血细胞分析检验程序

血细胞分析检验程序 一、检验目的 血液中血细胞(红细胞、白细胞和血小板)数量、白细胞分类及相关参数(HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW及MPV等)的变化,对临床有关疾病的诊断、观察疾病的变化及治疗效果具有重要参考价值。 二、 检测原理 1.白细胞分类原理 1.1流式细胞术 流式胞术(flow cytometry，FCM)是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术，使被测溶液流经测量区域，并逐一检测其中每一个细胞的物理和化学特性，从而对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。 首先，待测细胞经处理或染色后被压人流动室，与此同时，不含细胞的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在包绕下单行排列，依次通过检测区域.在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两个光源信号分别反映了细胞体积的大小和内部的信息.经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模，数转换器.将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，经计算机处理，可将分析结果显示在屏幕上 。 为了保证细胞单个排列地逐一通过检测区域，鞘流技术在流式细胞术中被广泛应用。根据层流理论，由于两种液体的流速和压力不同。在一定条件下样品溶液与包裹它的鞘液在流动中可以保持相互分离并且同轴。同时鞘液流可以加速样品溶液中颗粒的流动并迫使他们的流动轨迹保持在液流的中轴线上，使细胞单排列地逐一通过检测区域，这便是所谓的液流聚焦原理。 1.2 阻抗法 根据库尔特原理，将不良导体血液按一定比例稀释于等渗的电解液中，在小孔电极的两侧加一恒流源.在负压作用下，使稀释的血细胞通过小孔。当细胞通过截面时会由于电阻增大产生相应的脉冲，其脉冲的幅度与细胞的体积成正比，脉冲的频度与细胞的数量成正比。这便是著名的库尔特原理或称变阻脉冲原理。利用库尔特原理可以有效地区分淋巴及单核细胞 1.3 激光散射法,多角度偏振光散射技术 根据光散射理论，当激光照射到流动室内流过的每一个细胞时，由于细胞的物理特性，部分光线从细胞上经不同的角度散射。其中，前向小角度散射光的光强可以反应细胞体积;大角度散射光的光强可以反应细胞核，浆复杂度和细胞颗粒的信息;而侧向散射光的光强可以反应细胞膜、核膜、细胞质的变化。因此，可以依据细胞表明光散射的特点对细胞进行分类。用激光光源产生的单色光束直接进入计数池的敏感区，在不同角度(10度,7O度)对每个细胞进行扫描分析，测定其散射光强度，从而提供细胞结构、形态的光散射信息。由于粗颗粒细胞的散射强度比细颗粒细胞更强，故光散射对细胞颗粒的构型和颗粒质量具有很好的区别能力，并进一步分辨细胞。该技术采用了l0度窄角和偏振加消偏振检测法，分辨能力有所提高。它首先测试中性，单核细胞，用0度,90度的散射数据，再测得90度D的衍射差，将嗜酸性和中性细胞分开.而嗜碱性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞则按其大小和内部结构不同的复杂性，所产生的散射光也 各异，用可调较的门限加以区分。其采用特定程序自动储存分析数据，并经计算机软件处理，在屏幕上显示6个散点图和2个直方图。 1.4 各种细胞化学特性应用技术 利用五种白细胞自身不同的化学性质.应用相应的化学试剂加以区分 由于嗜酸性(或嗜碱性)粒细胞均有较强的碱性(或酸性)，因此在特殊的溶血剂作用下，经过特定时间及温度的孵育，可使除嗜酸性(嗜碱性)粒细胞之外的所有细胞溶解或萎缩.经处理之后的细胞根据阻抗脉冲计数法，可得相应嗜酸性(嗜碱性)细胞有效数值 利用五种白细胞过氧化物酶活性的差异对白细胞进行染色，测定其酶反应强度，对白细胞进行分析。血液中五种白细胞的过氧化物酶活性排列顺序为:嗜酸性粒细胞>中性粒细胞>单核细胞。淋巴细胞和嗜碱性粒细胞均无过氧化物酶。将待测血液加入清洗剂和甲醛的等渗液体内经孵育，再加入过氧化氢和四氯一萘酚，细胞内过氧化酶分解产生氧离子，使四氯一萘酚显色并沉淀，并定位于酶反应部位。根据酶反应强度的不同，利用光电检测技术测定相应吸光度值的方法,用以区分嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞 1.5 电导，射频法 与早期的三分类血液分析仪利用库尔特原理不同的是，它在内外电极上加了一个RF射频发生器。RF是射频电流的简称.它是一种高频交流变化电磁波。按照工作频率的不同，RF可以分为低频(LF)、高频(HF)、超高频(UHF)和微波等不同种类.不同频段的RF工作原理不同， 和HF频段一般采用电磁耦合原理，而UHF及微波频段的RF一般采用电磁反射原理。在血液分析仪中多采用高频电磁波，其原理是交变电流通过导体时，会在导体周围形成交变电磁场，形成电磁波。因导体的密度及导电性质等差异，其周围所形成的电磁场也不相同。因此当射频电流穿透细胞膜透入胞内时，由于核的大小、化学组分、颗粒多少以及浆核比例的不同，使RF信号发生不同的变化。借此可以将体积大小相同但内部结构不同的细胞区分开来，如淋巴细胞与嗜碱性细 1.6 荧光法 利用不同细胞的细胞膜、胞内因子以及胞内DNA、RNA、胞内离子钙等不同染色特性，选用具有特异性抗原或抗体的荧光染料载体，使待分离的细胞分别标记相应的荧光物质，经过特定波长的激光照射激发出不同波长的荧光，利用各种PMT管检测荧光信号的个数，可以完成待检细胞的计数 如进一步分析计数淋巴细胞或网织红细胞等 1.7 显微镜白细胞分类计数:把血液制成细胞分布均匀的薄膜涂片，经瑞氏染料染色后，在显微镜下根据白细胞形态特征予以分类计数，得出相对比值(百分率)，并观察细胞形态的变化。 BC一5500的白细胞分类结合了液流聚焦技术、激光散射技术和化学染色技术。其光源采用半导体激光系统，通过多角度的激光散射，提供细胞的大小、细胞核、细胞颗粒大小及复杂性的信息.并结合试剂对嗜酸性细胞和嗜碱性细胞的特异处理，将嗜酸性细胞和嗜碱性细胞区分开来，筛选出各类异质细胞，实现精确的五分类检测结果。 BECKMAN COULTRER全自动五分类血球分析仪采用其独特的VCS技术，其中V(体积法)用于分析细胞体积;C(电导法)用于分析细胞核型;S(散射法)则用于分析细胞的颗粒特性。测试时。患者标本经过分血 片等样本分配系统进入搅拌杯中，再加入溶血剂搅拌.溶血.完全破坏红细胞，剩下的白细胞在样本压力作用下进入流式通道。运用VCS联合检测方法，在流式通道的某一位点。对通过的单列白细胞，进行逐个的、同时的、三重的检测以及三维分析，以确定其亚群性质。 ABX-micros 60利用库尔特原理进行红细胞、血小板、白细胞计数和分类(三分群) 2、红细胞和血小板检测原理 最常用的是电阻抗法，红细胞也可采用流式细胞激光检测法，血小板也有用光散射法，或流式细胞仪法检测，用免疫法荧光素标记特异血小板单克隆抗体，用流式细胞仪检测，成本较高。 3、血红蛋白检测原理 光电比色法测量血红蛋白:在稀释的血样中加入溶血剂使红细胞膜破裂释放出血红蛋白，后者与溶血剂中有关成分结合形成Hb衍生物(氰化高铁血红蛋白)，进入Hb测试系统，在特定波长(一般在530,550nm)下比色，吸光度的变化与液体中Hb含量成正比，仪器便可显示其浓度。不同型号的血细胞分析仪配套溶血剂配方不同，形成的Hb衍生物亦不同，其吸收光谱各异但最大吸收均接近540nm。 三、设备性能参数 血细胞分析仪的操作性能因仪器的种类与型号不同而异。 四、标本 1、 临床护士抽取患者抗凝静脉血2,3ml。 2、 采血后立即送到临床检验科。 3、 血量不够1ml或血液凝固、溶血或严重脂血标本不能作检测。 ? 标本保存时间和温度对血细胞分析的影响: 血涂片可保存2h 仪器白细胞分类可保存 8h 白细胞和血小板计数: 4摄氏度 保存24h没什么变化， 常温，白细胞计数逐渐增高，血小板计数逐渐减低; 白细胞分类计数: 8h没多大变化， 血红蛋白定量可保存一周以上 五、设备和试剂 1、设备:ABX、BC-5500血细胞分析仪和贝克曼库尔特五分类细胞分析仪。 2、试剂:仪器配套试剂 稀释液、溶血剂和清洗液、白细胞溶解剂和固定剂;瑞氏染液及缓冲液。 3、购买的试剂应放室温保存，注意防尘、防潮。 4、开封后的试剂应尽快用完，变质、超过有效期的试剂不能使用。 六、容器及试剂添加剂 血液标本采集的容器是一次性含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管;血液标本必需添加剂是EDTA-K2抗凝剂。 ? 不宜选用肝素钠和草酸铵盐抗凝，因其都会影响血小板聚集，使仪器误计为淋巴细胞，使得白细胞总数偏高，淋巴细胞比例升高，中性偏低。但不影响红系结果。 七、校准 每一台新仪器必须投入临床使用前必须进行校准，校准品可以选用厂家提供的校准品，校准时最好选用仪器配套试剂，在仪器校准页面输入相应的校准品的参数，进行定标，仪器经过多次(一般5-6次)测试，计算平均值，标准差，变异系数，与标准品比较，自动计算定标系数，保存。 不同批号和厂家的试剂使用前都要进行定标，平时不要改动定标系数。 八、操作步骤 1、申请单及标本编号 整理血液常规检验申请单及血液标本，审核合格后，对检验申请单和血液标本进行编号。 2、上机测试 3.输入当前患者信息和样品“采集时间”和“接收时间”。 4、仪器检测结果必要进一步镜检标准 根据全国血细胞检验图片镜捡复查规则挑选复检标本，图片，染色，镜检，与仪器结果进行比对。(临床医生要求做红细胞、白细胞、血小板等形态检查的血标本。) 5、复核结果，打印，签名，发放报告单。 6、检测过标本及废物的处理 检测过的血液标本、废液及经血液标本污染的各种废物按血液常规标本的采集与处理程序。 九、质量控制 (一) 室内质控 周一至周五每天做室内质控(厂家提供的质控物)。测定过程是:从4,8?冰箱取出全血质控物置室温，血细胞分析仪开机后预热20min，分别将质控物混匀后上机检测，允许值范围对比，质控合格后才能检测病人血标本。对于失控应按质量控制程序处理，仪器质量控制当天的情况进行逐一登记。 (二)室间质控 每月参加科内的室间质控考评2次。每年参加卫生部和WHO室间质控。 (三)细胞分类计数的质量控制 影响分类计数准确性的因素——细胞分布不均 在一般涂片的尾部中性粒细胞较多，淋巴细胞较少。涂片越薄细胞分布越差，粗糙的推片所制成的血涂片，细胞分布明显不均。当白细胞有聚集现象时，细胞分布极不规则，以致无法准确地进行分类。胞 体在的细胞和幼稚细胞分布在涂片的尾部和边缘，相反，淋巴细胞和嗜碱性粒细胞则位于涂片的头部和体部。因此，在日常操作中，应尽量注意这些问题。 ?十、干扰因素 1、严重的黄疸或脂血使血红蛋白结果假性增高。(?蛋白，脂类，均可产生浊度，因血红蛋白检测采用比色法，故，可使结果升高，可以将样本稀释，减低浊度，重新检测) 2、红细胞冷凝集可使血红蛋白假性增高，红细胞比积假性减低?MCH,MCHC?、MCV?。(37摄氏度温育30Min再检测) 3、抗凝剂的不正确选用，用非EDTA-K2抗凝管，双草酸盐-枸橼酸钠-肝素钠 白细胞分类中性粒细胞比例逐渐下降，淋巴比例上升特别是肝素钠影响最大。标本4?保存，肝素钠抗凝的PLT下降最厉害,2小时下降50%，EDTA-K2最稳定，8小时没明显变化。20?，草酸盐和EDTA-K2 ，PLT计数8小时变化不大。32?PLT计数均有升高。 4、标本采集不当，如输液侧采血，使标本稀释;采血不顺，时间过久，或混匀不及时，抗凝不好，有凝块。 5、标本采集时间不同，结果有差异，如白细胞早晨和下午结果有一倍的差异，体位不同，站立时体液因重力因素流向下肢，站立血液标本血浆含量比卧位高，标本稍有稀释，结果会有所偏低;病人状态，如兴奋，激动，运动，妊娠，白细胞都会升高。地理差异等等。 十二、生物参考区间 省略 十三、患者检验结果可报告区间 (一)阻抗法仪器 9129 WBC:(0.2,99.99)×10/L，RBC:(0.50,9.99)×10/L，HGB:0,299g/L，PLT:(10,999)×10/L。 (二)激光法仪器 9129 WBC:(0.02,400)×10/L，RBC:(0.05,7.00)×10/L，HGB:0,225g/L，PLT:(5,3500)×10/L。 十四、警告/危急值 9129 白细胞小于2.0×10/L;红细胞小于1.0×10/L;血红蛋白小于50g/L;血小板小于20×10/L。