从Cohn氏法组分Ⅲ沉淀纯化人凝血因子Ⅶ
从Cohn氏法组分?沉淀纯化人凝血因子? ?
论着?
中国输血杂志2006年1o月第19卷第5期ChinJBloodTransfusion,Qer!!.l_!!!
从Cohn氏法组分?沉淀纯化人凝血因子?
徐世洲赵青蓉林方昭肖玲肖小璞
(中国医学科学院中国协和医科大学输血研究所,i~tJ'l成都610081) 摘要:目的探索从Cohn氏法组分?(组分m)沉淀中纯化人凝血因子?(FVI)的
并对纯化产物进行鉴定.
方法将组分?沉淀溶解,经柠檬酸钡吸附,洗脱,硫酸铵沉淀,2次DEAE?SepharoseFastFlow离子交换层析和
SephadexG-IOO凝胶过滤纯化人FR.结果从400g组分?沉淀中最终得到10.1mg纯化的F?.活性为1775.8
U/mg,F?被浓缩了近6000倍,总活性回收率为17.6,SDS-PAGE电泳鉴定只有1条主条带.结论组分?沉
淀中有很高F?活性;建立了从组分?沉淀中纯化人F?的方法.
关键词:组分?沉淀,Cohn氏法凝血因子?纯化
中图分类号:R392-33R442.7文献标识码:A文章编号:1004—549X(2006)05—352—03
Isolationandpurificationofhumancoagulationfactor?fromCohnfraction?pasteXUShizhou,ZHAOQing
rong.LJNFangzhao,XIAOLing,XIAOXiaopu.InstituteofBloodTransfusion,ChineseAc
ademyofMedical
Sciense.Chengdu,Sichuan610081,China Abstract:0bjectiveToisolateandpurifyhumancoagulationfactor?fromCohnfractionmprecipitate.Meth- odsThepurificationprocedureofhumanfactor?
fromCohnfractionmprecipitateinvolvesdissolvingfraction?,
absorbingfactor?
ontobariumcitrateandduring,ammoniumsulfatefractionationandDEAE—
SepharoseFastFlow
ionexchangechromatography.andSephadexG-lOOgelfiltrationchromatography.Resultsl
O.1mgpurifiedF?was
obtainedfrom400gCohnfraction?precipitate.ThepurifiedF?
hasaspecificclottingactivityof1775.8U/mgand theoverallyieldofFVIspecificclottingactivityis17.6%ofthestartingmateria1.Thepurityof
FRwasjudgedby
SDS-PAGEandtherewasonlyoneproteinbandonthege1.ConclusionTheprocedureofpurif
ying?fromCohn
fractionIiiprecipitateisestablishedwithsatisfactorypurity.
Keywords:Cohnfractionmprecipitate~Coagulationfactor?;Isolation;Purification 凝血因子?(F?)又名稳定因子,是一种由肝
细胞合成的依赖维生素K的单链糖蛋白,含406个
氨基酸,分子量约60kD,有多个糖基化位点,等电点
4.9,血浆中F?的浓度仅为(O.5,2)mg/L,半衰期
为6,8h[?.F?是机体外源凝血途径的始动因子,
由F?参与启动的外源性凝血途径在生理性血栓形
成中具有较内源性凝血途径更为重要的意义L1].F
?的缺乏无论是原发性还是继发性的,都有可能造
成出血,甚至危及生命【2],F?不仅在生理止血方面
具有重要的作用,而且其血浆水平的高低,基因多态
性还与某些疾病的发生存在相关性.浓缩和纯化的
F?除用于基础研究外,用于F?缺乏的患者可相应
补充F?,纠正其出血倾向L2],用于制备相应的单克
隆抗体,还能利用F?与组织因子(tissuefactor,
TF)问有很强亲和力的特点,以F?亲和层析纯化
?通讯作者:肖小璞,主任技师,硕士生导师;Email:xiaopuxiao@
vip.sina.corn
TF【.笔者从Cohn氏法组分?(简称组分m)沉淀 中纯化人F?,为用杂交瘤技术制备F?单克隆抗 体,进而为研制F?检测试剂盒和大量纯化用于治 疗的人源性F?打下物质基础.
1材料与方法
1.1仪器与试剂uV,754分光光度计(上海
仪器厂);层析系统(瑞典Pharmacia公司);超滤器 (Micon);CA-50血凝仪(日本Sysmex公司); TEMED(Proemga公司);SDS(上海祥德精细华工 厂);丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,过硫酸胺(APS), F?缺乏血浆,F?缺乏血浆,蝰蛇毒,牛FX和F? 缺乏血浆(美国Sigma公司);SephadexG-100,DE— AE-SepharoseFastFlow,分子量标准(瑞典Phar— macia公司);F?缺乏血浆,PT试剂,APTT试剂, 正常参比血浆(中国医学科学院输血研究所);苯甲 脒(Ameresco公司),其他试剂均为国产分析纯. 1.2检测方法?F?,F?,F?,FX促凝活性(F
中国输血杂志2006年1O月第19器第5期
ChinJBloodTransfusion,October,2006,Vo1.19,No.5
?;C,F?:C,FIX::C,FX:C)检测按相应试剂 说明书;?SDS聚丙酰胺(PAGE)凝胶电泳按常规 方法;?紫外分光测蛋白含量按常规方法. I.3组分?沉淀的预处理【4]把400g组分?沉 淀用4000ml含0.15mol/L氯化钠,0.02mol/L柠 檬酸钠,0.02mol/LTris,0.01mol/L苯甲脒的 pH7.4的4?溶液溶解,3000g离心5rain除去不溶
物质.检测上清的蛋白含量,并检测F?,?,?,X 活性(FlI:C,F?:C,F?:C,FX:C). 1.4柠檬酸钡沉淀吸附蛋白【4上清在4"C超过 1h的时间里缓慢滴加lmol/L氯化钡40Oral,同时 磁力搅拌,等滴完后再搅拌30min,3000g离心 20min;沉淀悬于1600ml含0.1mol/L氯化钠, 0.02mol/L氯化钡,0.1mol/LTris,0.0lmol/I苯 甲脒的pH7.4的4?溶液中,磁力搅拌10rain, 3000g离心10rain,弃去上清.沉淀再用相同溶液 1000ml/次洗涤2次,3000g离心10rain,弃去上清. 1.5洗脱吸附的蛋白_4沉淀溶于1600ml含 0.15mol/L柠檬酸钠,0.02mol/LTris,0.0lmol/L
苯甲脒的pH6.0的4?溶液中,磁力搅拌2h以洗 脱吸附的蛋白质,3000g离心15min,检测上清的蛋 白含量和F?;C.
1.6硫酸铵分级沉淀蛋白上清缓慢加入
240g硫酸铵(30饱和度),磁力搅拌,加完后再搅 拌20min;5000g离心15min,弃沉淀,上清缓慢再加 入400g硫酸铵(70饱和度),磁力搅拌,加完后再 搅拌30rain,置4?2h;在4?5000g离心30rain,弃 上清.
1.7透析除盐[6]沉淀溶解于100ml0.1mol/L Na2EDTA,0.1mol/LTris,pH6.0的缓冲液中,再 装入预处理过的透析袋内,置于3000ml含0.05 mol/LTris,0.025mol/LNaC1,0.01mol/L苯甲 脒,pH6.0的4?溶液内透析6h,再于3000ml相同 的溶液中透析,4?过夜.透析过的样品3000g离 心,l0rain,检测上清的蛋白含量和F?:C 1.8DEAE—SepharoseFastFlow离子交换层析纯
化F?E6~83DEAE—SepharoseFastFlow离子交换 柱(2.6cm×45cm)经过0.05mol/LTris,0.025 mol/LNaC1,0.01mol/L苯甲脒的pH6.0的溶液
平衡,透析过的样品上柱,平衡液冲洗直到A啪< 0.05且成直线;用2400ml连续NaC1梯度(O,0.6) mol/L,0.05mol/LTris,0.0lmol/L苯甲脒的
pH6.0的溶液洗脱,120ml/h,
流出液的Azs., 收集流出液,5ml/管,检测每管内的F11:C,F?:
C,FIX:C,FX:C.
1.9第2次DEAE—SepharoseFastFlow离子交换
层析纯化F?[8汇集FVn:C>2U/ml的组分,检 测总的F?:C和蛋白含量,超滤到原有体积的
1/1O,然后加入含0.05mol/LTris,0.01mol/L苯
甲脒的pH6.0的溶液调整电导,使其与含0.05mol/ LTris,0.10mol/LNaC1,0.01mol/L苯甲脒的
pH6.0的溶液电导相同;把调整好电导的蛋白液上 样到用0.05mol/LTris,0.025mol/LNaC1,0.01
mol/L苯甲脒的pH6.0的溶液完全平衡的DEAE— SepharoseFastFlow离子交换柱(1.6cm×20cm), 用含0.05mol/LTris,0.15mol/LNaC1,0.0lmol/L
苯甲脒的pH6.0的溶液100ml冲洗,再用含0.135 mol/LNaCl,0.005mol/LCaC12,0.05mol/LTris,
0.0lmol/L苯甲脒的pH6.0的溶液洗脱,为3O
ml/h,收集并记录流出液体的A.流出液4.0ml/ 管,检测每管的F?;C.把FV?:C>2U/ml的
组分收集到一起,检测总的F?:C和蛋白含量,最
后超滤浓缩到5ml.
1.10凝胶过滤去除杂蛋白L8]SephadexG—lOO 层析柱(1.6cm×95cm)经过含0.15mol/LNaC1,
0.01mol/L苯甲脒,0.02mol/LTris的pH7.5的 4?溶液平衡,浓缩后的液体上柱,柱子用平衡液相 同的液体冲洗,30ml/h,记录洗脱液的A锄,收集流 出液,3ml/管,检测F?:C,收集F?;C>2U/ml 的组分.
1.11分装保存最后对收集到的F?样品测F? ;C,F?:C,FIX:C,FX:C和蛋白含量,装入预
先处理好的透析袋内,于500ml含0.15mol/L NaC1,0.02mol/LTris的pH7.5的4?溶液中,磁 力搅拌4h,换相同的溶液500ml,再透析4h以去除 苯甲脒;分装,密封,一2O?冰冻保存.
1.12电泳鉴定纯度SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定F?纯度.
1.13计算每一步及F?浓缩总倍数和回收效率. 2结果
2.1柠檬酸钡沉淀吸附400g组分?沉淀经过溶 解,离心后检测上清中F?:C为24.33U/ml,共 4180ml,蛋白含量83.01mg/ml;柠檬酸钡沉淀吸附 后上清中残余的F?:C为0.24U/ml,吸附率为 99.1
中国输血杂志2006年10月第l9卷第5期Chin—JBloodTransfusion,Otob宴!!曼!v0.
旦』
2.2洗脱以及硫酸铵分级沉淀沉淀经过柠檬酸 洗脱,洗脱后体积为1600ml,F?:C为57.84U/ ml,总回收效率为91.0.3O,7O硫酸铵处理 所得沉淀溶解成100ml溶液,经过透析,离心去除 不溶物后体积为107ml,蛋白浓度为52.51mg/ml, F?;C为637.14U/ml,总的F?:C为68169U.
2.3第1次DEAE-SepharoseFastFlow离子交换 层析共收集480个组分,F?活性大多集中在组 分192~263,共收集360ml,其蛋白含量和F?:C 分别为0.53mg/ml和117.7U/ml,还有一小部分F ?和F?,F?,FX在一起被收集,洗脱剖面见图1. +Am+Fv?:CF?:C210
180
150
120
90
60
30
O
060lZ0L80240300360420480 洗脱组分
注:层析柱用2400ml连续NaCI梯度(0,0.6)mol/L,0.05mol/L
Tris,0.O1mol/L苯甲脒,pH6.0的溶液洗脱,120ml/h,5roll管收集 洗脱液
图1DEAE-SephamseFastFlow离子交换层析洗脱剖面 2.4第2次DEAE—SepharoseFastFlow离子交换 层析共收集到约44ml液体,蛋白含量为0.40nag/ ml,F?:C为541.90U/ml,洗脱剖面见图2.
2
l_5
墨
0.5
0
注:层析柱用0.135mol/LNaCI,0.005mol/LCaClz,0.05mol/L
Tris,0.01mol/L苯甲脒pH6.0的溶液洗脱,30ml/h,4ml/管收集
洗脱液
图2DEAE-SephamseFastHow离子交换层析洗脱剖面 2.5SephadexG—i00凝胶过滤从洗脱第2峰收 集到约24ml液体,蛋白含量为0.42mg/ml,F?:C 为747.32U/m1,洗脱剖面见图3.
2.6F?纯化过程相关数据经过以上几步的纯 化步骤,F?纯度提高了近6000倍,活性达到了 1775.8U/mg,F?整个纯化过程的回收率是 17.6(表1).
2.7电泳纯化的F?,经SDS-PAGE电泳分析, 只有1条蛋白条带(图4)
1.2
0.9
署
0.6
0-3
0
048l2.162O242832
洗脱组分
注;凝胶过滤柱用0.15mol/LNaCI,0.01mol/L苯甲脒,0.02mol/L
Tris,pH7.5的4?溶液洗脱,30ml/h,3ml/管收集洗脱液 围3SephadexC,--lOO凝胶过滤层析洗脱剖面 衰1F?纯化各步骤的纯化效率和回收率结果 活性
蛋白总量F?活性F?纯度浓缩回收率 (g)(u)(u/g)倍数
()
起始346981.8101700 枸拇酸钡吸附洗脱后硫酸铵沉淀5618.668174
第1次DEAESephamse离予交换190.842372 第2次DEAE-Sephato~e离予变换17.623844 SephadexG100凝胶过滤io.117936 0.31.0100.0
12.140.367.0
225.2750.741.6
1355.94519.7Z3.4
1775.85919.317.6
94kd
67kd
43kd
30kd
M:中分子量标准;1:纯化的F?;样品量为15g 图4从组分?沉淀纯化的F?的电泳
3讨论
高纯度F?的获得以往都是从血浆中直接纯化 F?,但由于血浆中F?的含量很低,从血浆中纯化 F?的过程中F?损失>60,即便获取几毫克纯化 的F?需要消耗大量的血浆[钆.Cohn组分?沉淀 是低温乙醇法制备血液制品的副产品,一般被当作 激_每M
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14如
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中国输血杂志2006年10月第19卷第5期
ChinJBloodTransfusion.October.2006,Vo1.19,No.5
废物丢弃,而其中却含有很多活性成分,如包括维生
素K依赖的凝血因子.Monahan等]曾从组分? 沉淀中提取纯化出F?和FX,Fenton等从组分 ?沉淀中纯化出FI1.虽然还未见从组分?沉淀中 提取F?的报道,但由于F?和FI1,?,X等有相 似的理化特性,从理论上推测,组分?沉淀中应该含 有FVII.笔者通过检测组分?沉淀,发现其中的确 含有很高的F?活性.从组分?沉淀中提取纯化F ?可以节约大量的血浆,不失为一条经济废物再利 用的新途径.
在方法探索过程中发现很多的影响纯化的因 素,必须通过采取一定的
加以解决,纯化过程才 能得以进行.由于组分?沉淀中含有较多的脂类, 柠檬酸钡沉淀吸附维生素K依赖的凝血因子的同 时也会同时结合,包裹较多的脂类,这些脂类如果没 有除去,在后面的硫酸铵沉淀蛋白时就会包裹蛋白 而使蛋白不能被离心下来,造成实验失败;但如果能 减缓沉淀速度,让Ba过量形成比较坚实的柠檬酸 钡沉淀,则脂类就只存在于沉淀的上清液中而不是 被沉淀包裹,可以很容易地被冲洗下来.FVII在纯 化过程中很有可能被一些因素激活,导致F?的一 些理化性质发生变化,影响F?的回收率,为了减少 损失,在纯化的过程中加入了蛋白酶抑制剂苯甲脒, 并尽量在低温下操作,避免剧烈的条件变化. 本实验在第1次离子交换过程中,F?洗脱时 被分成两个部分(图3).检测前后部分的F?:C 活性发现,前一部分的F?活性约为后面部分的2 倍,但若不加PT试剂,检测二者纠正缺乏F?血浆 延长的凝血酶原时间,后者凝固血浆的时间明显短 于前者,说明后者可能存在有较多的活化的F?,是
生产活化的人F?的潜在资源.
(致谢:杨显福,黄淑,孙小成,陈静娴,焦丽华,吴
纬,魏建军,黄毅等在试验过程中提供的帮助!)
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1242
(2006—08—16收稿,O9—27收稿)
本文编辑:蔡辉
《血站质量管理规范》培训班圆满结束
本刊讯采卉为有效实施《血站
》(已于今年3月1日起实行).卫生部特别
制定了《血站质量管理规范》等配套
文件.着眼于《血站质量管理规范》的贯彻落实,加强血站全员质量培训工作.卫生部医政司从9月16—28日,在西北(兰州),
东北(沈阳),中南(南宁),华东(南昌),西南(成都)及华北(太原)片区举办了六期《血站质量管理规范》培训班.来自全国31个
省,市,自治区所有血站负责采供血,质量管理的600多名业务骨干参加了培训.为保证培训效果.统一培训内容,此前卫生部
医政司曾专门对全国血站站长做了动员培训,并在长沙召开了《血站质量管理规范》观摩培训及培训工作研讨会卫生部医
政司周军副司长,血液处衣梅处长及胡翔同志分别到了各地的培训班做指导,培训班所在地主管卫生工作的领导,卫生行政
部门的负责人出席了开班式或结业典礼,6个具体承办的血液中心为培训班提供完善的学习和生活环境.此次培训卫生部选
派的授课教师,基本是来自血站的领导或专家,他们具有丰富的实践和教学经验,对《血站质量管理规范》的阐述深人浅出?其
教务工作不仅令参训学员们"对血站质量管理有了全面,详尽的了解",对加强和规范全国血站质量管理,确保血液安全,推动
无偿献血工作的重要意义"有了进一步的认识",而且也受到了卫生部医政司的高度评价.