孕妇外周血中胎儿有核红细胞获取及鉴定的研究进展

孕妇外周血中胎儿有核红细胞获取及鉴定的研究进展 孕妇外周血中胎儿有核红细胞获取及鉴定 的研究进展 广西科学GuangxiSciences2007,14(2):132~136 孕妇外周血中胎儿有核红细胞获取及鉴定的研究进展 ResearchAdvanceofObtainingandIdentifyingFetal NucleatedRedBloodCellsinMaternalPeripheral Blood 袁海,龙桂芳 YUANHai,LONGGui—fang (广西医科大学第一附属医院儿科,广西南宁530021) (DepartmentofPediarics,theFirstHospitalAffiliatedtoGuangxiMdicalUniversity,Nannin g, Guangxi,530021,China) 摘要:从孕妇外周血中获取胎儿有核红细胞是安全,方便,易于被孕妇接受的无创 性产前诊断.提取孕妇外周血 中胎儿有核红细胞最理想的方法是首先富集孕妇外周血,用胚胎或者胎儿血红蛋 白抗体进行标记,识别,应用显 微操作技术得到单个有核红细胞,继而扩增单个有核红细胞的基因组DNA,并进 一步应用STR连锁分析验证 为胎源性,进行遗传病诊断. 关键词:有核红细胞外周血胎儿孕妇产前诊断 中图法分类号:R714.55文献标识码:A文章编号:1005-9164(2007)02—0132—05 Abstract:ObtainingfetalnucleatedredbloodceU(NRBC)fromperipheralbloodofpregnant women isasafeandconvenientapproachofnon— invasiveprenataldiagnosis,whichiseasilyaccepted.The idealestmethodofobtainingitisdescribedasfollow:NRBCswereseparatedfrommaternal peripheralblood,labledandidentifiedwithantibodiesagainstembryoorfetalcells.SingleN RBC wasthencollectedbymicromanipulatorundermicroscopicobservationfollowedbythewho le genomeamplificationofsinglecel1.Afterthis,STRlinkageanalysiswasusedtoverifythefet al originforfurtherdiagnosisofhereditarydisease. Keywords:nucleatedredbloodcell,peripheralblood,fetus,pregantwoman,prenataldiagn0 sis 传统的产前诊断手段虽然诊断准确率较高,但是 对母儿具有危险性,使之长期以来只应用于具有遗传 病高发风险的孕早期和孕中期妇女,且不易为孕妇所 接受.多年以来,人们致力于寻求一种无创伤性的产 前诊断方法.孕妇外周血中存在胎儿细胞这一发现为 此项研究提供方向.孕妇外周血中已发现的胎儿细胞 有合体滋养细胞,胎儿淋巴细胞,胎儿粒细胞,胎儿有 核红细胞(nucleatedredbloodcell,NRBC)等uJ,其中 胎儿NRBC具有众多分离及诊断优势,是目前最受 关注的用于产前诊断的目的细胞[2叫].由于孕妇外周 收稿日期;2007—01—31 修回日期;2007—03—21 作者简介;袁海(1979一),男,硕士研究生,主要从事儿童血液病研 究工作. *广西科学基金资助项目(桂科攻0015042). 132 血中胎儿细胞数量稀少,如何得到足够数量的纯胎儿 细胞用于临床产前诊断一直是困扰医学界的难题.随 着科学技术的发展,胎儿细胞特异抗体表达的研究以 及胎儿细胞筛选,纯化,全基因组扩增技术的发展成 熟,使无创性产前诊断取得巨大进步,显示出广阔的 临床应用前景. 1~Jf1)LNRBC的数量及富集最佳时期 由于所采用的技术方法不同,富集NRBC的数 量及最佳时期也有差别.Bianchi等应用定量PCR 对孕妇外周血中胎儿NRBC进行定量,结果在9O例 孕46,XY胎儿的孕妇外周血中NRBC的平均数量 为19(o-91)/16ml,109例孕46,XX胎儿的外周血 中平均数量约为2(o-24)/16ml.国内马旭等[6对41 例孕6,14周的妇女连续每周采血1次,应用PCR GuangxiSciences,Vo1.14No.2,May2007 技术检测血中Y染色体特异锌指蛋白基因(ZFY), 结果怀男胎的19例孕6周,ll周,14周孕妇ZFY的 检出率分别为51.3%,68.14,95.10,妊娠女胎 的孕妇无一例ZFY阳性,提示胎儿细胞进入孕妇外 周血循环的量随妊娠的进展逐渐增多,他们认为分离 胎儿细胞的最佳采血时间是孕14周.而Rodriguez 等[7应用双重密度梯度离心和MACS分离胎儿细 胞,FISH证实胎源性,表明胎儿NRBC从孕早期到 孕中期逐渐增高,认为孕15周是挑选胎儿NRBC进 行非损伤性产前诊断的最佳时期. 2胎儿NRBC富集与分离纯化方法 由于孕妇外周血中胎儿NRBC的数量很少,要 得到胎儿NRBC必需使用高效敏感的方法对其进行 富集与分离纯化.目前进行富集分选的方法主要有荧 光激活细胞分选法(fluorescenceactivatedcell sorting,FACS),磁激活细胞分选法(magnetic activatedcellsorting,MACS),电荷流式分离法 (chargeflowseparation,CFS),密度梯度离心分离法 (densitygradientcentrifugation)和RosetteSep分离 法. 荧光激活的细胞分选法又称流式细胞计数法,是 Bianchi于1990建立的,其原理是通过流式细胞仪测 定流式差的细胞悬液中萍个细胞所发出的散射光和 荧光等多种参数,然后通过细胞分选器将特定的细胞 从整个细胞体中分离出来[8].流式细胞分选法是目前 应用最广泛的细胞自动分析分选技术之一.其优点是 分离纯度高,缺点是价格昂贵,操作技术复杂,较费 时,不适于在临床推广. MACS是1990年Miltenyi[9建立的,其原理是 用结合磁性微粒的单克隆抗体标记细胞,在外加磁场 的作用下,磁激活细胞分选器可将样品中带磁与不带 磁的细胞分开,以达到分离纯化的目的.目前使用较 多的单克隆抗体为GlycophorinA,CD36,CD45和 CD71,Prieto等[1多次使用2B7.4单克隆抗体标 记NRBC,均能更好地收集NRBC.Yang等D33对孕妇 外周血用CD45,CD71标记的阴性和阳性免疫磁珠 分选,Kleihaur—Betke染色和FISH鉴定的结果显示, 该方法判定男胎的敏感度为100%,特异度为 91.7%,判断女胎的敏感度为91.7,特异度为 100.MACS设备简单,操作亦不复杂,分离速度 快,适用于作遗传分析.但MACS分选的依据只是细 胞表面抗原的不同,需要特殊标记的抗体,且细胞丢 失严重,必须结合其他的筛选方法才能得到一定纯度 的胎儿细胞. 广西科学2007年5月第14卷第2期 CFS的原理是利用细胞表面的电荷不同,在电 场力的作用下有不同的迁移速度而达到分离细胞的 目的.Wachtel等[1胡应用此法对16例孕妇外周血样 进行初步分离,发现每20ml血样中平均有2000个 NRBC,均经与染色体的荧光原位杂交证实.此法的 优点是分离迅速,分离过程不需要抗体,被分离的细 胞具有活性,但是分离出的有核红细胞纯度不高,欲 得到纯的胎儿细胞,还需与其他方法合用. 密度梯度离心法可获得不同密度的NRBC.密度 梯度离心法根据形成梯度的多少可分为双重密度梯 度离心法,三重密度梯度离心法和不连续密度梯度离 心法.双重密度梯度离心法和三重密度梯度离心法均 不易形成肉眼可见的有核红细胞层,分离效果较差. 而不连续密度梯度离心法对新鲜孕妇外周血进行离 心,有核红细胞层位于1.075g/ml和1.085g/ml之 间.这种方法操作简单,细胞比例高,价格低廉,适合 推广到临床.但大多数细胞经密度梯度离心后仍为母 源性,因此需要与其他方法如MACS,FACS或者显 微操作等合用,才能较好地分离出胎儿NRBC. RosetteSep分离法的分离液是含有多种单克隆 抗体的单抗混合物,使非靶细胞与全血中的多个红细 胞交联,形成免疫玫瑰花结.这增加了非靶细胞的密 度,当进行密度梯度离心时,非靶细胞会随着红细胞 聚集沉淀,未被抗体标记的靶细胞即可被收集.此分 离不需要如MACS,FACS等任何其他特殊仪器设 备,收集的靶细胞可直接用于以后的研究.最近 Bischoff等[1]运用RosetteSep结合单密度梯度离心 法方法分别对81例孕妇外周血胎儿细胞进行分离并 timePCR进行检测,结果令人满意. 用FISH及real— 3NRBC来源的遗传学鉴定 由于从孕妇外周血中富集到的NRBC有一部分 来源于母亲,因此需要对NRBC进行来源的遗传学 鉴定.目前所用细胞表面主要标识有CD71,CD36及 GPA(glycophorinA,血型糖蛋白A)受体.然而并非 所有的胎儿NRBC都表达CD71,同时孕妇外周血中 也有少量细胞表达CD71.单独应用CD71MCAB分 选胎儿NRBC纯度较低,GPA特异性较强[1,但可 引起靶细胞凝集而影响分离效果[1.细胞内标志有j: 珠蛋白,e珠蛋白,7珠蛋白[18,19].胎儿最早出现的血 红蛋白是HbGowerI(j:2e2)和HbGower?(a2e2),随 后出现HbPortland(j:.7.).在孕程12周后主要为 HbF(a272),而成人则以HbA(a2B2)为主.Albita[2叩发 现在正常人外周血中j:珠蛋白也可有所表达,而7珠 蛋白在成人外周血中同样有少量的表达,但是数量极 133 微,目前研究较多的是用珠蛋白抗体,分离胎儿 NRBC.但是对于a地中海贫血病人,外周血中可有 较多的珠蛋白_2?,而口地中海贫血患者外周血中 珠蛋白表达增多_2引,且妊娠也会使母体珠蛋白表 达增多_2引.相对于,珠蛋白,e蛋白在成人红细胞 中完全不表达.Choolani_2研究表明e阳性胎儿 NRBC容易与母体e阴性NRBC区分开,且在孕l2 周仍有1/2的e阳性细胞可被检测到.Mavrou等_25] 的实验结果也提示,e珠蛋白是很好的胎儿NRBC鉴 定标识物,是孕程早期阶段诊断识别胎儿细胞的有利 工具,可用于胎儿NRBC的鉴定. 此外,还可以对Y染色体特异序列进行PCR扩 增或用Y染色体特异序列的探针进行荧光原位杂 交引.这种方法受胎儿性别的限制.随着显微操作与 PCR技术的发展,使得挑取单个细胞进行PEP扩增 成为可能.通过挑取富集的单个细胞与母源DNA进 行连锁分析能确定有核红细胞的来源,这种方法不受 胎儿性别的限制. NRBC鉴定的方法有荧光素原位杂交 (Fluorescenceinsituhybridization,FISH),引物原位 标记技术(primedinsitulabeling,PRINS),引物延伸 预扩增法(primerextensionpreamplication,PEP),多 重置换扩增(multipledisplacementamplification, MDA),STR—PCR进行胎源性鉴别. FISH是一种非放射性原位杂交法,它利用特殊 的荧光素标记DNA探针,在染色体制片,细胞滴片 或组织切片上进行DNA杂交,经免疫荧光显色,可 以检测细胞内DNA或RNA序列存在与否,其快速, 安全,灵敏度高,特异性强,使快速诊断染色体的异常 成为可能,已成为新的产前诊断的方法_2. Babochkina[..认为由于母体内的高氧环境使得胎儿 NRBC发生皱缩,不易被FISH所识别.Shin等[293应 用五色荧光原位杂交,通过细胞分选标记X,Y,l3, l8,2l号染色体,准确识别非整倍体妊娠.最近,在美 国应用电脑软件,开发了实用光谱影像诊断法 (appliedspectralimaging,ASI),应用skypaint特异 性探针作杂交,再以ASI系统成像,最后以skyview 光谱核型分析电脑软件运算处理频谱,可分辨出一般 摄影机或肉眼无法分辨出的影像颜色.此skypaint探 针可显示24种不同颜色,即彩色FISH. PRINS技术是继原位PCR之后而创建的分子 细胞生物学新技术,用于细胞或染色体原位检测 DNA或RNA.PRINS技术将PCR技术和原位杂交 技术有机结合,兼有放大目的基因和定位的特点.最 新的国外研究将该技术应用于染色体异常,单拷贝基 134 因的异常以及肿瘤相关基因变异等研究_3D]均有成功 报道,从而揭示了其强大的临床应用潜力.Krabchi[] 对l2例妊娠中期孕男性胎儿的孕妇,取3ml外周血 未经富集运用FISH和PRINS技术进行标记,通过 荧光显微镜识别胎儿XY细胞,可以得到2,6个胎 儿细胞.我国陈汉平等_3.采用PRINS,PEP和巢式聚 合酶链反应方法检测孕妇外周血中单个胎儿细胞的 性别决定区Y基因(SRY)基因片段的结果表明, PRINS检测SRY基因的敏感性97.56,特异性 i00,在三种方法中最高,PEP技术加PCR方法检 测SRY基因的敏感性为97.399/5,特异性为 99.17,也远高于巢式聚合酶链反应的80和 87.5%.证实PRINS和PEP—PCR这两种检测技术 敏感性高,特异性强,适用干单细胞基因的检测.最 近,Krabchi_3妇又运用双色PRINS技术对孕妇外周血 中分离的胎儿细胞XY染色体进行不同颜色标记,其 鉴别效果与FISH相似,但在耗时和费用方面却优于 FISH. PEP主要以15个碱基的随机寡核苷酸为引物, 在DNA聚合酶的作用下,通过多次热循环反应,使 原有的基因组拷贝数放大数十倍,取小份产物可以进 行多位点PCR扩增或重复扩增特异基因序列,以证 实实验结果_3引.有研究表明,单个拷贝的二倍体细胞 用PEP技术可使其789/5的基因组序列增加30倍以 上_3引.Sekizawa等_3首次成功地应用胎儿NRBC,经 过PEP进行全基因组扩增,对Duchenne型肌营养不 良症(DMD)进行产前诊断.此技术解决了孕妇外周 血中胎儿细胞数量少,难以成为临床实用的非创伤性 产前诊断方法的难题. MDA能够提供高度均一完整的全基因组序列, 确保最低的位点扩增误差,使产物与模板的遗传序列 信息保持一致,是一种真正意义的全基因组扩增方 法_3引.在100/A反应体系中,从100fg到10ng的起始 模板扩增后的DNA产物都能一致地保持在20, 30/~g,十分稳定_3,且平均长度>lOkb,能更有效的 解决胎儿细胞模板量不足的问题. STR(shottandemrepea,短串联重复序列)是由 长度为l,6个碱基的核心序列串联重复而成,由于 重复数目的差异而构成STR等位基因的遗传多态 性.采用STR的多态位点结合PCR来扩增获得STR 多态片段.STR位点扩增片段长度等位基因传递符 合孟德尔遗传规律,代表胎儿的DNA仅有一半与孕 妇外周血DNA基因型相同,另一半与父亲相同,则 可确定血浆中检出了胎儿DNA.这对确定细胞的来 源是否为胎源性有着重要的判断价值.该技术对男女 GuangxiSciences,Vo1.14No.2,May2007 性胎儿均能检测到,弥补了检测SRY基因鉴定胎儿 DNA受胎儿性别限制的缺陷,从而可以作为判断所 取细胞的来源.韦红英等L3对28例轻型地中海贫血 孕妇外周血中获取的298个NRBC进行PEP—PCR 后,运用STR--PCR进行胎源性鉴别,结果证实其中 胎儿NRBC130个,占43.6. 4结束语 孕妇外周血中胎儿细胞的发现为非侵人性产前 诊断提供了一个新的发展前景.目前最理想的提取孕 妇外周血中单个胎儿有核红细胞的方法是首先取孕 妇外周血进行富集,用胚胎或胎儿血红蛋白抗体进行 标记,识别,应用显微操作技术得到单个有核红细胞, 继以各种PCR技术扩增单个有核红细胞的基因组 DNA,并进一步应用STR连锁分析验证为胎源性, 进行遗传病的诊断. 无创性产前基因诊断方法目前己有了突破性进 展,但仍有一些问题有待不断探讨解决.比如,胎儿 NRBC在母外周血中的量及最佳富集时间,寻找敏感 的胎儿NRBC特异性标记避免母血污染,操作步骤 的简化以及如何降低实验费用使之广泛应用于I临床. 相信随着生物技术的成熟,从孕妇外周血提取胎儿 NRBC进行产前诊断将广泛应用于临床. 参考文献: [1]KOLVRAAS,CHRISTENSENB,LYKKE—HANSEN L,eta1.Thefetalerythroblastisnottheoptimaltarget fornon—invasiveprenataldiagnosis:preliminaryresults EJ].JHistochemCytochem,2005,53:331—336. r2]KITAGAWAM,SUGIURAK,OMIH,eta1.New techniqueusinggalactose—specificlectinforisolationof fetalcellsfrommaternalbloodEJ].PrenatDiagn,2002, 22(1):17—21. 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(责任编辑:邓大玉) GuangxiSciences,Vo1.14No?2,May2007