覆盆子提取物联合唑类药物抗真菌活性研究

覆盆子提取物联合唑类药物抗真菌活性研究 覆盆子提取物联合唑类药物抗真菌活性研 究 ? d?中国真菌学杂志2012年2月第7卷第1期ChinJMycol,February2012,Vol7,No.1 覆盆子提取物联合唑类药物抗真菌活性研究 ? 论着? 张石群林辉苗琦刘伟曹永兵姜远英 (1.第二军医大学药学院药理学教研室,上海200433;2.福建中医药大学药学院中药教研室,福 州350108) 【摘要】目的探讨中药覆盆子提取物联合唑类药物的体外抗真菌作用.采用CLSI公布 的M27一A方案微量液基 稀释法和棋盘式微量稀释法,测定覆盆子提取物单用及联合唑类药物对不同念珠菌的MIC 值和FICI指数.结果覆盆子 不同溶液提取物与氟康唑均表现出协同关系,以覆盆子醇提物为例,单用对念珠菌的MIC? 测定值范围主要集中在0.16— 1.25ms/mL,与氟康唑合用后表现出协同关系(FICI?0.5),且MIC80测定值范围降至 0.O1—0.04ms/mL;合用后的氟康唑 抗真菌活性也明显增强.另外,覆盆子醇提物与不同唑类药物合用后均有协同关系,其MIC 测定值由单用时大于10ms/ mL降至0.04ms/mL.结论覆盆子醇提物和唑类药物单用时对耐药念珠菌的抑菌作用较弱, 但二者合用后表现出明显的 协同关系,对耐药念珠菌的抑菌作用明显增强. 【关键词】覆盆子;醇提物;体外抗真菌活性;部分抑菌浓度指数(FICI) 【中图分类号】R379【文献标识码】A【文章编号】1673—3827(2012)07-0004-04 CombinationantifungalactivityofethanolextractsfromRubusidaeusandantifungalazoles ZHANGShi.qun,LINHui,MIAOQi,LIUWei,CAOYong—bing,JIANGYuan—ying? (DepartmentofPharmacology,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200 433;2.Departmentof Chinesemedicine,SchoolofPharmacy,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350 108) 【Abstract】 ObjectiveToinvestigatetheantifungalactivityofextractsfromRubusidaeuscombinedwithazoledrugsag ainst Candidaspp.invitro.MethodsTheminimuminhibitoryconcentration(MIC),thefractionalinhibitoryc oncentrationindex(FI— CI,ofextractsfromRubusidaeusandcombinationwithazoledrugsagainstCandidaspp.weredetermine dbyM27一AMicrodilution MethodbasedonCLSI.ResultsAllextractsfromRubusidaeusbydifferentsolutionmethodsshowedcol laborationwithfluconazole. Forexample,theMIC80ofethanolextractsfromRubusidaeusagainstCandidaspp.mainlyconcentrated on0.16,1.25ms/mL, whilecombinedwithfluconazoleshowedthecollaboration(FICI?0.5),andtheMIC80reducedto0.01,0.04ms/mL.Theanti- fungaleffectoffluconazoleagainstCandidaspp.wasalsostrengthened.Besides,theMIC80Sofethanol extractsfromRubusidaeus werealsoreducedfrom10ms/mLto0.04ms/mLwhenbeingcombinedwithotherazoledrugs.Conclusio nTheantifungaleffectof ethanolextractsfromRubusidaeusorazoledrugsagainstresistantCandidaswasweaker,whilethecombi nationshowedclearcollabo— rationandtheeffectagainstresistantCandidaspp.significantlyenhanced. 【Keywords】 Rubusidaeus;ethanolextracts;invitroantifungalactivity;fractionalinhibitoryconcentrationindex(FICI) [ChinJMycol,2012,7(1):4_7] 近10a来,随着器官免疫抑制剂,广谱抗生素 的滥用,免疫功能低下者人数不断增多,真菌感染 发生率逐年剧增.目前治疗真菌感染的常用药物 为氟康唑,伊曲康唑,两性霉素B等,然而,随着抗 真菌药物的大量使用,真菌耐药现象越来越普遍, 耐药程度也越来越高,耐药性已成为临床抗真菌治 作者简介:张石群,男(汉族),硕士研究生在读.E—mail:zhang— shiqun1987@163.com;林辉,男(汉族),硕士研究生在读.E?mail: nuLi60tian@163.corn 通讯作者:曹永兵,E—mail:ybcao@vip.sina.com;姜远英,E—mail: jiangyy@smma.edu.cn 疗失败的主要原因?.因此,人们考虑通过联合用 药的方式对抗耐药真菌,这种方式可以达到增强临 床疗效,降低耐药性产生,减少不良反应的效果. 或使用其他药物,如中成药,可降低不良副作用的 发生率.覆盆子(Rubusidaeus)为蔷薇科悬钩子 属植物掌叶覆盆子(RubuschingiiHu)的近成熟 干燥果实.覆盆子性微温,味甘,酸,归肝,肾经,具 补肝益肾,固精缩尿,明目之功效,主治肾阳虚惫, 宫冷不孕,尿频,遗尿,虚劳,须发早白等症j,暂未 发现其抗真菌作用.肖洪明等通过硅胶柱色谱 等手段对覆盆子进行分离提取,发现了山柰酚,紫 中国真菌学杂志2012年2月第7卷第1期ChinJMvcol.February2012,v017.No.1 云英苷等18个化合物,其中化合物20【,19a.di- hydroxy一3一OXO-12一ursen-28-oicacid首次从该属植物 中发现. 本课题组前期从30余种中药提取物中进行活 性筛选,发现了覆盆子提取物可以联合抗真菌药物 有效抑制耐药真菌,并对其联合唑类药物的体外抗 真菌作用进行探讨. 1材料与方法 1.1材料 受试菌种白念珠菌(Candidaalbicans)l8 株,克柔念珠菌(Candidakrusei)1株,近平滑念 珠菌(Candidaparapsilosis)1株,烟曲霉菌 (Aspergillusfumigatus)1株,热带念珠菌 (Candidatropica1)1株,其中标准株2株,白念珠 菌sc5314由WilliamA.Fonzi教授惠赠,白念珠菌 ATCC10231由长海医院菌种保存中心赠送;其余 均为长海医院真菌室提供的临床菌株. 供试中药覆盆子,产地:浙江,批号: 2011030134. 1.2方法 中药提取方法将中药覆盆子粉碎,称取5g 粉末加70%乙醇,9O?水浴回流2h;回流液过滤 后用旋转蒸发仪50~C减压蒸馏,至浓缩成流浸膏, 烧瓶内加蒸馏水至提取液为5g,分别用无水乙醇, 三蒸水,DMSO溶解得到覆盆子的醇提物,水提物, DMSO提物,最后超声使其充分混匀,分别得到0.5 g生药/mL,-20~(2保存备用. 茵悬液的制备用接种圈从4clC保存的SDA 培养基上挑取少量念珠菌,接种至1mLYEPD培 养液,于30~C,200r/min振荡培养,活化16h使真 菌处于指数生长期后期.取该菌液同样方法再次 活化,16h后用血细胞计数板计数,以RPMI1640 培养液调整菌液浓度至1×10一5×10.CFU/mL. 药物敏感测试板的制备取无菌96孔板,于 每排1号孔加RPMI1640培养基100IxL作空白对 照;3,12号孔各加新鲜配制的菌液100L;2号 孔分别加菌液和受试药物,菌液和受试药物的总体 积为200IzL.2—11号孔逐级倍比稀释,12号孔 只加菌液100L,不含药物,作为阳性对照. 棋盘式微量稀释法合用的两种药物于 96孔板上以二维棋盘的纵(A至H)横(2至11) 两方向分别进行2倍的倍比稀释.例如覆盆子提 取物与另一种抗真菌药物氟康唑合用后,使得氟 康唑的终浓度为64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25 和0.125g/mL,覆盆子提取物的终浓度为10,5, 2.5,1.25,0.62503130.160080.04,0.02 和0.01mg/mL.与覆盆子提取物合用的其他抗 真菌药物(酮康唑,咪康唑,伊曲康唑)的终浓度 为0.125—64g/mL. 最低抑茵浓度(MIC值)的判定在35?恒 温箱中,念珠菌培养48h后用酶标分析仪于630 nm测各孔OD值.根据2009年临床试验标准化 研究所(CLSI)提出的M27一A3方案J:与阳性对 照孔比,以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的 药物浓度为MIC..(真菌生长80%被抑制时的药物 浓度).当药物的MIC.值超过测定浓度范围时, MIC..值高于最高浓度64I.Lg/mL时,计为”>64 i.Lg,/mL”;MIC.值为最低浓度或在最低浓度以下 时,均计为”?0.125I.~g/mL”.上述实验均平行操 作2,3次,当MIC.值能准确重复或只差一个浓度 时才被接受,并以较高浓度作为MIC.值;当MIC舳 值相差两个浓度以上时,则需重新实验,直到符合 要求为止. 联合用药的效果评价部分抑菌浓度指数 (fractionalinhibitoryconcentrationindex,FICI)是评 价联合用药的两药相互作用方式的主要参数.抑菌 浓度分数(FIC)分别为每一种药物联合抑菌时所需 最低抑菌浓度(MIC)与单用时MIC的比值,而FIC 指数(FICI)则等于两种药物FIC之和.本实验选 用目前国外期刊采用的标准:当FICI?O.5时,两药 的相互作用确定为协同作用;O.5<FICI?4时为无 关作用;当FICI>4时两药产生拮抗作用j. 2结果 2.1覆盆子不同溶液提取物单用及联合氟康 唑对受试菌C.albicans103的作用 覆盆子的醇提物,水提物,DMSO提物单用时 对受试菌C.albicans103的MIC.测定值为大于10 mg/mL,与氟康唑联合使用后表现出协同作用, MIC80测定值为0.04mg/mL;并且,氟康唑的MIC舳 测定值由大于64p~g/mL降至0.125—0.5p.g/mL (见表1). 2.2覆盆子醇提物单用及联合氟康唑对不同念珠 菌的MIC舯测定结果 以下实验均以覆盆子醇提物为例,单用对敏感 ? 6?中国真菌学杂志2012年2月第7卷第1期ChinJMyco|,February2012,Vol7,No.1 念珠菌的MIC.测定值:在0.02—1.25mg/mL之 间,与氟康唑联合使用后有协同关系(FICI?0.5) MIC.测定值:在0.02—0.04mg/mL之间;并且联 合使用后氟康唑的MIC.测定值由0.25—2p~g/mL 降至0.125,0.5p,g/mL.单用对耐药念珠菌的 MIC.测定值:主要集中在0.16,10mr,/mL之间, 与氟康唑联合使用后有协同关系(FICI?0.5) MIC80测定值:主要集中在0.01—0.313mg/mL之 间;并且联合使用后氟康唑的MIC..测定值由大于 64g/mL降至0.125,16Ixg/mL(见表2). 表1不同覆盆子提取物单用及联合氟康唑对C.albicans103的作用(g/mL) Tab.1EffectofdifferentRubusidaeusextractssinglelyandcombinationwithfluconazoleagainstC.albi cans103(g/mE) 表2覆盆子醇提物单用和联合氟康唑对不同念珠菌的作用(g/mL) Tab.2EffectofRubusidaeusethanolextractssinglelyandcombinationwithfluconazoleagainstdifferen tCandidaspp.(g/mE) 实验室 标准菌 SC5314 ATTC10231 临床敏感C.albicans465 念珠菌C.al杭113187 C.al杭112721 C.parap90018 临床耐药C.albicans904 念珠菌C.albicans953 C.albicans32 C.albicans82 C.albicans557 C.albicans502 C.albicanslo3 C.albicans100 C.albicansJ5 C.albicansJ28 C.albicansJ38 C.al杭112869 C.al杭112678 C.kruse4996 C.tropical2718 A.fumigatus7544 156.25 156.25 1250 1250 156.25 19.53 78.125 1250 156.25 156.25 156.25 1250 >l0000 >1OooO 156.25 156.25 156.25 1250 1250 39.06 >10000 >10000 O.25 O.5 0.5 2 2 0.5 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 64 >64 >64 19.53 19.53 39.06 19.53 39.O6 4.88 19.53 3l2.5 9.77 9.77 9.77 19.53 39.06 39.06 39.O6 9.77 19.53 19.53 9.77 9.77 9.77 156.25 0.125 O.125 0.25 O.5 O.5 O.5 0.125 0.25 16 8 8 0.5 O.125 0.125 O.5 1 1 1 1 64 1 >64 0.625 0.375 O.531 0.266 0.500 1.250 0.250 0.250 0.188 O.125 0.125 0.020 0.003 0.003 0.254 0.070 0.133 0.023 0.016 1.250 O.008 1.008 非协同 协同 非协同 协同 协同 非协同 协同 协同 协同 协同 协同 协同 协同 协同 协同 协同 协同 协同 协同 非协同 协同 非协同 中国真菌学杂志2012年2月第7卷第1期ChinJMyco1.February2012,Vol7,No.1?7? 2.3覆盆子醇提物单用及联合不同抗真菌药物对 受试菌C.albicans100的MIC8.测定结果 以受试菌C.albicans100为例,覆盆子醇提物 单用时的MIC.测定值大于10mg/mL,与氟康唑, 酮康唑,伊曲康唑,咪康唑合用后均表现出协同作 用,MIC80测定值为0.04mg/mL;同时,不同唑类药 物的MIC.测定值由单用时的大于32I~g/mL降至 合用后的0.125Ixg/mL(见表3). 表3覆盆子醇提物单用及联合不同唑类药物对ealbicans100的作用(p~g/mL) Tab?3EffectofRubusidaeusethanolextractssinglelyandcombinationwithdifferentazoledrugsagains tC.albicans100(~g,/mL) 3讨论 念珠菌是人类最常见的条件致病菌之一,在免 疫缺陷者身上极易发生感染,其中白念珠菌,克柔 念珠菌,热带念珠菌,近平滑念珠菌等所致感染占 念珠菌病的95%左右.由于氮唑类药物的广泛使 用已经导致白念珠菌对该类药物耐药现象快速增 多,对药物治疗带来严重威胁.联合用药是目前抗 真菌药的研究热点之一,不仅能够缩短治疗周期, 降低药物毒副作用和剂量,而且还可扩大药物抗菌 谱,避免耐药性的出现. 从2O世纪20年代开始,人们便开始从中药中寻 找高效低毒的抗真菌中药,由于其副作用小,来源广, 价格低廉,较少出现耐药性等优势,使研究开发抗真 菌中药具备良好前景.至今已发现300多种中草药 在试管内有抗真菌活性具有良好的抗真菌作用J, 本实验室前期通过筛选30余种中药提取物对受试菌 株进行体外药物敏感试验,发现覆盆子可以联合唑 类药物有效提高抗真菌活性.覆盆子不同溶液提取 物与氟康唑联合使用后均表现出协同关系,与临床 敏感菌相比,覆盆子醇提物与氟康唑联合后对临床 耐药菌的协同关系更显着,抗真菌作用更明显,MIC蚰 测定值可从单用时大于0.08mg/mL,降至合用后的 0.04mg/mL以下;除对C.albican32,C.albican842, ealbican557,氟康唑的MIC舯测定值均从大于64 p~g/mL降至0.125,1p.g/mL.另外,覆盆子醇提物 与不同唑类药物合用均有协同关系,其MIC.测定值 由单用时大于10mg/mL降至0.04mg/mL.以上实 验结果可以看出覆盆子提取物本身有一定的抗真菌 作用,而与唑类药物合用后有明显的协同关系,抗真 菌作用明显增强. 中药粗提物中含有多种化学成分,成分与药理 作用都很复杂,受多种因素影响.因此,我们今后 的工作重点是从已经发现的具有抗真菌协同作用 的中药中,利用不同的提取方法提取有效单体成 分,进而对不同的有效成分进行抗真菌机制的研 究.另外还可以针对高效低毒作用机制,设计选择 性作用靶点以减少用药量,进行高通量筛选化合物 或先导化合物,为合成新的抗真菌药物奠定基础. 参考文献 [1]LuXiao-qin,Lihua,ZhouLi,eta1.Infectiondistributionand drugresistanceanalysisofCandidaalbicansjJ1.ChinJInfect Control,2007,6(6):419421. 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