离心,收集沉淀: ?用. 漂洗液漂洗纯化树脂两次,颠倒混匀,快速离心,收集沉淀。 如果纯化树脂仍然呈现黄色或褐色,重复第步一次; ,倒掉废 ?用. 无水乙醇悬浮,装入离心纯化柱, 离心 液收集管中的乙醇, 再离心,尽量除尽乙醇; ?将离心纯化柱套入一个干静的.离心管中,开盖放置使乙醇挥发 干净。加入?缓冲液于纯化树脂上不能粘在管壁上,室温下放置, 离心; 如果对基因组的需求量较大,可重复第步~次,这样可以获得高产 量的基因组。缓冲液的用量根据对浓度的要求而定。离心纯化柱放入离心 管中,若盖不上盖子,可开盖离心; ?离心管中收集的液体即含有洗脱下来的基因组,.保存备用; 。. 检测浓度及纯度 ?取 缓冲液加于检测基座上,调零; ?取上一步提取的样本加于检测基座上进行检测,可获得浓 度与纯度以/表示,浓度以/为佳,纯度要求在.仁.之 间;定量后的于.保存备用; 徐州医学院硕士学位论文 . 浓度 检测血浆中 试剂盒选取美国试剂盒货号:.,操作步骤 完全按照厂家进行; ..试剂稀释准备 :取 ./ ,加入.的 ,共计 ,于涡旋器中混匀,浓度为/备用; 标准品稀释: ?向固体粉末中加超纯水,静置,浓度为/; ?取. ,于涡旋器中混匀,浓 。 /标准品,加入 度为./; ?取 ./标准品,加入,于涡旋器中混匀,浓 度为/,该浓度为; ?取标准品,加入 ,于涡旋器中混匀,浓度 为/,该浓度为: ?取标准品,加入 ,于涡旋器中混匀,浓度 为/,该浓度为; ?取标准品,加入 ,于涡旋器中混匀,浓度为 /,该浓度为; ?取标准品,加入 ,于涡旋器中混匀,浓度 为./,该浓度为; ?取标准品,加入 ,于涡旋器中混匀,浓度为 ./,该浓度为; 犁稀释:取 ,共计 ./ ,加入 ,于涡旋器中混匀,浓度为./,备用; 稀释:原浓度稀释倍,根据实际用量取样稀释备用; 封闭液制备:取 ,加入 溶液,电子天平称取。徐州医学院硕士学位论文 中,另取. 加入以上混合物中,溶解混匀,备用; 以上各浓度溶液均为现配现用,忌冷藏冻融; ..包板检测 取洁净孔板一块,每孔加入 /,加样过程中注 意不要碰壁,不能有气泡产生;加样后,于板上层覆一层膜,置于。冰箱; 后取出孔板,甩净板中液体,每孔 清洗孔板,重 复一次,分别于洁净滤纸上扣干; 每孔加入封闭液,加膜封板,室温下静置; 甩净液体,每孔加入混合液,摇床摇后甩 净扣干液体,重复此操作次; 标准孔?加入标准品?,其余各孔加入待检样本,每孔均加入 ,室温下静置; 重复步骤; 每孔各加 ./?,室温下静置; 重复步骤; 每孔各加稀释倍后的,室温下静置; 重复步骤; 每孔加入,避光反应,每孔加入终止液终止反 应,上机检测,绘制标准曲线,计算浓度。 . 样本基因分型?.探针法本实验于江苏省人民医院心脏科 实验室完成; 探针法是高度特异的定量技术,其技术核心是利用酶的’ 一 外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板结合是特异 性 结合,所以荧光信号强弱就代表了模板的数量; 在探针法的反应体系中,包括一对引物和一对探针。探针 只与模板特异性的结合,其结合位点在两条引物之间。探针的’端标记有报 告基徐州医学院硕士学位论文 团,,’端标记有荧光淬灭基团,。当探针完整的时 候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着 的进行,酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其’一’外切核酸酶 就会将探针切断,报告基团与淬灭基团分离,其能量不能被吸收,即产生荧光 信 号。 基因多态性研究,样本量越大越有说服力,因此多态研究的样本来源于 课题组收集到的总样本, 样本例,健康对照例;本研究涉及到的探针全部从 公司直接订制,应用 进行分型。 样本准备:探针法进行基因分型对于样本要求浓度 一致以确保分型结果的准确性;首先采用对所有样本进行浓 度与纯度检测,而后将所有样本稀释至/,每个样本取于.八联管 中,待用; 基因分型引物序列 序列 引物名称蝴 实验采用反应体系,具体反应体系及上机流程如下所示;徐州医学院硕士学 位论文 :反应体系及上机流程 反应体系配制 .. . .. 结束后,设置. 控制软件, 功能,扫描荧光信号,分析数据生成分型散点图 选择? 。 .统计学分析 整理调查问卷、病历及实验结果等资料,对数据进行双录入 .,.软件进行统计学分析。定性资料以构成比、率表示,定量资料以 均数标准差或中位数及四分位数间距表示。定量资料两组样本的比较采用两 独立 检验,三组定量资料比较采用方差分析或 样本检验或. 检验,构成比的比较采用卡方检验;多因素分析采用多因素 回归分析,患病危险以及%表示,给出确切值三位小数,检验水准 口.。徐州医学院硕士学位论文 结 果 傍病例与对照的基线资料比较 .基本临床资料 按照研究对象的纳入与排除标准,共收集例病例与例对照,其中病 例组男例.%,女性例.%,男女性别比.:,与中国男女患 者比例相一致:例中年龄最大者岁,最小者岁,平均年龄..? ..岁;健康对照组性别比例与病例组一致,平均年龄..?.岁, 年龄、性别构成两组间差异均无统计学意义。 病例组例有明确分型者例,其中下腔静脉型例.%,/, 肝静脉型例.%,/,混合型例.%,/,下腔静脉型所 占比例最高,与国内病例亚型一致,其余临床特征见表。 表病例组临床表现、生活习惯汇总 指拯 曼 墨竖;巡 昱性【竖巡 玄性【竖;巡 ./ ./ ./ 腹壁静脉曲张 ./ ./ 腰背部静脉曲张 ./ 食管静脉曲张 ./ ./ ./ 下肢水肿 ./ ./ ./ 下肢静脉曲张 .陀 ./ ./ 。/ ./ 下肢色素沉着 ./ 面背部色素沉着 ./ ././ 下肢溃疡 ./ ./ ./ ./ ./ ./ 皮肤黄染 乏力 ./ ./ ./ ./ ./ ./ 门脉高压 肝脏肿大 ./ ./ ./ ./ ./ 肝硬化 ./ 徐州医学院硕士学.论文 ./ ./ ./ 脾肿大 ./ ./ ./ 腹水 ./ ./ ./ 移动性浊音 ./ 腹部膨隆 ./ ./ ./ ./ ./ 腹部压痛 ./ 反跳痛 ./ ./ ./ ./ ./ 吸烟 饮酒 ././ ./ .实验室检查结果分别见表、; 表病例组与对照组生化指标比较 注:表格中各指标均为非正态资料,采用中位数及四分位数间距描述其集中 和离散趋势。 :谷草转氨酶::谷丙转氨酶;:谷氨酰转肽酶;:碱性磷酸酶;: 总胆红素;:直接胆红素;:总蛋白;:白蛋白;/:白球比值;:徐州医学院硕士学 位论文 肌酐;:葡萄糖;:总胆固醇;:甘油三酯。 表病例组与对照组血常规检查结果比较 注:表格中各指标均为非正态资料,采用中位数及四分位数间距描述其集中 和离散趋势。 %:中性粒细胞百分比:%:淋巴细胞百分比; %:单核细胞百分比;%: 嗜酸粒细胞百分比; %:嗜碱粒细胞百分比;:血小板分布宽度; :平均 血小板体积;:白细胞计数。 .基线资料 年月至年月,按照纳入排除标准,共收集新发病例例, 其中男性.%例,女性.%例,平均年龄.?.岁;健 康对照例,男性.%例,女性.%例,平均年龄.. 岁; 例有准确临床分型结果者例,其中下腔静脉型.%,/ 例,所占比例最高,下腔静脉型中膜性阻塞占.%/:肝静脉型.%, /例,混合型.%,/例;临床首发症状出现最多的是腹胀.%, /,其次为腹壁静脉曲张.%,/;病程最短天,最长达 年,平均。。年;其他临床特征见表及图。徐州医学院硕士学位论文 腹壁静脉曲张 ./ .趁 .陀 ./ 腰背部静脉曲张 ./ ./ ./ 食管静脉曲张 ./ ..陀 下肢水肿 ./ ./ ./ 下肢静脉曲张 。/ ./ ./ 下肢色素沉着 ./ ./ ./ 面背部色素沉着 ./ ./ ./ ./ 下肢溃疡 ./ ./ ./ 皮肤黄染 ./ 。/ 乏力 ./ ./ ./ 门脉高压 ./ ./ ./ 肝脏肿大 ./ ./ ./ 肝硬化 ./ ./ ./ 脾肿大 ./ ./ ./ 腹水 ./ ./ ./ 徐州医学院硕士学位论文 图 例临床特征分析 .浓度检测结果分析 ..病例对照整体比较 浓度,结果稳定,标准曲线理想;经过两 采用进口试剂盒检测 独立样本检验分析显示,组血浆 浓度均值为../,低 于健康对照组.?./,两组差异有统计学意义.,., 见图:且两组血浆浓度差异亦有统计学意义卢.,., 组浓度.?.低于对照组.?./;两指标相关分析 呈高度正相关.,.; ..病例与对照组中不同亚组间比较 按照性别、年龄、吸烟及饮酒状况对病例组与对照组进行分组,分别比较各 徐州医学院硕士学位论文 亚组中 浓度差异,见表。其中及对照组中饮酒组浓度均高于非饮酒 组,但对照组中比较差异无统计学差异;对照组中男女亚组浓度比较,女性健 康 浓度高于男性,差异有统计学意义,组男女亚组浓度无差异。 者 组及健康对照组中不同年龄段亚组比较差异均无统计学意义,对照组中随着 年龄 浓度有增加趋势,但未达到有统计学意义程度,组中无此趋势, 增加, .岁年龄组浓度率高于其余两个年龄段组,差异亦无统计学意义。 表病例组与对照组不同亚组浓度比较 注: 为不同亚组中浓度比较结果;为对照组不同亚组中浓度比较结果。 .. 不同亚组间比较 对不同亚组之间浓度比较,发现不同性别间、疾病亚型之间、不同肝功 能级别间、新发病例与复发病例间及是否合并肝硬化患者之间浓度比较差异 均无 浓度低于健康组与肝功能受损无关,详见图?。 统计学意义,推断中 徐州医学院硕士学位论文 其中肝功能分级按照临床常用肝功能判别指标得分进行分级,评分纳 入指标包括:是否合并肝性脑病、腹水、总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间 延长 五个指标,分以上为级,分为级,小于分为级。 ..不同基因型之间浓度比较 根据多态位点分型结果,将例分为三个亚组:组, 组,组,不同亚组之间浓度比较,差异无统计学意义.。 ..对影响 浓度的因素进行回归 对临床生化指标与血常规及生活习惯等指标进行单因素回归分析, 浓度作为因变量, 浓度是否高于./分两组:?./组 及?./组,?./组作为参照组,分析发现、舡、、、、 、、、、、、%、%、%、%、、 、、、、、、、、共个有意义指 标;将上述个定量指标均纳入进行多因素回归分析,采用基于条件参数估计 浓度的保护性因 的前进法,得到回归方程,及%为血浆中 素详见表。 表影响血浆 浓度的多因素回归分析 徐州医学院硕士学位论文 图不同亚组浓度比较 注:其中为病例组与对照组的浓度比较;为中男性与女性患者浓度的比较;为 不同亚型浓度比较;为新发病例与复发者浓度比较;为是否合并肝硬化浓度 比较; 为不同肝功能级别中浓度比较徐州医学院硕士学位论文 分型结果分析 基因分型及等位基因频率比较采用进行基因分型,分型结果稳定, 散点图见图;纳入群体该位点经过平衡检验,尸.,符合 遗传平衡定律,具有群体代表性。 .基因型分布比较 ..病例组与对照组比较 野生型纯合子为,杂合子,纯合子突变型,组.% 例,.%例,.%例,对照组.%例, .%例,.%例,比较差异有统计学意义.,.; 单因素回归分析,以野生纯合子为参照组,分析基因型与 关联,因变量为是否患病, .%:.?.,.。以 为参照组,分析与关联,.,无意义,见表。在 调整了性别、年龄、吸烟、饮酒、经济状况及文化水平后,廿与仍 有关联,.%:...,.,即携带等位基因的基因 型为的保护性因素。 图 基因分型散点图 .. 内不同分组之间基因型比较 按照阻塞部位不同分成不同疾病亚型,三种亚型患者中基因分型构成比比 较, .,.,.其他分组比较结果详见表;以对照 差异有统计学意义 组为参考,个体基因型为相对于而言,患型危险降低 .%.%..%,最小等位基因为保护性因素。相对于男性而言,等位基 因对女性影响较大,与对照比较,个体基因型为相对而言,患 危险性降低.%.%..%。徐州医学院硕士学位论文 表不同组别基因型分布比较 注:频率为等位基因的频率,为下腔静脉型,为肝静脉型,为混合型; 为野生纯合基因型,为杂合基因型,为最小等位基因纯合基因型,为不同亚组 分 别与对照组进行基因型分布比较结果。 .不同基因分型特征比较 病例对照组实验室指标比较结果详见表。 表不同基因分型中差异有统计学意义生化及血象指标 徐州医学院硕士学位论文 论 讨 近年来在中国报道例数不断增加,徐州医学院附属医院、郑州大学附属 医院、西京医院均己建立具有一定规模的诊疗中心,病源逐年增多,一方面 由于诊断技术的进步,大量未能明确诊断的患者被确诊;另一方面上述治疗 中心 在国内技术领先,病源丰富。本课题研究对象主要来自徐州医学院附属医院 介入 科,纳入研究患者主要来自徐州及周边地区皖南、鲁西北、豫南,男女所占比 例差别不大,以.岁中年人群为主,疾病类型以下腔静脉型所占比例最高,与 国内其他报道一致】。对于疾病的临床表现不同疾病亚型有所不同,下腔静脉 型中腹壁静脉曲张、下肢水肿、脾肿大较多见,肝静脉型中腹水最为常见, 混合型以腹壁静脉曲张所占比例最高,其次为乏力、脾大、下肢水肿。西方 国家 以肝静脉型为多,临床表现多见三联症:腹痛、肝大、腹水,下腔静脉型较 少,其中膜型阻塞更为罕见。 对于病因研究西方国家开展较早,多集中在凝血系统及两方面,多项研 突变、 究表明%以上患者携带个以上促血栓形成危险因素,如 突变、、蛋白/缺乏、口服避孕药等。近年来,国内对 研究报道不断增多,但多集中在临床特征分析、疾病诊断、介入治疗方面, 单纯病因研究报道较少。对于西方研究人员提出的可能病因,本课题组进行了验 证,发现国内患者中无 、突变发生【】,且对于西方国家研 究的热点突变在国内患者中发生率较低,朱子清在其论文中的检出率 为.%/,与西京医院祁兴顺研究结果接近【,但均远低于西方国家相 关报道。祁兴顺亦对国外已报道危险因素进行验证,除外均未见阳性 结果【?】。另外,山东大学郭成浩教授认为饮用水中高碘水平是发病危险因素, 并进行了一系列相关研列】;祖茂衡教授所在实验室亦发现高碘能够促进 血管内皮细胞增殖,且这种促进作用并非通过促进内皮生长因子表达,而是与丝徐州医学院硕士学位论文 裂原活化蛋白激酶激酶激活有关【,,但该理论并未在患者内 皮细胞中得到验证,且部分患者并非来自高碘生活环境,因此该理论有待进一步 验证。 年 对于患者中蛋白质组的表达水平筛查发现了多个 表达有差异的蛋白,得到明确识别的为,并且在大样本中得到验证【。本 主要由肝脏合成, 研究结果证实在国内患者血浆中 低表达,但 主要特征是肝脏血液流出道受阻,因此肝功能会受到不同程度损伤,早在上 水平改 个世纪就有文献探讨 水平与肝脏纤维化的关系,推断 变是否为肝功能受损引起而非疾病本身所致鉴于此本研究比较肝脏功能级 别即 浓度差异,分析并未见差异,且合并肝硬化 不同分级下血浆中 浓度亦未见差异;考虑患病时间长短可能肝功能损伤程 与非肝硬化患者间 浓度比较,结果亦未发现差异, 度不同,故对新发病例与多次发病患者间 由此推断中 浓度降低可能并非由肝脏功能受损引起,应是疾病本身 ’ 所致。 一 水平与水平呈正相关。 是的主要结构蛋白,血浆 可通过与转运蛋白相互作用,促进胆固醇从外周组织向肝脏的转 同时也是的主要激活因子,影响血浆胆固醇的酯化,因此在胆 运; 固醇的逆向转运过程中起着关键性作用。近来法国学者 等就对 内皮细胞的保护作用进行了,主要通过抗炎、抗氧化、抗血栓形成作用 受体:、/、 保护内皮细胞,内皮细胞表达/ ?.,细胞表面表达不同受体介导/ 发挥不同作用【弱。 等研究发现通过下调凝血必备组织因子而限制内皮细胞的促凝活 及表达水平偏低,推测可能是其对内皮细胞 性,本研究发现中 保护作用下降,内皮细胞不断受到炎症损伤,从而引发血栓形成,反复出现狭 窄 阻塞;有文献提示阻塞首先形成血栓,而后由于长时间血栓刺激引起膜性增 及浓度降低, 生,形成膜性阻塞型,由此研究推断可能为血浆中徐州医学院硕士学位论文 对血管内皮细胞保护作用降低,从而引发血栓及膜性增生,导致发病,此种假 设 有待进一步在动物实验中进行验证。 水平的因素有很多, 影响血浆中 等研究显示每日饮酒, 持续周,血浆中 水平可以升高./】,本研究结果与上述结果一致, 及对照组饮酒组浓度均高于非饮酒组,但对照组差异无统计学意义,推测适 浓度,对患者作用略明显于健康人群,具体 量酒精可以提高血浆中 机制有待进一步研究。 可以 对于年龄与 浓度的关联,年 等研究发现 浓度随着年龄增长逐渐升高【,但本 作为中国汉族人口老龄化的标志物, 研究中组不同年龄段分组比较不存在差异,分析发现年龄岁及岁组 浓度随着年龄增长 浓度低于.岁组,说明患者不存在 浓度存在随年龄浓度增高趋势, 逐渐升高趋势,而健康对照组中不同年龄段 推断这种差异应该是由疾病本身所致。 本研究还首次发现在患者中血浆总胆固醇和血液中淋巴细胞百分比为 的功能之一就是将外周组织的胆固醇转移进入 浓度的保护性因素, 浓度降低则理 肝脏进行代谢从而起到抗动脉粥样硬化的作用【,,血浆中 论上总胆固醇浓度应该高于正常人群,但本研究中中总胆固醇浓度低于健康 人群,具体机制有待深入探讨。 水平 除了环境因素影响血浆中 水平以外,大量研究探索影响 的突变、多态位点】,其中研究比较多的是 基因启动子区域.位点 基因启动子区域等位基因 的/多态即位点,大量报道显示 和 和水平密切相关陬,基因型携带者血清 与血清 基因的表达和蛋白合 水平显著升高,并认为是碱基的置换促进了 的生成率在杂合子中显著低于野生纯合子,同时 成【。另有文献提示 体外实验发现等位基因伴有启动子活性降低,并且蛋白表达水平降低【。 基因启动子区域位点等位基因影 年研究发现徐州医学院硕士学位论文 年突尼斯学者在阿尔兹海默病患者中对 响不同亚型颗粒水平, 进行分型,结果发现等位基因与疾病发生危险无关,但是等位基因携带者中 /水平的影 水平偏低【,众多研究关于该多态位点等位基因对 响存在争议,本研究中按照 浓度是否高于正常界值./分两组,进行基 因分型与浓度的回归,分析发现两者之间无关联,即基因型 浓度无影响,考虑可能为种族性差异所造成或者在患者中存在未 对 知因素能够导致 低表达,值得进一步深入研究。 本研究有一个全新的发现即携带位点等位基因,可以降低易感 性。国内外众多报道基本都是围绕危险因素展开,但本研究发现的多态位点 对具有保护作用,这说明我国病因与西方国家很可能不同,同时我们提 基因序列中是否还存在其他对易感性有影响的位 出假设:所在 基因进行测序分析该方向值得进一步深入研究。 点,是否应该对于 ,并且发 近年有文献显示在卵泡液及胚胎早期分泌蛋白质组中识别出 在卵母细胞早期成熟分化过程中起到关键性作用,其在卵泡液中的浓度 现 与胚胎分化程度成反比【】,课题组在开展面对面问卷调查时发现小部分女性患者 不孕此部分文中未展示,此前推测应该是由于肝段下腔静脉或者肝静脉血液回 流受阻,引发生殖器官血液回流受阻,从而导致不孕,但在男性患者中未发现有 不育报道,所以此推断不能全面揭示该症状。另外本研究还发现在对照组中女性 浓度高于男性,而病例组中无此差异,由此可提出新的假设:是否女性不 浓度偏低,影响卵母细胞的发育及后期分裂该假设应该 孕是由于患者中 进一步深入验证。 在中的病因作用, 对于临床治疗来讲,若进一步机制研究明确 进行治疗同时血浆 可以通过口服他汀类药物降低水平,或者补充 水平可以作为诊断的生物标志物【,】; 浓度低于健 综上所述,本研究通过与探针发现中 康人群,且多态位点等位基因低表达,为病因研究提供了新的方向,徐州医学 院硕士学位论文 也为临床诊疗提供了新的角度和科学依据。由于种族与地域差异,对于以上 研究 结果有待在大样本病例人群及不同诊疗中心进行验证,并进行深入的机制性 研究。徐州医学院硕士学位论文 论 结 本实验条件下: 低表达,其低表达与肝脏功能级别、性别、年龄、发病次 .患者中 降低可能是疾病本身所致,应开展进 数、是否合并肝硬化无关, 一步深入研究; 浓度与 浓度保护性因素, .血浆中及%为 基因型分布无关; .等位基因携带率在中偏低,携带等位基因能够降低易感 性; .本次研究纳入的患者,下腔静脉型所占比例最高,与国内亚型构成 一致,患者无年龄、性别特异性,病例组与对照组在生化、血象、癌抗原等指 标中存在差异,可以为临床诊断、治疗效果评价提供参考; .下一步研究若明确在病因中作用,可以将作为诊断 浓度进行治疗。 指标,临床治疗可以通过提高血浆
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