酒精发酵实验报告

酒精发酵实验报告 学院:生命科学学院 班级:生物2班 学号:080591048 姓名: 何镇惠 同组成员: 小组组长: 酒精发酵实验 一、实验目的 1.掌握发酵微生物菌种筛选原理和方法 2.复习用显微镜观察菌形态的操作步骤 3.学习和掌握酒精发酵方法和发酵过程的监测方法 4.掌握酵母生产性能的测定:酵母凝聚性的测定、酵母发酵力的测定、酵母产酒精能力的测定、及其耐酒精的能力 5.掌握用DNS法测定还原糖及其酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力 6.学习酒精出酒率的计算 7.掌握酒精对糖和淀粉的转化率的计算方法 二、实验原理 1.酵母菌的筛选和培养:酵母菌是一类单细胞微生物，繁殖方式以出芽繁殖为主。细胞形态以圆形、卵圆形或椭圆形较多。酵母菌一般生长在偏酸性的环境中，pH为5.0,6.0，生长温度范围为4,30?，最适培养温度为25,30?，常用的培养基为PDA培养基。酵母菌的繁殖多为出芽繁殖，少数为裂殖，极少数为芽裂。在发酵工业中常用的酵母菌直径为4,6μm，长6,9μm。当生长在固体培养基上时，菌落面一般光滑、湿润、有粘稠性，大多数是乳白色，只有少数为红色。酵母菌在液体培养基中生长时，能利用其中的可发酵性糖，并产生气体，有的可产生挥发性的酯香味，菌体课沉于管的底部或悬浮在培养液上形成菌膜。 2.酵母发酵:酒精发酵是属于厌气性发酵，在发酵过程中进行无氧呼吸，在此过程中，发生着复杂的生物化学变化，既有糖化醪中淀粉和糊精继续被淀粉酶水解生成糖，也有蛋白质在曲霉蛋白酶水解下生成肽和氨基酸。这些物质一部分被酵母吸收合成菌体细胞，另一部分则被发酵，生成酒精和 2CO。 3..DNS法测定的原理:DNS即3，5-二硝基水杨酸，二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸(DNS)与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖(如纤维素、半纤维素和淀粉等)水解产生的多种还原糖体系中。 4.酵母菌形态观察原理:染料美蓝氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞分泌的还原酶，能使美蓝由蓝色的氧化型转变为无色的还原型。借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。 5.血球计数板计数的原理:血球计数板直接计数法是将微生物细胞悬液置于血球计数板上一定体积的小室中，在显微镜下直接计数的方法。血球计数板是一块厚的玻璃板，玻片上有四条沟和两条脊，中央有一短 2横沟和两个平台，两脊的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台刻有不同规格的格网，中央1 mm 2面积上刻有400个小方格。血球计数板有两种规格:一种是1 mm面积分为25个大格，每大格再分为16 2个小格(25×16);另一种是1 mm面积分为165个大格，每大格再分为25个小格(16×25) 6.酵母耐酒精能力的测定原理:酵母在糖液中发酵，到某一时刻即行停止，其最大原因之一是由于酒精浓度增高所致。每一种酵母都有其忍耐的最高酒精浓度，酵母的这个特性在应用上很重要。 2 7.酵母菌产酒精能力的测定原理: 主要是称重法 糊化:将淀粉乳加液，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，变成糊状液体，淀粉不在沉淀;(玉米淀粉开始糊化温度:62?，终点温度72?) 液化:利用液化酶使糊化淀粉水解到一定的糊精和低聚糖程度，黏度降低，流动性增加。 糖化:利用糖化酶(葡萄糖淀粉酶)将淀粉液化产物糊精及低聚糖进一步水解成葡萄糖的过程。所用催化剂称为糖化剂，糖化剂可以是由微生物制成的糖化曲(包括固体曲和液体曲)，也可以是商品酶制剂。 8.酵母凝聚性的测定原理:酵母的凝集性在生产上具有特殊的重要性，也是区别菌株的一项重要内容。由于凝集性的不同，酵母的沉降速度就不一样，发酵度也有差异，如果酵母菌种发生变异或污染了野生酵母时，则会改变其凝集性，给生产带来困难。一般，将10 min时酵母细胞沉淀的容积称为本斯值。通过此值可估计酵母的凝集性，沉淀容积为0.1 mL以上者为强凝集性，而为0.5 mL以下者为弱凝集性。要求试验前后悬浮液的pH不变。 9.酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力测定原理:糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖，包括淀粉-1，4-麦芽糖苷酶(β-淀粉酶)、淀粉-1，4-葡萄糖糖苷酶(糖化酶)和淀粉-1，6-葡萄糖苷酶(异淀粉酶)。本实验的研究对象是淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。 碘量法原理:淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。 I+2NaOH?NaIO+NaI+H2O NaIO+CHOH(CHOH)CHO?CHOH(CHOH)COOH+ NaI 22424 体系中加入过量的碘，氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。 I+2NaSO?NaSO+2NaI 2223246 10.酒精度的测定原理:经酵母菌把糖转变成酒精后，在成熟发酵醪内，除含有酒精和大量水分外，还含有固形物和许多杂质。蒸馏是把发酵醪液中含有的酒精提纯出来，通过粗馏和精馏，最后取得合乎规格的酒精，同时得到副产物杂醇油，还有大量的酒糟(也称废醪)排除。 三、实验器材 1、材料 马铃薯，玉米粉，已知酶活力糖化酶 2、试剂 葡萄糖，琼脂，0.1%美蓝染液，无水葡萄糖标准溶液1mg/mL ，DNS试剂，2%可溶性淀粉， 0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液，20%氢氧化钠溶液，0.1mol/L碘液0.1mo1/L氢氧化钠溶液，1mol/L硫酸溶液，0.1mol/L硫代硫酸钠溶液，盐酸，无菌生理盐水 3、器材 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，钥勺，塞子，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布，移液枪，无菌平皿，盛有90 ml无菌水的三角瓶，盛有9 ml无菌水的试管，试管架，无菌刮铲，酒精灯，接种环，载玻片，盖玻片、吸水纸，擦镜纸，1000ml的烧杯 ，灭菌的250ml的三角瓶 ，无菌水和玻璃珠若干，1ml移液枪和枪头，玻璃棒 ，吸管(25ml、10ml、5ml、2ml)定碘瓶;碱式滴定管，100ml量筒，100mL容量瓶，冷凝管，蒸馏烧瓶，铁架台，软管，连通器，pH试纸 3 天平，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养箱，分光光度计，显微镜，血球计数板，电子天平，微波炉，水浴锅，天平，酒精比重计，温度计，离心机， 4、培养基: PDA培养基(1000ml):马铃薯(去皮) 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g ，pH自然 四、发酵工艺 取样一平板涂布分离—纯化—酵母菌株的筛选—生产性能鉴定一优良酵母获得。 五、步骤 1、培养基的配置: ?马铃薯去皮，切成块滤，煮沸半小时，用纱布过在加糖和琼脂，定容 至1000ml。121?灭菌30min。 (液体5×100 ml;固体500 ml，200 ml三角瓶，其余试管) 2、酵母菌的筛选和培养 ?采用平板涂布法，将葡萄皮加入到一个装有9 mL无菌水的试管中，混匀，即成10-1的样品稀释液，然后再按10倍稀释法依次稀释成10-2的稀释液，后倒置于28?培养箱中静止培养2 d。 ?酵母菌的分离与筛选: 用无菌移液枪分别吸取0.2mL各浓度梯度的样品稀释液，用涂抹平板培养法在PDA培养基上，28?恒温培养2d，观察菌落表面光滑、湿润、有粘稠性，乳白色的为酵母菌。 在超净工作台下，用接种环挑取1环，接着在PDA培养基上进行划线培养，采用斜线划线法。 ?菌种保存 分别用接种环把筛选出的菌种接至PDA固体斜面中，波浪划线，28?培养1d，斜面保存，后置于4?冰箱保存。 ?扩大培养 用接种环挑取菌种至液体PDA培养基中，28?摇瓶培养2d。 3、生产性能评估:主要是不同酵母菌产酒精能力的测定，酵母耐酒精能力的测定，不同酵母凝聚性的测定 4、测定指标及其方法 4.1发酵前后发酵液中还原糖含量的测定:DNS法 本实验采用DNS法，利用可见光分光光度计，在540 nm波长下进行比色测定，测定酒样的光密度值，确定酒中总糖含量，操作简捷，杂质干扰少。 酶活的定义:1 mL酶液于上述条件下，1min内产生1μmol葡萄糖量的酶量定义为1个酶活力单位“IU”。 1)试剂配置: ?无水葡萄糖标准溶液1mg/mL:称取于105?烘至恒重的无水葡萄糖0.1g，精确到0.0002g，加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀; ?DNS试剂:甲液:溶解6.9g重蒸酚于15.2ml 100g/L的NaOH溶液中，并稀释到70mL，在此溶液中加入6.9g亚硫酸钠。乙液:称取255g酒石酸钾钠，加到300mL NaOH溶液中，再加入880mL 10g/L 3，5-二硝基水杨酸溶液，将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，储存于棕色瓶中，室温下放置7天后使用。 2) 标准曲线的绘制: 4 本实验采用3，5-二硝基水杨酸比色定糖法(DNS)。测定酶解液中还原糖含量，按表1进行葡萄糖标准曲线溶液配置，用分光光度计540 nm下进行比色测定，用空白管溶液调零后，测定各管光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，用回归方程计算出相应的葡萄糖含量。 表1 葡萄糖标准曲线溶液配置表 项 目 空白 1 2 3 4 5 6 7 8 含糖总量(mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 葡萄糖液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1 .6 蒸馏水(mL) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS试剂(mL) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 加热 沸水浴加热10 min 冷却 立即用流水冷却 蒸馏水定容 定容至25 mL 3)发酵前后发酵液中还原糖含量的测定: 取5ml糖化液进行过滤，滤液用pH4.6的醋酸盐缓冲液进行稀释，大约稀释10倍。取甲、乙两支试管，甲试管加入1ml稀释的糖化液，乙管加入1mlpH4.6的缓冲液，分别加入2mlpH4.6的醋酸盐缓冲液和2mlDNS试剂。混匀后沸水浴加热5min，立即冷却定容到5ml。混匀分别于540nm处比色，用乙管调零，测3次，记录光密度值。然后在标准曲线上查得相应的还原糖含量 G mg。再由下式计算样品中还原糖的含量: 还原糖含量(mg,mL)= Ga 式中: a一稀释倍数 G一还原糖量(mg) 4.2酒精发酵液的微生物检查 (1)酵母形态的观察(显微镜观察、拍照) 用美蓝染色法取对数生长期的菌体进行制片，在放大10倍及40倍的显微镜下观察酵母形态，用测微尺测量酵母细胞的大小，并进行死活鉴别。具体步骤如下: ?在载玻片中央加一滴0.1%美蓝染色液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在发酵液上培养了48小时的啤酒酵母少许，放在美蓝染色液中，使菌体与染色液均匀混合。 ?取盖玻片一块，小心地盖在液滴上，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。 ?将制好的水浸片先用低倍镜观察，然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死活细胞，因为活细胞的新陈代谢不停地进行着，所以细胞内氧化还原值(rH)颇小，而还原力强，若有无毒的染料进入细胞，即被还原脱色，但死细胞及代谢缓慢的老细胞无此还原力。美蓝无毒，且能为活细胞还原成无色，故可用以区别细胞的死活。但美蓝浓度、作用时间等均有影响，应加注意。可以 5 选择已知酵母菌进行对比。 酵母菌是单细胞的真核生物，细胞核和细胞质有明显分化，个体比细菌大得多。酵母菌的形态通常有球形、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种形状。酵母菌是通过芽殖进行繁殖，因此有时可以观察到带有芽的菌株。 (2)酵母细胞数的测定(酵母耐酒精能力的测定) ?酵母细胞数测定: ?菌悬液制备，以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。 ?取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。 ?取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 ?静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。 ?在高倍镜下计数:随机计数五个中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16(或25)就得出一大格中的总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。 ?清洗血细胞计数板 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。 ?酵母菌耐酒精能力的测定: 将产酒精能力最强的菌体用去离子水洗涤2次 ，后于 30?和不同的酒精浓度(0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%)条件下进行试验 ，定期取样检测活细胞数:菌体的耐酒精能力以酵母细胞增长数表示 ，酵母细胞增长数(,)=(C-C,t)×100,，C 和C 分别表示发酵时间为t小时的细胞数和刚开始时的细胞数，1010 以表示酵母菌在不同的酒精浓度下的耐酒精能力，每隔8h计数一次，直至48h.。 (3)不同酵母菌产酒精能力的测定(称重法与放出CO2量等) 称重法: ? 糊化:将625mL水加到糖化锅中，按照料水比1:5称取玉米粉125g，在电炉上加热并搅拌，调节pH5.5, 6.0，观察现象，记录下黏度迅速增加时的温度。(玉米淀粉开始糊化温度:62?，终点温度72?) ? 液化:利用液化酶使糊化淀粉水解到一定的糊精和低聚糖程度，黏度降低，流动性增加。(碘反应监测) ? 糖化:待醪液冷却到60?，调节pH值至4.0,4.5，用移液枪(按0.6,0.8%/g淀粉)量取糖化酶加入 糖化锅中，搅拌均匀，放入水浴锅中，保持温度为60?，维持约10h，用碘液测定糖化液是否含还有 淀粉，若未完全则继续糖化直至完全为止。注意开始时液面位置并随时补足由于水的蒸发造成的液面 降低。 ?糖化结束后将糖液pH值调至5.0左右。 ?取一些糖化好的糖化液，测定其还原糖的含量(用DNS法测定)。 ?将糖化好的糖化液分装5个250毫升的三角瓶(每个约150毫升)，接种培养24小时的.酵母菌，接种量为发酵液的10%(约15毫升)。(接种量1:5,10) ?用干布将三角瓶各部分擦干净，称量初始发酵液的重量，将发酵液放于28-30?的培养箱中发酵，并于以后每天称量一次，直至重量减至恒重为止。 (4)不同酵母凝聚性的测定(采用本斯值法) 本实验采用本斯值法。将酵母菌在30?度摇床中摇瓶培养36 h，离心弃上清液，经无菌水洗涤3次后，称 6 重1 g酵母菌泥于刻度15 mL的离心管中，注入10 mL pH值为4.5的醋酸盐缓冲液，20?水浴中放置20 min后，摇动离心管5 min使酵母细胞重新均匀悬浮，静置，记录10 min时酵母细胞沉淀的毫升数，即为本斯值。根据本斯值判断酵母菌株的凝聚性强弱。 4.3 酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力测定 ?试剂配置: (1)2%可溶性淀粉:称取可溶性淀粉2g(预先100?烘干约2h至恒重)，用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。 (2)0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液:称取醋酸钠(CH3COONa?3H2O)2.722，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 (3)20%氢氧化钠溶液 (4)0.1mol/L碘液:称取碘化钾35g和碘13g溶解在100m1蒸馏水中，定容至 1000ml贮存于棕色瓶中。 (5)0.1mo1/L氢氧化钠溶液:称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。 (6)1mol/L硫酸溶液:量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。 (7)0.1mol/L硫代硫酸钠溶液:称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3?5H2O)24.82g和碳酸钠约0.2g(硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定)溶于煮沸后冷却的蒸馏水中(无CO2)，定容至1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。 ?待测酶液的制备: 取发酵液的滤液用pH4.6醋酸钠缓冲液适当稀释，供测定用。 ?酶活力的测定 于甲、乙两支管中，分别加入2%可溶性淀粉溶液25m1及0.2mol/L pH4.6的乙酸缓冲液5ml，摇匀，在40?的恒温水浴中预热5-10min，在甲管中加入待测酶液2ml(酶活总量约100-170单位)，乙管中加2ml蒸馏水作对照，摇匀，立即记时。准确反应1h后，取出各加20%NaOH溶液0.2m1终止酶反应，冷却至室温。 取上述反应液5m1放入碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘液10ml，再加入0.1mol/L氢氧化钠15ml，摇匀后暗处放置15min。加入1mol/L硫酸2m1，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。 计算: 糖化酶活力单位的定义:在40?、pH4.6的条件下，1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。 酶活力单位=(A-B)N ×90.05 ×(1/2) ×(32.2/5) ×n 式中 : A——空白所消耗硫代硫酸钠体积(ml); B——样品所消耗硫代硫酸钠体积(ml); N——硫代硫酸钠浓度(0.1mol/L); 90.05 ——1ml l mol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质(mg); 1/2 ——折算成1m1酶液的量 32.2——反应液总体积(ml) 7 5 ——吸取反应液样品的体积(ml); n ——酶液稀释倍数。 4.4 酒精度的测定(酒精比重计、温度计) 比重计测定法: ?蒸馏:装好全套蒸馏装置，用容量瓶量取100ml发酵液，放入500ml的蒸馏瓶中，加100ml水。迅速安装到冷凝管上进行蒸馏，并将此容量瓶用水洗净后，置冷凝管下端收集馏出液100ml，停止蒸馏，摇匀备用。 ?测定:将酒精比重计慢慢放入酒精发酵液的蒸馏液中，手持温度计插在比重计杆旁，待温度稳定后，酒精停稳时读数，读数应以弯月面下缘为准，观察视线要与弯月面下缘相平。 ?校正:根据所量的酒精度和温度、查表校正为20?时酒精度。 发酵率(%)=(实际发酵产无水酒精量/理论发酵产无水酒精量)×100% =(成熟发酵醪中含酒精量/(发酵液中糖分%×0.6479))×100% 0.6479,发酵糖转化为酒精的转化系数 5 计算酒精出酒率 原酒(kg) 原料出酒率= ————————————— *100% 原料总耗量(kg) 6 计算酒精对糖和淀粉的转化率 葡萄糖发酵生成乙醇的反应式为: CHO?2CHOH+2CO 6126252 糖利用率=(实际所得酒精量/理论上所得酒精量)×100% 淀粉出酒率=(发酵生产中的酒精总量/商品淀粉中的纯淀粉含量)×100% 淀粉利用率=(发酵生产中的酒精总量/理论上应得的酒精量)×100% 理论上1mol葡萄糖可产生2mol乙醇，即180g葡萄糖产生92g乙醇，得率为51.5,，可是实际得率没有这么高。因为酵母菌体的积累约需消耗2,的葡萄糖，另外2,的葡萄糖用于形成甘油，0.5,用于形成有机酸，另0.2,用于形成杂醇油。因此，实际上只有约47,的葡萄糖转化成乙醇。 六、实验记录及结果分析 8