致泻大肠埃希氏菌检验

致泻大肠埃希氏菌检验 玉环县疾病预防控制中心作业指导书 文件编号:YJKZ/ZYW1-005 标:食品中致泻大肠埃希氏菌检验 版号:第 3 版，共 3 页 第 1 页 1 目的 本规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法 2 适用范围 本标准适用于食品和食物中毒样品中致泻大肠埃希氏菌的检验。 3 引用标准 GB/T 4789.28-2003 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 4 设备和材料 4.1 电子天平:0g,500g。 4.2 均质器。 4.3 恒温培养箱:36??1?，42?。 4.4 恒温水浴箱:100?，65?,68?，50?。 100×。 4.5 显微镜10×, 4.6 冰箱:0?,4?。 4.7 灭菌广口瓶:500ml。 4.8 灭菌锥形瓶:500ml，250ml。 4.9 灭菌试管:16mm×160mm、10mm×75mm。 4.10 灭菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、5ml(具0.1ml刻度)。 4.11 灭菌培养皿:直径90mm。 4.12 离心机。 4.13灭菌刀、剪子、镊子等。。 5 培养基和试剂 5.1 乳糖胆盐发酵管:按YJKZ/ZYW6-001中4.4规定。 5.2 营养肉汤:按YJKZ/ZYW6-074中4.01规定。 5.3 肠道菌增菌肉汤:按YJKZ/ZYW6-001中4.18规定。 5.5 伊红美蓝琼脂(EMB):按YJKZ/ZYW6-001中4.3规定。 5.6 三糖铁琼脂(TSI):按YJKZ/ZYW6-001中4.10规定。 5.7 糖发酵管(乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇):按YJKZ/ZYW6-001中3.8规定。 5.8 赖氨酸脱羧酶试验培养基:按YJKZ/ZYW6-001中3.7规定。 5.9 尿素琼脂(pH7.2):按YJKZ/ZYW6-001中3.5规定。 5.10 氰化钾(KCN)培养基:按YJKZ/ZYW6-001中3.6规定。 5.11 蛋白陈水、靛基质试剂:按YJKZ/ZYW6-001中3.4规定。 5.12 半固体琼脂:按YJKZ/ZYW6-001中4.11规定。 5.13 氧化酶试剂:按YJKZ/ZYW6-001中3.13规定。 5.14 革兰氏染色液:按YJKZ/ZYW6-001中2.1规定。 5.15 致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清:按诊断血清使用说明书详细分型。 6 检验程序 致泻大肠埃希氏菌检验程序如下: 玉环县疾病预防控制中心作业指导书 文件编号:YJKZ/ZYW1-005 标题:食品中致泻大肠埃希氏菌检验 版号:第 3 版，共 3 页 第 2 页 检样 测大肠菌群MPN 25g+营养肉汤225ml 36?1? 6 h 污染严重的检样匀液 肠道菌增菌肉汤 乳糖发酵阳性的发酵管 EMB 36?1? 18~24 h 乳糖发酵或不发酵的菌落3~5个，氧化酶-革兰氏阴性杆菌 TSI、靛基质、pH7.2尿素、赖氨酸、KCN、动力 TSI 底层+，HS-，KCN-，尿素- 2非如左述的各种反应结果 血清学试验 非大肠埃希氏菌 报告 7 操作步骤 7.1 增菌 样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前应预冷藏外，一般不冷藏。以无菌手续称取检样25g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36?1?培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42?培养18h。 7.2 分离 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液划线接种伊红美蓝琼脂平板;污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种伊红美蓝平板，于36?1?培养18,24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。 7.3 生化试验 7.3.1 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)。同时将这些培养 玉环县疾病预防控制中心作业指导书 文件编号:YJKZ/ZYW1-005 标题:食品中致泻大肠埃希氏菌检验 版号:第 3 版，共 3 页 第 3 页 物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36?培养过夜。 7.3.2 TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，HS阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物2 为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或HS、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大2 肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。 7.4 血清学试验 7.4.1 假定试验:挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。 8 执行标准 GB/T4789.6—2003 起草:罗 萍 审核:殷银香