【word】 枯草芽孢杆菌发酵火麻仁粕的研究

【word】 枯草芽孢杆菌发酵火麻仁粕的研究 枯草芽孢杆菌发酵火麻仁粕的研究 2011年第8期 总第36卷 中国调味品 CHINACoNDIMENT试验研究 枯草芽孢杆菌发酵火麻仁粕的研究 林金莺,曾庆祝,安琪 (广州大学化学化工学院,广州510006) 摘要:采用枯草芽孢杆茵液体发酵火麻仁粕.结果表明,底物浓度为5(w/w),枯草芽孢杆菌添加量 15(v/v),转速180r/min,碳源为1.5(w/v)红糖,无机氮源NH4Cl1(w/v),0.1MnS04. HO,发酵温度37?,发酵30h时多肽得率最高达5O.5,而发酵42h时则游离氨基肽氮最高,达 5.38,氨基酸分析,此时发酵物的游离精氨酸占游离氨基酸的28.9,占总蛋白质的4.44.枯草 芽孢杆茵是多肽或调味料潜在的生产应用. 关键词:枯草芽孢杆茵;火麻仁;液体发酵;精氨酸 中图分类号:TS201.3文献标识码:B文章编号:1000--9973(2011)O8—0031--06 ResearchontheliquidfermentationofhempseedmealbyBacillussubtilis LINJin-ying,ZENGQing-zhu,ANQi (SchoolofChemistryandChemicalEngineeringGuangzhouUniversity,Guangzhou510006,China) Abstract:Hempseed(CannabissativaL.)fermentedbyBacillussubtiliswasstudiedinthispaper. Themaximumpeptideproduction(50.5)wasobtainedbythehempseedmeal(59,6,w/w)supple— mentedwithstrainvolume(15,v/v),rotationspeed(180r/min),brownsugar(1.5,w/v), NH.CI(1,w/v)andMnSO’?H2O(0.1)at37? incubatedfor30h,whilethefreeaminoni— trogenashighas5.38at42hincubationandthefreearginineaccountfor28.9bythetotalfree aminoacidsand4.44bythetotalproteincontent.Itshowsthatapotentialmethodforthemanufac— turingofpeptideorseasoningbyBacillussubtilis. Keywords:Bacillussubtilis;hempseed;liquidfermentation;arginine 1概述 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是制造豆制品 重要的微生物,其应用可追溯到一千多年前,日本 平安时代就开始使用枯草芽孢杆菌生产传统纳 豆[1],纳豆不仅富含丰富的多肽和氨基酸,而且发 酵物的功能得到改进,含有的纳豆激酶具有溶血栓 和降血压功效[z]. 枯草芽孢杆菌的酶系特别丰富,在生长代谢过程 中分泌大量的多种胞外蛋白酶,如中性蛋白酶,碱性蛋 白酶,羧肽酶,氨肽酶等,发酵周期较短,相对耐高温, 生产难度小和成本低等特点,使得枯草芽孢杆菌在发 酵制品中得以应用.也有报道利用该菌种来制备功能 制品,如抗氧化肽[3]和降血压肽等. 本研究的目的是采用枯草芽孢杆菌进行液体发酵 火麻仁粕制备调味料和多肽的研究,因为火麻仁蛋白 质是优质蛋白质,且富含精氨酸,通过枯草芽孢杆菌发 酵以提高产物的功能特性,赋予更高的营养价值.本 文从料液比,菌种添加量,转速,培养温度,氮源,碳源 来探索最佳多肽和游离氨基肽氮得率的条件. 收稿日期:2011一O3一O2 作者简介:林金莺(1963一),女.副教授.研究方向:发酵食品和功能性 食品. 一 31— 2011年第8期 总第36卷 中国调味品 CHINACONDIMENT试验研究 2材料与方法 2.1试验原料 2.1.1材料 火麻仁购于广州清平市场,去壳,粉碎,过筛并用 乙醚提取后置于冰箱中备用. 2.1.2主要化学试剂 牛肉膏粉,蛋白胨,营养琼脂,牛血清,可溶性淀 粉,葡萄糖,甲醛,三氯乙酸,氢氧化钠,氢氧化钾,硫酸 铜,硫酸钾,氯化钾,氯化钠,甲醛,四氯化碳,MgSO. ?7H20,CaCl2.?H2O,MnSO4?6H2O,FeCI3? H2O,FeCI2,NH4C1,NaNO3,NH4NO3,磷酸氢二钠, 磷酸二氢钠等.所用化学试剂均为分析纯. 2.1.3试验菌种 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),由广州大学生 命科学院保藏在LB琼脂.使用前复壮三次. 2.1.4培养基 斜面菌种培养基:蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化 钠5g,琼脂15g,蒸馏水1000mL,最终pH7.0dz0.2. 液体发酵培养基:在100mL锥形瓶中加入5火 麻仁粕(经5O?,pH8.5,提取时问为60rain),装液 量为50mL,并加入0.5g红糖粉,玻璃珠数颗,调pH 值至7.0,经121?灭菌15min备用. 2.2仪器设备 立式自动电热压力蒸汽灭菌锅,电热恒温培养箱, 冷冻离心机,旋转蒸发器,电热鼓风干燥箱,数控消化 炉,恒温磁力搅拌器,数显pH计,紫外一可见分光光度 计,真空冷冻干燥机,高压液相色谱仪. 2.3枯草芽孢杆菌发酵方法 2.3.1枯草芽孢杆菌种子的制备 用比浊法’测得枯草芽孢杆菌的生长对数期为 24h.一接种环将储备的枯草芽孢杆菌转移到内装 5OmL液体培养基(蛋白胨,10g/L;酵母提取物, 3g/L;NaCI,10g/L;pH7.0)250mL三角锥瓶中,转 速为180r/rain,温度35?,培养时间为24h,在4? 条件下以转速8000r/rain将枯草芽孢杆菌与发酵液 分离,时间为10min.用0.85NaC1洗涤,将菌体 悬浮于同体积的0.85NaC1溶液中,4?备用. 2.3.2底物浓度对多肽得率的影响 一 32一 将火麻仁粕配成3,5,7,9,l19,6(w/v) 的培养基于35?摇床培养24h,转速为180r/min,发 酵结束后100?灭菌5min.发酵液于8000r/min离 心10min,除去沉淀物,定容至50mL.测定TCA_可 溶多肽含量并计算得率. 2.3.3枯草芽孢杆菌添加量对多肽得率的影响 根据上述得出最佳火麻仁粕含量的结果,枯草芽 孢杆菌的添加量分别为5,10,15,20(v/v)来 研究对多肽得率的影响,其余条件与上相同. 2.3.4转速对多肽得率的影响 摇床转速分别为120,150,180,210r/min来研究 多肽得率的影响,其余参数是最佳发酵条件. 2.3.5发酵温度和发酵时间对多肽得率的影响 发酵温度分别是3O,33,37,4O,43?.每6h取 出1瓶,发酵时间为54h.保持在最适条件下发酵. 2.3.6碳源对多肽得率的影响 分别添加的碳源为红糖,葡萄糖,蔗糖,可溶性淀 粉,味精,柠檬酸,甘油,并进行空白试验对照.总浓度 控制在2Og/kg发酵液. 2.3.7氮源对多肽得率的影响 分别添加定量的NH{C1,NaNO3,NHNO.无机 物作为发酵氮源,并以空白作为对照,添加量为 5g/kg. 2.3.8矿物质对多肽得率的影响 分别在培养基添加MgSO?7H2O,CaC12 2H2O,MnSO4?6H2O,FeC13?H2O,并以空白作为 对照. 2.4测定方法 2.4.1多肽和游离氨基肽氮含量的测定 发酵液以等量2O三氯乙酸溶液沉淀后,上清液 用双缩脲法测得多肽含量.用甲醛法测得游离氨基肽 氮的含量. 2.4.2发酵物氨基酸测定 将样品酸解后采用HPLC测定.检测条件:美国 waters高效液相色谱,色谱柱:PICO-TAG氨基酸分 析专用柱,长度:150mrll~柱温:38?,检测波长: 254nm,流速:1mL/min,二元梯度洗脱测定氨基酸. 3结果与讨论 2011年第8期 总第36卷 中国调味品 CHINACONDIMENT试验研究 3.1发酵条件对多肽得率的影响 3.1.1底物浓度对多肽得率的影响 底物浓度对发酵得率起重要影响.若底物浓度过 小,发酵结束后得率低,若底物浓度过大,溶解氧浓度 变少,导致好氧的枯草芽孢杆菌的呼吸作用受到抑制, 甚至会影响微生物细胞膜内渗透压而生长缓慢.因 此,合适的底物浓度非常重要.为此,火麻仁粕的浓度 分别为3,5,7%,9,I1(w/v)进行比较,由图 1可知,火麻仁粕浓度从3到50A时,多肽得率升高, 但之后随着底物浓度的增加,多肽得率反而减少,因此 59,6底物浓度是合适的. 24 22 2O 18 矗l6 14 l2 10 l3579l1l3 底物浓度(%) 图1底物浓度对多肽得率的影响 Fig.1Effectofsubstrateconcentrationonpeptideyield 3.1.2枯草芽孢杆菌添加量对多肽得率的影响 冰 哥 瞳 督 O1O15 接种量(%) 图2摄种量对多肽得率的影响 Fig.2Effectofinoculationvolumeonpeptideyield 接种量是指移人的接种物液体体积(或质量)和接 种后发酵液体积(或质量)的百分比.接种量与菌种特 性,菌种质量和厌氧工艺条件有关.选定以总发酵物 59,6,109,6,159,6,209,6(v/v)的菌种体积,其结果由图2 可知,接种量从5,15,发酵液多肽得率最高,达 32,但随着接种量增多而多肽得率反而降低.因此, 15接种量是比较合适的. 3.1.3转速对多肽得率的影响 溶氧是影响微生物发酵的重要因素之一,枯草 芽孢杆菌是一类需氧,柱状,内芽孢的革兰氏阳性 茵.在深层液体培养中,氧气的供应往往是发酵能 否成功的重要限制因素之一,培养基因含有大量有 机和无机物质,氧的溶解度比在水中的溶解度更 低.这就决定了大多微生物深层培养需要适当的 通气条件,才能维持菌的生长繁殖.但是溶解氧浓 度对细胞生长和产物生成的影响可能是不同的,对 于细胞生长的最佳氧浓度,不一定就是产物得率的 最佳氧浓度. 影响氧浓度的因素有两个,一个是转速,另外一个 是装液量.本试验因装液量是固定的,故此设定120, 150,180,210r/min四种不同的转速来观测溶解氧浓 度对多肽得率的影响,试验条件是初始pH7.0,发酵 温度35?,时间为30h,接菌量为15,试验结果如 图3所示,当转速为120r/min时,多肽得率远低于 150r/min,当转速为210r/min时,多肽得率反而低, 因此180r/min为最佳转速. 静 《 嫡 90120150l80210240 转速(r/rain) 圉3转速对多肽得率的影响 Fig.3Effectofrotatespeedonpeptideyield 3.1.4发酵温度和发酵时间对多肽得率影响 考虑到发酵过程中温度和时间的相互影响,设定 发酵温度分别为33,35,37,40,43?,每6h取出1瓶 发酵液测定多肽得率. 温度是影响微生物发酵的最重要因素之一.一般 情况下,随着温度的升高,微生物的繁殖速度加快,但 , 33— 2011年第8期 总第36卷 中国调味品 CHINACoNDIMENT试验研究 是随着微生物生长速度的快速增加,伴随的却是菌体 衰老提前,酶失活速度加快.到了菌体的衰亡期,衰老 的细菌释放出色素,细胞代谢产物,毒素等,从而导致 发酵液pH改变,酶失活等,如果继续升高,则细胞功 能急剧下降以致死亡.试验结果如图4所示,发酵温 度从33?到37?,多肽得率随着温度的升高增加,因 为随着温度上升,枯草芽孢杆菌的酶活也升高,因而分 解的蛋白质越多.4O?发酵多肽得率还是比较高的, 仅在37?下,在43?时发酵活力非常差,是在所有发 酵温度中最差的.在37?条件下经30h发酵后的发 酵液中多肽含量最高,达34.89/6,所以选取37?,30h 为最佳多肽得率的发酵条件. 35 3O 25 术 20 塞15 1O 5 0 o612l8243036424854 发酵时间(h) 图4发酵时间和发酵温度对多肽含量的影响 Fig.4Effectofincubationtemperature andperiodonpeptideyield 3.1.5碳源对多肽得率的影响 碳源是菌体合成自身骨架的主要物质来源,也是 影响菌体生长和代谢合成的关键因素,而且某些微生 物需要在一定的限碳条件下才能高产特定的酶[5]. 40 30 哥20 瞳 基 l0 O 1234567 碳源(1%w/w) 图5A补充不同碳源对多肽得率的影响 一 34一 静 基 00.5l1.522.5 红糖浓度(%) 图5B红糖浓度对多肽得率的影响 Fig.5Effectofsupplementarycarbonsourcesonpeptideyield 注:1为味精;2为柠檬酸I3为红糖I4为可溶性淀粉;5为 蔗糖I6为葡萄糖,7为空白. 由于火麻仁本身不含糖和淀粉,因此培养基中必 需添加一定量的碳源作为微生物生长之用.按碳源与 总发酵液1(w/w)分别加入味精,柠檬酸,红糖,可 溶性淀粉,蔗糖,葡萄糖和空白分别试验,经30h发酵 后测得各发酵液的多肽得率如图5A所示. 由图5A可知,枯草芽孢杆菌对于试验所提供碳 源均能利用,其中以红糖和可溶性淀粉作为碳源更能 提高枯草芽孢杆菌产多肽的能力.红糖本身含有一些 矿物质,对于微生物来说,少量的矿物元素是必不可少 的,所以选定红糖作为以后发酵培养基的碳源. 根据上述试验结果,红糖对枯草芽孢杆菌发酵产 多肽有良好的影响,浓度过低,微生物营养不足,影响 发酵;浓度过高,渗透压过大,微生物易于死亡.因而 需要对红糖浓度的影响再做进一步研究,红糖浓度与 总发酵液的含量分别为0.5,1,1.5,2(w/w) 进行试验,试验结果如图5B所示,1.5%红糖(w/w) 是比较合适枯草芽孢杆菌的生长. 3.1.6氮源对多肽得率的影响 氮源是菌体合成自身蛋白质和遗传物质的主要来 源,也是代谢产物中氮元素的来源之一.因此火麻仁 粕富含有机氮源,因此本研究选择三种无机盐 (NHCI,NaNO.,NH.NO.)和空白分别作发酵培养 基的氮源进行研究,经30h发酵后取制成多肽液后测 得各发酵液的多肽得率,如表1所示. 由表1可知,本试验中枯草芽孢杆菌对无机氮源 的利用,NHCI为最好,但所有无机氮源都比空白好. 证明枯草芽孢杆菌发酵过程中除了需要有机氮源外, 2011年第8期 总第36卷 中国调味品 CHINACoNDIMENT试验研究 还需要一定量的无机氮. 表1不同氮源对多肽得率的影响 Table1Effectofsupplementarynitrogen sourcesonpeptideyield 注;根据不同的氮源统一为5g/kg(氮/火麻仁粕). 3.1.7矿物质对多肽得率的影响 无机盐在调节微生物的生命活动方面起重要作 用.按FeCI3?6H2O,MgSO4?7H2O,MnSO4? H.O,CaC1:?2H.O和空白(上述所有矿物质都是添 加0.05g)分别作发酵培养基的矿物质源经30h发 酵,多肽得率如图6所示,枯草芽孢杆菌对于试验所提 供矿物质均能利用,其中以Mn件和Mg.作为氮源更 能提高枯草芽孢杆菌的产多肽得率,这是因为Mn什, Mg抖是多种酶促反应的无机激活剂[6],是超氧化歧化 酶,L一阿拉伯糖异构酶等许多酶的辅助因子,对活菌和 芽孢有影响氨肽酶的结合离子[7],同时也是氨肽酶的 结合离子,所以选定Mn作为发酵培养基的主要矿 物质. 55 50 45 甜 霖 茁40 35 30 12345 矿物盐 围6补充不同矿物质对多肽得率的影响 Fig.6Effectofsupplementarymineralsaltsonpeptideyield 注:1为FeCI3?6H20;2为MgSO4?7H20;3为MnSO4 ? H2O;4为CaClz?2H20;5为空白. 3.2发酵周期对多肽和氨基肽氮得率的影响 发酵过程中游离氨基肽氮的得率不会与多肽 得率相一致,因此,在上述研究的最适发酵条件下, 每6h测定多肽与游离氨基肽氮的得率,目的是找 出最佳的制备多肽的条件和生产调味料原料的条 件. 图7所示,发酵从O,30h,随着发酵时间的延长 多肽得率是增加的,但之后得率则逐渐降低;而游离氨 基肽氮则在发酵前的30h是缓慢升高的,但之后升高 较多,在42h达到最大值.由此可知,如果制备多肽, 则发酵时间在30h最合适,若要生产调味品原料,则 发酵42h最好. 60 50 —40 霆30餐 2O l0 O O612l8243O36424854 发酵时间(h) ?龋嗽多肽得率(%)+氨基酸得率(%) 圈7发酵时间对多肽含量和氨基态氮含量的影响 Fig.7Effectoffermentedperiodonpeptideand animoacidsyield 3.3发酵物氨基酸分析 为了了解发酵物的氨基酸组成,测定发酵42h的 产物,结果如表2所示. 表2发酵产物中多肽得率和游离氨基酸的释放率 Table2Aminoacidcompositionoffermentedbydrolysates 一 35一 一一瓣孵锱醐]葶 65432lO 2011年第8期 总第36卷 中国调味品 CHINACoNDIMENT试验研究 续表2 注:发酵物是枯草芽孢杆菌发酵42h的产物. 必需氨基酸量:赖氨酸,色氨酸,苯丙氨酸,蛋氨 酸,苏氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,缬氨酸,组氨酸9种. 发酵物中,游离必需氨基酸占总游离氨基酸51.84%, 占总量的9.6,总必需氨基酸占总量的3O.91.发 酵后的产物与原蛋白质的氨基酸分布大致是一致的, 氨基酸的组成具有良好的平衡且必需氨基酸含量丰 富,说明发酵过程中火麻仁蛋白水解过程温和,并没有 改变原料蛋白的氨基酸组成,这个试验结果与其它论 文是一致的邙]. 分析游离精氨酸的含量,发现发酵物中游离的 精氨酸含量非常高,占游离氨基酸中的23.89,占 总量的4.44.而在比较试验中,酶解产物则游离 精氨酸只占游离氨基酸的9.1,占总酶解物的0. 7.所以采用枯草芽孢杆菌发酵所得产物精氨酸 含量很好. 如此高含量的游离精氨酸,是由于枯草芽孢杆菌 在发酵过程中通过精氨酸转录接收器,将有关氨基酸 生物合成精氨酸的缘故]. 关于精氨酸能够对高胆固醇引起的活性氧种类的 抑制有相关的报道[1,高胆固醇是以多种方式升高活 性氧种类的活性物质,口服15gL-精氨酸具有降低餐 后血脂升高引起的氧化应激和内皮细胞的失调[1?. 纳豆是用枯草芽孢杆菌发酵的,其发酵物能够溶解血 栓,现有商业产品. 枯草芽孢杆菌发酵蛋白质以制备多肽或功能调味 一 36一 料是一种潜在应用方法. 参考文献: I-1]SteinkrausKH.Classificationoffermentedfoods:world— widereviewofhouseholdfermentationtechniques[J].Food Control,1997(8):311—317. 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