【doc】离子对反相高效液相色谱法测定人血浆中吉西他滨的药物浓度

【doc】离子对反相高效液相色谱法测定人血浆中吉西他滨的药物浓度 离子对反相高效液相色谱法测定人血浆中 吉西他滨的药物浓度 离子对反相高效液相色谱法测定人血浆中吉西他滨的药物浓度 王临润,黄明珠,申屠建中,蔡捷(浙江大学医学院附属第一医院,浙江杭州310003) 摘要:目的建立使用离子对反相高效液相色谱测定吉西他滨血药浓度的方法.方法 血浆用三氯乙酸沉淀后取上清液直 接进样.色谱柱为SymmetryC18(4.6I/lln×250nlm,5tan),流动相为0,52%的磷酸二 氢钠溶液(pH2,66)一乙腈(85:15,含0.202% 庚烷磺酸钠).柱温25?,流速1.OmL?min,,检测渡长273nfn.结果吉西他滨血药浓 度在0.1,100tLg?mL内的线性关系 良好(r:0.9999),血浆中低,中,高3种浓度的方法回收率在97.39%,103.1l%之间,日 内RSD<~1.94%,日间RSD~<7.34%. 结论本法快速,灵敏,高效,适于吉西他滨的血药浓度监测. 关键词:吉西他滨:反相高效液相色谱法;离子对;血浆 中图分类号:11917文献标识码:A文章编号:1001—2494(2005)04—0295—03 Determinationofgemcitabineinhumanplasmabyion-pairRP-HPLC WANGLin-run,HUANGMing-zhu,SHENTUJian— zhong,CAIJie(TheFirstA~iateaHospital,CollegeofMedicine, Urd~rsity,Ho~hou310003,Ch/na) A?RACr:o]BJE【I,Toestablishaion— pairRP_HPLCmethodforthedeterminationofgemeitabineinhumanplasma.METHODS Sampleswerepreparedbyproteinprecipitation.111ecolumnWasWatersSymmetryCI8(4,6 n1m×250I/Lrn,5ben)andthetemperaturewasset at25oC, Themobilephase,Was0.52%phosphatebuffer(pH2.66)一 aeetonitrile(85:15)containing0.202%sodium1-heptanesulfonateand theflowrateWas1.0mL?min,.ThedetectionwavelengthWasat273nrn,RESULTSTheran geofcallbrationcurvewas0.1,100/xg? mL(r=0,9999).TherecoveryoflOW,mediumandhighconcentrationwerewithin97,39%, 103.1l%,TheRSDofintra-rtlnandinter- lulldidnotexceed1.94%and7,34%respectively.C0NCUJS10NThemethodiSrapid.sensiti veandeffieient. KEYW0RDS:gemeitabine:RP_HPII:;ion—pair;plasma 吉西他滨(gemcitabine,商品名:健择)是FDA近 年来批准上市的细胞周期特异性抗肿瘤新药,临床 上主要用于治疗非小细胞肺癌.目前吉西他滨的药 动学研究及临床血药浓度监测一般采用固相萃取小 柱提取的RP-HPLC法…1,国外新近报道采用离子对 RP-I-IPLC法【,本实验建立了以三氯乙酸沉淀后取 上清液直接进样的离子对RP-HPLC测定人血浆中 药物浓度的方法,较文献_1j报道方法,更快捷,灵 敏度更高,适用于药动学研究和血药浓度监测. 1仪器和试药 Waters2690溶剂管理系统,996二极管阵列检 测器,Millennium32色谱工作站;盐酸吉西他滨对照 品(EliLillyandCompany,批号151GS4,含量 99,5%);乙腈一色谱纯,美国天地公司);磷酸二氢 钠,庚烷磺酸钠,磷酸均为纯;Mill(密理博 过滤器). 2色谱条件 Waters公司SymmetryC】8色谱柱(4.6lnln×250 mln,5pan),预柱为SymmetryC18柱;流动相:0.52%磷 酸二氢钠溶液(pH2,66).乙腈(85:15,含0.202%庚 烷磺酸钠);流速1,0mL?min,;检测波长为273um; . 柱温25cI二 3实验方法 3.1对照品溶液的配制 精密称取盐酸吉西他滨对照品,加纯化水配制 992,8p-g?-TlLI1对照品贮备液,4?贮存,以此储备液 为母液用纯化水稀释成系列浓度的对照品溶液. 3.2血浆样品处理 取待测血样3mL于含抗凝剂EI3EA.2Na的试管 中,4?条件下41300r?minI1冷冻离心20min,取血浆 置一20?冰箱保存,分析前一20?冷冻保存的血浆在 暗处自然熔融,取血浆1mL,混匀加入30%三氯乙酸 溶液100止,旋涡混合2min,10800r?minI1离心15 Inin,取上清液于Mill中过滤,取滤液10进样. 基金项目:浙江省医药卫生科学研究基金资助(2004A028) 作者简介:王临润,男,副主任药师Tel/Fax:(0571)87236531E-mail:linmnw@yahoo.coin.en 国药学杂志2005年2月第40卷第4ChinPharmJ,2005February.Vo1.40No.4'295' 4结果 4.1系统适用性 在"2.1"色谱条件下,盐酸吉西他滨的保留时间 为6.10min,血浆内源性杂质对其测定无干扰,见色 谱图1. t/mm 图1高效液相色谱图 A一对照品;B一空白血浆;c一病人血样;1一吉西他滨 1HPLCchromatogramsofaeeclofenae A—l~fenmeesubBt日l_ce:B—blankplasma;C—plasmasamplewithaceclofenac;1一 gemcitabine 4.2线性范围 采用对照品贮备液逐步稀释配制成吉西他滨系 列浓度,分别精密量取相应浓度吉西他滨溶液100 ,加空白血浆到1mL,使血浆对照品浓度分别为 0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,25.0,50.0,100.0/lg? mL,,按"3.2"项下操作.以吉西他滨血药浓度对 峰面积进行线性回归,得回归方程:Y=20037X一 21.873,r=0.9999可见,盐酸吉西他滨在0.1,100 /lg?mL内线性关系良好,其最低检测限可达0.05 /lg?mL,. 4.3回收率 经按"3.2"项下处理血浆溶液得到的峰面积与 对照品溶液直接进样所得峰面积进行比较,结果低, 中,高3种浓度(0.5,10.0,100.0/lg?mLI1)回收率分 另0为(80.99?4.08)%,(83.96?0.72)%,(84.27? 0.97)%(=5). 4.4相对回收率与精密度 分别精密量取不同浓度的对照品溶液100乩, 加入空白血浆中至2mL,浓度分别为0.5,10.0, 100.0txg?mL,,按"3.2"项下操作,日内测5次,隔 日测定5次.结果低,中,高3种浓度(0.5,10.0, 100.0/lg?mLI1)的相对回收率分别为(97.39? 4.o8)%,(103.11?8.80)%,(100.65?1.16)%;日 内RSD分别为1.12%,1.64%,1.94%;日间RSD分 别为7.39%,1.72%,4.17%. 5稳定性考察 分别精密量取不同浓度的对照品溶液100L, 加空白血浆至1mL,使其浓度分别为0.5,10.0, 100.0/lg?mL,,配成5组,分别贮存于一20~C冰箱 内,于0,1,3,7,14d,按"3.2"项下操作进行测定,结 果低,中,高3种浓度(0.5,10.0,100.0/lg?mLI1)测 ' 296'Ch/nPhatmJ,2O05February,Vo1.4DNo.4 定的峰面积,RSD分别为5.97%,6.98%,8.54%, RSD均小于10%,说明血浆样品在一20cI=条件下放 置2周是稳定的. 6临床应用 采用本法测定6例非小细胞肺癌患者,年龄 (57.2?13.9)岁,体重60.5,6.2kg,在试验前均告之 研究并签署知情同意书.使用吉西他滨1200 mg?m,,静脉输注时间2h或30min结束后,即刻从 对侧静脉取血于抗凝管中,经冷冻高速离心后,取上 清液按"3.2"项下操作,结果见表1.吉西他滨作用靶 点为DNA复制和修复期,2h定速率输注可能优于大 剂量药物30min输注,目前使用2h输注法进行l临床 研究较多.由于例数太少,尚不能进行剂量和浓度以 及浓度和临床疗效与毒性反应的相关f生分析. 表1吉西他滨血药浓度的测定结果 Tab1Determinationofgemeitabineinhumanplasma 7讨论 7.1在非人类灵长动物的吉西他滨药动学研究中, 血浆中吉西他滨消除很快,其平均半衰期为(8?4) rainE3j ,故在本实验研究中,收集的样品应即刻在 4~C条件下,4000r?minI1高速冷冻离心20min,保证 吉西他滨的有效浓度. 7.2本实验采用沉淀剂为高浓度30%三氯乙酸 100/.tL的沉淀法,能使血浆溶液沉淀完全,低,中,高 3种浓度的绝对回收率分别为(踟.99?4.08)%, (83.96?0.72)%,(84.27?0.97)%(17,=5),该法样 品预处理快速,简便,并且成本较低,而采用固相萃 取法操作步骤繁琐,成本较高. 7.3在流动相的配比中,0.52%磷酸二氢钠溶液 (pH2.66).乙腈(85:15,含0.202%庚烷磺酸钠)中, 乙腈浓度细微变化,都能明显影响吉西他滨出峰时 间,但对色谱峰峰形基本无影响.本实验建立的离 子对反相高效液相色谱法,使吉西他滨能与血浆中 的杂质实现很好的分离,且最低检测浓度为0.05/lg ?mL,,完全能满足临床样本的血药浓度检测要求. 参考文献 [1]傅德良,倪泉兴,虞先浚,等.胰腺区域动脉灌注治疗胰腺癌 的实验研究[J].中华医学杂志,2OO2,82(6):371. (下转第307页) 币营药学杂志2005年2月第4o卷第4期 表1样品中铅,镉,汞,砷含量 Teb1ContentofPb,As,HgandCdinthesamples 广-"口 重金属含量/I'l【g,,mlg'L一 土厂仟口 /m 铅镉汞砷.土'铅镉汞砷 重金属含量?l【g,,I?L-】 厦门中药厂建阳三爱药业 肾舒冲剂030301<0.10<0.10<0.0l<0.01抗感片021101<0.10<0.100.01<0.10 03030<0.10<0.10<0.0l<0.01香丹注射液 0201152<0.10<0.10<0-0l<0.10 03o103<0.10<0.10<0.01<0.010l10<0.10<0.10<0.01<0.10 新癀片O3031)90.8<0.100.柏<0.10小儿止咳糖浆021102<0.10<0.10<0.0l<0.10 03?l01.5<0.100.36<0.1003O4O3<0.10<0.10<0.0l<0.10 03?l11.4<0.100.38<010复方满山白糖浆 030404<0.10<0.10<0-0l<0.10 穿心连0303121.2<0.100.035<0.10爱宏注射液 021129<0.10<0.10<0.0l<0.10 03?l41.3<0.100.033<0.10鱼腥草注射液 0204281<0.10<0.10<0.0l<0.10 0303161.2<0.100.037<0.100l08<0.10<0.10<0.0l<0.10 海珠喘息定0301282.4<0.10<0.01<0.10元胡止痛片 03020l<0.10<0.10<0.01<0.10 03020l2.7<0.10<0.01<0.10漳州片仔癀药业 0211382.5<0.10<0_0l<0.10 福州金象制药厂藿香正气水0l<0.10<0.100.4<0.10 维生素B2OO3O4O20.5<0.100.075<0.10021~030<0.10<0.100.6<0.10 麻仁丸2OO3O4O70.5<0.100.075<0.510207025<0.10<0.100.5<0.10 龙胆泻肝丸200206060.80.1016.620.37片子癀软膏?06町 <0.10<0.102.0<0.10 鼻渊胶囊 2OO3O3O3<0.10<0.100.0540.24O2O9O9<0.10<0.102.0<0.10 白带丸200209141.5<0.100.615.01010930<0.10<0.101.7<0.10 复方丹参片20030301<0.10<0.100.240.10川贝止咳糖浆 02091l8<0.10<0.100.60.10 补中益气丸2OO303O20.7<0.1010.60.330209l23<0.10<0.100.7<0.10 归脾丸2OO303O20.6<0.109.830.2902O8O95<0.10<0.100.8<0.10 柏子养心丸200207041.1<0.1012.040.92片子癀含片 0209012<0.10<0.100.5<0.10 香砂六君丸2003O2020.5<0.102.890.37l0027<0.10<0.100.5<0.10 丹栀逍遥丸200303071.2<0.1014.80.21茵胆平肝 0107169<0.10<0.101.7<0.10 0207056<0.10<0.101.6<0.10 0lO7l70<0.100.101.3<0.10 量在我省的几个地区含量不高,符合标准,个别样品 含砷量超标,汞的项目超标率较高.欧盟食品卫生 标准明确规定:铅?1.0mg?l(g,,镉?1.0mg?kg,, 汞?1.0mg?kg,,砷?2.0mg?kg,,若参考欧盟食 品卫生标准对本次抽样进行分析,则项目超标率为: 铅23.40%;镉0;汞25.53%;砷2.13%.是原料,辅 料或是炮制加工问,尚有待于进一步研究.重金 属对人体的新陈代谢及正常的生理作用具有明显的 伤害作用,并抑制人正常生理作用的发挥,中药中重 金属元素含量过高,容易在人体内积蓄,导致各种疾 病的发生.因此,必须对中药中的重金属元素进行 检测和控制. 中药材作为中药制剂的来源,对中药材种植地 进行环境评价,避免在土壤,空气,水等环境差的地 方种植生产药材,合理的使用农药,化肥,避免中药 材在采收,运输,加工中被污染.控制重金属含量, 提高中药制剂的质量3. 在本次调查中,发现47个样品里有25个样品 的重金属含量超过药用植物及制剂进出口绿色行业 标准,总体超标率为53.19%,参考欧盟食品卫生标 准,20个样品超标,其总体超标率为42.55%.我省 中成药总体超标率较高,这应该引起我省各制药企 业及相关部门的重视,有关部门应对我省的中药重 金属含量的超标原因做进一步的研究,以确保我省的中药种植,科研,生产,外贸事业长久健康发展. 参考文献 [1]王学锋,朱桂芬.重金属污染研究新进展[J].环境科学与技 术,2003,26(1):54. [2]中华人民共和国对外贸易经济合作部.药用植物及制剂进出 口绿色行业标准IS].2001:121. [3]张俊清,刘明生,符乃光,等.中药材微量元素及重金属研究 的意义与方法[J].中国野生植物资源,2(102,21(3):48. (收稿日期:2oo4-o6-30) (上接第296页) [2]WangLZ,C,daBC,leeItS,do/.Anexpedientassayfordetermi一 0Ilofgemeitabineanditsmetaboliteinhumanplasmausingiso— el'~ieion—pairreversed—phasehig}l—performanceliquidchro~ohy [J].胍,2003,25:552. 中国药学杂志2005年2月第4o卷第4 [3]JodyZ,KerrSL,BergliD,do/.Plasmaandeerebmspinalfluid phanm~kinefiesofgemeitabineafterintravenousadrainistralJonin nonhumanprimates[J].CancerChemodzer??,2001,47: 411. (收稿日期:20O4-O5—30) aPharmJ.2005February".Vo1.4DNo.4.307.