大鼠胚胎背部皮肤发育过程中毛囊干细胞的发育初探

大鼠胚胎背部皮肤发育过程中毛囊干细胞的发育初探 大鼠胚胎背部皮肤发育过程中毛囊干细胞 的发育初探         &nb sp;             作者:林森 谢拥军 李新枝 宁加亮   【摘要】  目的 探讨大鼠胚胎背部皮肤毛囊干细胞 的发育规律。 方法 使用冰冻超薄切片后固定～结合免疫组 织化学染色方法,IHC,～显示出毛囊干细胞的位置和发育程 度～然后对医学阳性程度表达区域使用软件分析和统计方法 处理。 结果 大鼠胚胎背部皮肤呈现逐渐增厚的趋势～其中 毛囊隆突区并不明显～但可明显观察到三种干细胞标记物在 皮肤全层～尤其是基底层的表达变化。 结论 形态学观察说 明毛囊发生初期毛囊干细胞(hair follicle stem cell, HFSC)不仅仅定位于毛囊上段～三种HFSC标志物的表达有差 异。背部皮肤基底层细胞具有干细胞特性～未分化为表皮细 胞或者毛囊中的各种细胞。β1 integrin～CD34和K15的 表达变化可能与毛囊干细胞以及毛囊的生物学特性有关。 【关键词】  大鼠胚胎, 背部皮肤, 毛囊干细胞     【Abstract】  Objective  To detect the development of hair follicle stem cell in developmental rat embryo dorsal skin. Methods  Frozen section and immunohistochemistry were used to investigate the expression of β1 integrin, CD34 and K15. All the expression data was detected by software called Image pro plus, and then the data was analyzed. Results  Embryo dorsal skin became thicker gradually without bulge region significant, but the expression of stem cell markers, β1 integrin, CD34 and K15 changed obviously in each stage of developmental rat dorsal skin. Conclusion  The results of morphology suggest that hair follicle stem cells (HFSCs) do not localize in upper hair follicle in early stage of hair follicle morphogenesis. The expressions of three stem cell markers were different. Especially, basal layer cells in dorsal skin exhibited stem cell characteristics without differentiating into epithelial cells or other types of cell in hair follicle. The expression of stem cell markers may be correlated with characteristics of hair follicle and hair follicle stem cells.     【Key words】  rat embryo; dorsal skin; hair follicle; hair follicle stem cell     皮肤上皮层及其相关结构来源于毛 囊内部和毛囊间的两个干细胞群落～即皮肤基底层干细胞通 常形成皮肤各层～而位于毛囊隆突区的干细胞则负责毛发和 皮脂腺的再生,1,。进入生长周期的毛囊可分为四个阶段～即生长期(anagen)、退化期(catagen)、静止期(telogen)和活跃脱毛期(exogen),2, 3,。而进入周期之前～毛囊经历发育阶段。促使毛囊发生的第一个信号来源于间充质,4, 5,～随后表皮增厚形成基板～真皮细胞在基板下形成结构紧密的 微环境～基板向下生长形成毛胚芽～上皮组织包围真皮紧密 微环境从而形成真皮乳头。     大鼠毛囊的形成经历胚胎第15.5 d(E15.5)，初生阶段(，E22)～本文据此选择胚胎发育第15 d(E15)、E16、E17.5和E19四个阶段以观察大鼠胚胎发育过 程中背皮中干细胞标志物β1 integrin, CD34和K15的表达规律～以此解释毛囊干细胞(hair follicle stem cell, HFSC)在大鼠胚胎背皮中的发育规律。     1  材料和方法     1.1  材料     近交系Wistar大鼠胚胎(由第三军医大学实验动物中心提供)。CD34兔抗、β1 integrin兔抗(武汉博士德)～K15兔抗(Novocastra)～免疫组化试剂盒(北京中山)。     1.2  实验方法     第15 d(E15)、E16、E17.5和E19四个阶段的背部皮肤。随机抽取每阶段大鼠胚胎6个～剪下每个阶段大鼠胚胎的背部皮肤～分置于液氮中待用。样品放入4%PFA中固定24 h后放入30%蔗糖溶液中脱水40 h左右～于冰冻切片机中OCT包埋剂包埋～切成5 μm厚组织片。采用免疫组化染色ABC法检测大鼠胚胎发育过程中HFSC组织定位以及β NGF和p75NTR的表达。冰冻切片～37?下3% H2O2封闭15 min,滴加二抗的正常血清封闭～室温孵育25 min,吸去封闭血清～勿洗～滴加K15(1?70)、β1 integrin (1?100)和CD34(1?100)一抗(设PBS空白对照),4?湿盒内过夜,加生物素化二抗和链酶卵白素,DAB同时程显色～ 镜下观察显色结果,干燥脱水～二甲苯透明～中性树脂封片。     1.3  图象分析 1    使用Nikon 4500全自动数码CCD采集图像～用Image pro plus 5.1专业软件分析染色区域阳性程度累积光密度(IOD)～采用SPSS 11.0中ANOVA方法分析所有样品IOD染色强度统计值。     2  结果     在胚胎期大鼠背皮研究过程中～可见皮肤的发育呈逐渐增厚的趋势。在E15时期～大鼠的背皮非常单薄～未观察到背毛毛囊～各层分层不明显。随着胎龄增加至E19时期～可清楚观察到表皮各层的组织结构。β1 integrin主要表达在表皮及其以下的真皮层小细胞群落中。CD34和K15主要表达在表皮层。 E15时期～表皮与真皮不易区分～主要由最外层的3，4层细胞组成。此时β1 integrin不仅在表皮表达～而且还在真皮细胞群落中表达。CD34为阴性。K15在表皮表达很少～图像软件并未识别其IOD强度。 E16时期～表皮明显增厚～β1 integrin 和CD34 都在表皮中表达～而K15则未见表达。 E17.5时期～CD34和β1 integrin主要表达在表皮以及表皮以下的真皮层小细胞群落中～K15无表达。 到E19时期～皮肤结构相对紧凑～层次也较分明～开始出现皱褶～β1 integrin 和CD34在棘层中和基底层中表达～而K15仅在基底层中表达。阳性表达IOD差异见表1～表达结果见图1.表1  胚胎期大鼠背部表皮β1 integrin、CD34和K15在胚胎四个时期的平均灰度值(IOD)     3  讨论     大鼠皮肤和毛囊的发育从胚胎阶段就已经开始。 首先表皮增厚形成基板～紧接着真皮细胞围绕基板下方形成一个组织结构紧密的微环境。 表皮基板向下生长到真皮形成毛胚芽。 上皮组织包绕组织紧密的真皮环境生长形成真皮乳头～ 围绕真皮乳头的细胞则成为毛母质细胞,6,。真皮乳头紧靠毛囊上皮组织的永久区域 隆突区,7,。     关于表皮干细胞与毛囊干细胞的定位和区分的问题一直存在争论。20世纪90年代～Cotsarealis等,7,发现并揭示标记滞留细胞(LRC)位于毛囊隆突部和表 皮基底层。Taylor等,12,利用标记追踪方法发现毛囊干细胞可双向分化为表皮干细胞和HFSC～该标记主要定位于表皮基底层和毛囊外根鞘隆突部。HFSC倾向于在表皮受到损伤和毛囊创伤时发挥其增殖分化潜能,8,。目前一般认为～β1 integrin～CD200～CD34～K15是HFSC的主要标记物,9 11,。 因此可以看出本研究应用的K15～β1 integrin和CD34在鼠类的HFSC中有特异性表达～能够作为HFSC的特异性标志物。  在研究中发现大鼠胚胎背部皮肤基底层的三个干细胞标志物CD34、K15和β1 integrin变化呈现不同的趋势。 这提示皮肤中的干细胞在发育过程中的性质发生变化～并有可能衍生出不同亚群。Morris,13,认为K15在鼠类毛囊的所有时期都表达～是毛囊干细胞的表面标志物～作者发现胚胎大鼠E19时期～K15在基底层的强烈表达～而其他时期无表达～Whitbread等同样发现分裂活跃的皮肤基底层表达K15,14,～ 因此K15在基底层的强烈表达与基底层的干细胞特性关系密切～推测HFSC由其他干细胞衍生而来～在E19时期的大鼠胚胎背皮基底层中分裂活跃。     β1 integrin和CD34表达在皮肤全层中～在临近基底层以及基底层以上表达比较强烈。这与K15的表达部位明显不同。β1 integrin高表达细胞具有更高的克隆形成能力～但β1 integrin高表达的细胞中除 了表皮干细胞(ESC)外还包含短暂性增殖细胞(TAC)。β1 integrin具有粘附功能～因此高水平表达的β1 integrin 有利于保持干细胞的成簇分布,15,。同时～β1 integrin 和CD34也是表皮干细胞的表面标志物～这提示在E15 E19 时期表皮干细胞一直存在～只是数量和位置上有所变化～而 K15在E19的突然出现说明HFSC是ESC的子代细胞。 这与 Poter等认为K15为成熟基底层KC表型,16,相符。     只有在体外操作利用间充质信号刺 激的情况下～HFSC才会形成新的毛囊,11,17,。因此～彻底 阐明HFSC的发育机制有助于揭示毛囊的形成过程～期望为 临床研究新的毛发生长方法提供一些理论基础。 【参考文献】   ,1,Alonso L, Fuchs E. 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