HPLC测定肤康搽剂中苦参碱含量

HPLC测定肤康搽剂中苦参碱含量 赵冰、郑家富、彭秀中、王晓斌、井文广 摘要:目的 测定肤康搽剂中的苦参碱含量。方法 采用HPLC法测定肤康搽剂中苦参碱的含量。结果 采用高效液相色谱法对苦参碱进行了含量测定，苦参碱在0.03,0.48μg范围内峰面积与进样量有良好的线性关系，γ=0.99995。回归方程为Y=62010X+530205。平均回收率为100.1%。结论 方法专属性强，重现性好，回收率良好，可有效控制肤康搽剂的质量。 关键词:肤康搽剂;HPLC;苦参碱; 肤康搽剂收载于国家，由苦参、黄连、红花、川芎、丁香、人参等十三味药材组成，具有清热燥湿，疏风止痒。临床常用于用手湿疹，痤疮，花斑癣属风热温毒证者。为更好的控制产品质量，本实验采用HPLC法对方中苦参进行了含量测定。 1 试验仪器与材料 1(仪器与试药 仪器:LC-10ADvp高效液相色谱仪(日本岛津)。依利特牌C色谱柱 (5µm， 18250mm×4.6mm ID);紫外检测器; 756CRT紫外分光光度仪(上海分析仪器厂)。 试药:肤康搽剂样品(安徽华佗国药股份有限公司生产)，苦参碱对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号110702-200126，供含量测定用);乙腈为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司);水为二次蒸馏水;其余试剂为分析纯。 2 方法与结果 2.1(色谱条件的确定 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇一乙腈一磷酸盐缓冲液pH6. 86) -三乙胺(15:25:65:0.1)为流动相;检测波长为220nm;理论板数按苦参碱峰计算应不低于1500。 2.2 阴性干扰性检查 按本制剂处方组成，制备不含苦参的阴性空白制剂，制得阴性对照溶液，分别精密吸取阴性对照溶液、对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪。结果明，阴性对照溶液色谱中，在与苦参碱对照品色谱峰处无相应色谱峰出现，而供试品溶液中在苦参碱峰处有峰出现，说明对苦参碱的测定无干扰。 2.3 对照品溶液的制备 精密称取置减压干燥器内用五氧化二磷干燥24小时以上苦 参碱对照品，加甲醇适量使溶解，并用甲醇定容至刻度，摇匀即得，C对:0.48mg/ml。精密吸取上述溶液0.62ml置10ml量瓶内，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，C对:0.062mg/ml。 2.4 供试品的处理方法 精密量取本品50ml(蒸至无醇味(约l0ml)，分次加0.5mol/L盐酸溶液30ml，加热使溶解并移至分液漏斗中，用醋酸乙酯洗涤3次，每次20ml，水液用12.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，合并三氯甲烷液，用0.5mol/L盐酸溶液振摇提取3次，每次20ml，合并0.5mol/L盐酸溶液，用12.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷5ml使溶解，通过中性氧化铝柱(10g，内径lcm，长15cm，流速每分钟1.5ml)，用三氯甲烷一甲醇(10:1)混合溶液洗脱，收集洗脱液100ml，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 2.5(精密度考察 按所选定的供试品溶液的制备方法制备供试液，精密吸取同一供试品溶液10μl，重复进样5次，注入液相色谱仪，测定苦参碱峰面积值，结果见表2。 表2 精密度测定结果 实验次数 1 2 3 4 5 峰面积 3954825 3918297 4035680 3996872 4019602 RSD=1.2%，结果表明精密度良好。 2.6 线性关系考察 精密称取苦参碱对照品7.52mg，置25ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，精密吸取2.5ml，置25ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀(C对=0.030 mg/ml)，分别精密吸取1、2、4、8、16µl注入液相色谱仪，测得的峰面积值见表3。 表3 苦参碱线性关系测定结果 进样量(µg) 0.03 0.06 0.12 0.24 0.48 峰面积值 1956061 3934720 7570199 15046150 30365932 以峰面积值(Y)对进样量(X)进行回归，得标准曲线方程Y=62010X+530205，r=0.9999。以峰面积值(Y)对进样量(X)作图(见下图)。以上结果表明，在0.03,0.48µg范围内，人参皂苷Rg1峰面积值与进样量有良好的线性关系。 2.7 重复性考察 按标准中的含量测定方法，取同一批样品56份，分别按照供试品溶液的制法制备供试液，按拟定的色谱条件测定苦参碱的含量，结果见表4。 表4 重复性试验结果 实验号 1 2 3 4 5 苦参碱(mg/g) 6.768 7.19 7.42 6.85 7.10 苦参碱含量RSD=3.7%，结果表明重复性良好。 2.8 稳定性考察 按所选定的供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，分别在0，、3、6、12、24小时进样，测定供试品溶液中苦参碱峰面积，结果见表5。 1 表5 稳定性试验结果 测定时12 0 1 3 6 24 间 苦参碱4585940 4617000 4640376 4542260 4602430 4695946 峰面积 RSD=1.2%。结果表明样品在24小时内稳定性良好。 2.9 (加样回收率试验 取一批成品按所选定的供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液。分别对照品溶液(C对=0.25mg/ml)0.5ml、0.5ml、1ml、1ml、1.5ml、1.5 ml和供试品溶液注入液相色谱仪。测定人参皂苷Rg1的含量为16.3mg/g。取此批样品约0.05g，共6份，精密称定，分别在其中精密加入浓度为0.3139mg/ml人参皂苷Rg对照品溶液12.0ml，挥干溶剂，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，照样品测定法测定人参皂苷Rg1的含量，以下列公式计算回收率，结果见表6。 测得量(mg)-样品中含量(mg) 回收率(%)= ×100% 加入对照品量(mg) 表6 回收率试验结果 取样量 样品中苦参加入对照品测得苦参碱总回收率 试验号 (ml) 碱(mg) 量(mg) 量 (mg) (%) 1 30 0.2119 0.125 0.3424 104.4 2 30 0.2119 0.125 0.3390 101.7 3 30 0.2119 0.250 0.4580 98.4 4 30 0.2119 0.250 0.4648 101.2 5 30 0.2119 0.375 0.5793 98.0 6 30 0.2119 0.375 0.5794 98.0 平均值(%) 100.3 RSD(%) 2.6 结果表明，平均回收率为100.3%，RSD=2.6%，加样回收率良好。 2.10(三批样品测定 按已确定含量测定的方法对三批样品苦参碱的含量进行测定，结果见表7。 表7 样品中苦参碱含量测定结果 苦参碱含量(μg/ml) 批号 1 2 平均 1 5.42 5.45 5.4 2 5.72 5.76 5.7 3 6.92 6.94 6.9 根据上述三批样品测定结果，建议确定肤康搽剂中苦参碱含量(本品每1ml含苦参以苦参碱计，不得少于40.0μg)。 3、讨论 3.1 样品经盐酸酸化，乙酸乙酯脱酯后，采用酸碱溶液反复转溶除去杂质，三氯 甲烷提取后的三氯甲烷液水浴蒸，甲醇溶解后进行分离测定，结果表明杂质较多， 达不到基线分离，必须增加必要的分离纯化步骤以除去杂质。本文采用此方法，分 离度好。 3.2 待进一步研究同时测定苦参中苦参碱和氧化苦参碱成分。 参考文献: [1] 吴金英，孙建宁.复方石韦片的主要药效学试验研究.中成药2000，22(6):428. [2] 中成药质量标准与标准物质研究.王宝琴.中国医药科技出版社，1994. [3] 常用中草药有效成份含量测定.陈发奎.人民卫生出版社，1997.