基因及蛋白质芯片技术

基因及蛋白质芯片技术 () 文章编号: 1003- 6946 200001- 009- 02 4 基因芯片的应用 基因芯片的应用有多方面。比如在药理学方面, 等 W ilso n 在基因芯片上点布了与97% 的结核分支杆菌基因开读框架相 基因及蛋白质芯片技术 对应的 用于检测经过异烟肼作用后, 对其有耐药性的 , cDN A 结核杆菌, 发现有6种与生物合成有关的酶和有4种与生物合成 王 和, 赵小文 途径无直接相关的酶类的表达增高, 这就为将来人工合成新的() 华西医科大学附属第二医院, 四川 成都 610041 抗痨药物提供了有用的线索。在肿瘤研究和诊治方面, W ang 中图分类号: 39413 等将5766种 点布在一张基因芯片上, 用它检测正常卵 R 文献标识码: cDN A B 基因及蛋白质芯片均属于生物芯片, 是近年来发展起来的巢组织和卵巢肿瘤之间各基因表达的差异, 通过实验, 发现有 新的生物技术。它们被称为横扫生物科学和医学界的一次“迷 些基因的表达在卵巢癌的发生发展中起着重要作用。这为肿瘤 的诊断和治疗带来了新途径。 你”革命。现在它们越来越多的应用到生物学、医学、遗传学、药 理学和毒理学等多个方面, 并开始崭露头角。基因芯片技术不仅在药理学、肿瘤学等等方面发挥着越来 1 基因芯片概念越重要的作用, 它在基因遗传病的产前诊断领域, 也勾画出了 (基因芯片又称 或 微阵列 美好的前景。 DN A cDN A DN A o r cDN A M i2 2 ) 是指在一个大约1面积的载体上, 点布数以万计不 近年来, 随着分子生物学的不断发展, 越来越多的单基因 c ro a r raycm 同 的 寡 核 苷 酸 或 将 芯 片 与 标 记 有 荧 光 染 料 的 待 测 遗传病的基因被克隆出来, 使其能够被传统的基因技术所诊 , cDN A 或 杂交, 与靶序列配合好的探针会产生强烈的杂断。但是由于单基因病的基因突变可能发生在各外显子的许多 DN A m RN A 交 信 号, 如 果 有 碱 基 的 错 配, 信 号 就 会 减 弱。籍 此 能 判 断 靶 不同编码的核苷酸位点上, 要做到从基因水平对上这类疾病确 或 中与芯片相应基因的突变或表达等情况, 它具 诊以用于产前诊断, 须对每一个外显子逐一作基因 的序 DN A m RN A DN A 有一次性检测样本量巨大、相对低消耗、计算机自动分析结果 列分析。传统的序列分析手段耗时、耗力、耗材、操作复杂, 这也 以及快速、准确等特点。是在我国单基因病产前诊断在大医院开展不多, 中小医院开展 困难的原因之一。由于基因芯片技术主要功能是测序、检测突 2 基因芯片历史 变和多态性等, 这将使传统测序的麻烦迎刃而解。利用基因芯 基因芯片的推出最早是由美国斯坦福大学医学中心生化 系 教授领导的小组在1995年发表在 上的文章片检测容量大的特点, 可根据某个遗传病的特定基因, 一 B row n Sc ience 公布的, 文章介绍他们使用机器手在玻片上点上 用双 , 组寡核苷酸探针, 它们包含能检测该基因各外显子上所有可能 cDN A 荧光标记 一次同时检测了不同的45个基因表达。第二出现突变的 序列位点, 制成一张芯片, 利用杂交时会出 , m RN A DN A 年他们就在118×1. 8的寡核苷酸阵列中将一次基因检 现碱基错配杂交信号减弱的特性, 经计算机分析扫描信号, 将 cm cm 测数提高到了1744个。并指出该技术的快速有效和一次处理量 该基因上的杂合性突变检测出来, 并分析出该突变位点在突变 后有无 表达, 以及如果有 表达, 它翻译的蛋白 大的优势将在基因组遗传图、基因发现和基因表达方面起重要 m RN A m RN A 质功能变化的可能情况。 作用。到了1998年后, 有关这方面的文章从几年前的十数篇一 下猛增到上百篇, 在一张基因芯片上排列的 序列也达数 遗传咨询门诊中常有求医者诉说她们头胎小孩有智力障 DN A 万乃至数十万种之多, 内容涉及到遗传学、药理学、肿瘤学、毒 碍, 要求对患儿检查并希望第二胎时作产前诊断。我们知道, 与 理学等许多领域, 来势之猛, 给人以铺天盖地之感。智力障碍有关的遗传病除了先天愚型等染色体病外, 也是许多 基因遗传病的表现症状之一, 要从基因水平上确诊, 常因困难 3 基因芯片基本制作及操作 基因芯片的制作原理有多种。片基也可采用尼龙、聚丙烯、 太大而无法完成。利用基因芯片技术, 可以将这些与智力障碍硅片和玻片等。在片基上的点布有照相或过硫酸铵有关的基因遗传病检测所需要的寡核苷酸探针组安排在一张 DN A 诱导共聚反应的原位合成寡核苷酸方法、在凝胶上聚合方法以 芯片上, 一次检测就可以完成对一系列疾病的基因诊断。 及直接在玻片上点布方法等。下面将使用较多由于基因芯片已经商业化, 操作较简单, 直 , 越来越多的基因芯片由各大公 接在玻片上点布的芯片制作和基因检测的基本步骤作一简单 司生产出来, 芯片使用单位只需从公司购得自己需要的芯片, 经过简单操作, 就可上机分析获得结果。随着为检测各种特定 介绍。将一般病理用大小的玻片用氢氧化钠- 乙醇溶液彻底洗 基因生产的基因芯片种类的增加, 单基因遗传病的基因诊断和 净, 用 多 聚 赖 氨 酸 使 玻 片 既 保 持 明 亮 又 完 全 疏 水 化。将- L 获得的 用醋酸钠- 异丙醇溶液沉淀, 乙醇洗净, 然 产前诊断都将变得越来越容易。在单张芯片上容纳的寡核苷酸 PCR DN A ( ) 后 溶于3溶液, 放入96孔软板后用点布机 在作 X SSC a r raye r 探针越来越多, 公司就将推出容纳4000000个探针A ffym e t r ix 了多聚 赖氨酸处理疏水化后的玻片上点布 。点布结 , 使一次检测能够诊断的基因遗传病种类也越来越多。- 的芯片L DN A 束后, 经过高温快干、紫外线照射使 链与玻片交联, 经解 DN A B row n、W it te s、T o ro nen 和 Zh ang 等多个小组编制了处理随基 链处理后就可以用于杂交检测样本 了。杂交时将标记好 DN A 因芯片技术而来的大量信息资料的实用软件, 许多软件还可直 荧光染料的待测样本 溶于10含有 的4溶液 DN A Λl SD S X SSC 接在互联网站上免费下载, 解决了该技术的后顾之忧。1999年 ( ) 中 根据需要可加竞争 煮沸2骤冷使其解链后, 将等把 图像系统引入基因芯片技术进行结果分析 , DN A m in B r ignac CDD 标本加在已 点 布 好 的 玻 片 上, 盖 上 盖 玻 片 在 湿 盒 中 杂 交 2, 将会大幅度的降低扫描仪器价格, 同时随着基因芯片产量的增 24, 经清洗去掉多余的杂交液后用共聚焦荧光显微镜扫描结加, 价格也会逐步下降, 使得对基因遗传病的诊断和产前诊断h 1() 1 胎儿颈项部皮下组织厚度 , 5 蛋白质芯片 N uch a l T h ick ne ssN T () 蛋 白质芯片又称蛋白质微阵列 , 它 妊娠早期可在胚胎矢状面测量背侧颈部皮下组织厚度, 以 P ro te in M ic ro a r ray 是继基因芯片之后, 作为基因芯片功能的补充发展起来的。与 阴道超声更为有效。妊娠中期则以胎儿头部水平断面为。 基因芯片概念类似, 它是在一个基因芯片大小的载体上, 点布 在测量双顶径的切面基础上将探头在胎儿头后部向足端偏斜,高密度不同种类的蛋白质, 然后再用标记了荧光染料的已知抗 使小脑及小脑延髓池显示清晰时, 测量后部皮肤线至颅骨线外 体或配体等与待测样本中的抗体或配体一起同芯片上蛋白质 缘间距离。正常时妊娠10, 13周 应小于3, 妊娠14周以 N T mm 竞争结合, 在扫描仪上读出荧光强弱, 计算机分析计算出待测 上 应小于6。21三体胎儿多数超过这一范围, 但正常与N T mm 样本结果。在此基础上可发展到对各种蛋白质、抗体以及配体 异常之间存在交叉, 判断时应慎重, 尤其切面不标准及测量误 的检测, 弥补了基因芯片检测的空缺。最近, 德国科学家 L uek2差易致误诊。结合孕妇年龄及高危因素其敏感度可大大提高。领导的小组率先利用机械手将基因工程生产的92种不同种 ing 2 胎儿肾盂宽 类的人体蛋白质点印在聚二氟亚乙烯的滤片上, 用相应的单克 多在肾水平腹部横切面测量肾盂的前后径。正常时妊娠15隆抗体测试, 得出很好的结果。此后不久, 实验室又将 Sch ram l , 20周< 5, 20, 30周< 7, 30, 40周< 8, 40 周以上mm mm mm 蛋白质芯片改进在与普通的96孔酶联免疫板同样的聚四氟乙 < 10。超过此范围时, 应注意进一步排除染色体异常。mm 烯板中进行。该板每一个孔的平底上用机器手点布上同样的四 () 3 胎儿双顶径与股骨长度比值 ƒB PD FL 组蛋白质。每组36点, 容纳8种不同的抗原以及标记蛋白; 每个 正常时该比值随孕周增加而下降。而唐氏综合征的胎儿则 96孔板上共有13824点。由于该板与普通酶联免疫板一样, 它的反而上升。参考值以 ƒ不超过相应孕周之均值加115标B PD FL 操作也同普通酶联免疫一样, 可直接放入与之相配套的全 准差为界, 见表1。 自动免疫分析仪中使用, 使整个检测过程完全自动化, 真正做 不同孕周 ƒ 表1 B PD FL 到了高效率、低成本, 特别适合于蛋白表达的大规模、多种类筛( )ƒ?115 孕周 B PD FL SD 查。1193 15, 由于蛋白质芯片技术近一两年刚刚出现, 其应用尚有待开 1. 93 16, 1. 76 17, 发。从现有功能看, 它能够进行受体- 配体检测、多种感染因素 1. 74 18, 筛查和肿瘤的诊断。同时对多种蛋白质表达异常的遗传病诊断 1. 68 19, 和产前诊断存在潜在应用前景。 1. 58 20, ( ) 1. 54 收稿日期: 1999- 11- 1221, 1. 47 22, 4 胎儿股骨及肱骨长度 () : 1003- 6946 200001- 010- 02 文章编号 21三体儿多表现为四肢短小, 尤其肱骨更为明显。超声对 胎儿长骨的测量极为简便。以测量所得的胎儿股骨及肱骨与相 超声监测筛查胎儿染色体病的估价 应孕周正常胎儿的股骨与肱骨的比值作为参数。由于此比值与 孕周增长关系不大, 故用同一标准。以比值?019为截断值, 21陈 焰 2 三体儿的比值多小于019。() 北京妇产医院, 北京 100006 5 胎儿股骨长与足长比值 根 据 等 12 个 中 心 3582 例 14, 24 周 胎 儿 的 研 G rand jean 中图分类号: 714153 文献标识码: R B3 究。取比值?0188时判断胎儿染色体异常的敏感性为35% , 超声检查已广泛用于产前诊断, 尤其是胎儿先天畸形及异 假阳性率约416% 。常, 绝大多数可在产前作出诊断。有些染色体病的胎儿在超声 6 胎儿小脑横径检查时也常被发现存在各种类型的畸形: 如21三体儿最常见伴 18三体胎儿多有小脑发育不良, 超声测量小脑横径如果小 发12指肠闭锁、心室间隔缺损等; 18三体及13三体儿多伴有神 于等于相应孕周均值两个标准差或小于等于相应孕周之第十 经管缺陷、膈疝、脐膨出、腹裂等较大的严重畸形。染色体异常 百分位者, 应高度怀疑异常。见表2。的胎儿同时伴有明显形态异常, 一经超声检出就会自然淘汰。 4() 正常胎儿小脑横径 mm 表2 ( ) 但仍然有些染色体异常胎儿如21三体 唐氏综合征等并不表 10% 50% 90% 现出明显的形态异常, 产前诊断主要依靠某些创伤性检查如: 孕周 18 17 18 19 取绒毛活检、羊膜腔穿刺或胎儿血管穿刺取样行细胞遗传学核 22 21 23 24 型分析。这些方法对胎儿及孕妇均有一定风险。如果用来作为 26 27 31 34 常规的产前筛查方法, 难免不发生流产及感染等并发症, 甚至 30 31 35 40 32 33 38 42 有些病例受了风险而并无阳性结果。近年来一些研究者在产前 34 33 40 44 超声检查时观察到胎儿的某些现象, 认为当超声检查未能发现 36 36 43 55 胎儿明显的异常但又存在某些无法合理解释的现象时, 应当考 37 37 45 55 虑可能与染色体异常有关。经过不断研究以及多中心实验后证 38 40 48. 5 55 39 52 52 55 明这些现象确实与胎儿染色体病有密切关系。可作为提供对胎儿