人胃低分化粘液腺癌和克隆株体外增殖粘附能力的研究

人胃低分化粘液腺癌和克隆株体外增殖粘附能力的研究 人胃低分化粘液腺癌和克隆株体外增殖粘 附能力的研究 移c哪%刀挑运红.等人胃低分化粘液腺癌和克隆株体外增殖粘附能刀的研究 ? 基础研究? ,7??人胃低分化粘液腺癌和克隆株 体外增殖粘附能力的研究z 姚运红孙宁唐慰萍李飞虹蔡琼珍 _— _',—_'一 ^ ,=,摘要本实验用溴化二甲噻唑二苯四氨唑(MTT)染色,酶标倥测定人胃低分化粘液腺癌MGe80—3置其克隆株 体外增殖力,用改良的双层琼脂法测定其克隆形成率用体外超声粉碎机粉碎脐带静脉内皮细胞及内皮下基质后包被 96孔板作为人造的血管壁,然后用酶标仪定量分析MGcS0—3及其克隆株的粘附力.用扫描电镜观寮肿瘤细胞粘附血 管壁的形态学垃程.结果显示MOo80—3厦其克隆株之间体外的增殖力不同.其中Cll体外增殖力最强.c3最弱;CI1 千细胞数最多.c5干细胞数最少MGe80—3及其克隆株c2,C3,cII的牯附力有明显不同.其中30rnin时c2的牯附 力最高.C5最低;60rain,90mln,120rain时CII牯附力最高,c5最低扫描电镜观察MGc80—3对血管内皮粘附的形 志学改变,显示30min时大部分癌细胞开始粘酣于内皮细胞的面,伸出丝状伪足附着在管腔内表面.癌细胞多数是几 个一起牯附;随时间延长粘附癌细胞的数量增多.癌细胞附着处内皮细胞收缩,其问的基质被粘附的癌细胞溶解形成沟 壑.结果提示;同一母系及不丽克隆株之间增殖力,粘附力存在异质性,增殖力,粘附 力之间密坷相关.另外.本实验用定 量方法筛选出粘附能力较强克隆株C2,Cli并描述其粘附特点.为进一步研究肿瘤 转移机理打下了基础. 关键调低分化牯液腺癌克隆增殖力粘附力 转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征.据统计,临 床上75%以上的恶性肿瘤病人死于转移.而肿瘤细胞 增殖粘附能力的强弱和其转移能力密切相关.研究发 现高转移能力的癌细胞常常有较高的粘附能力.并且 认为粘附是肿瘤转移过程中的重要步骤.为了深入 研究肿瘤细胞的粘附特征.筛选出不同粘附能力的细 胞株.为深入研究肿瘤转移机制提供实验资料,我们对 MGc80—3及其克隆株C2,C3,C5,C11体外粘附能 力进行了定量研究. l与方法 细胞系(株)的选择:人体胃低分化粘液腺癌细胞 系MGc80—3克隆株是由本室建立,保存. 细胞培养:所有细胞均用含15%小牛血清的1640 培养液,37?培养,隔天传代.使用时常规消化制成细 胞浓度为/ml的细胞悬液. 11体外增殖能力的检测 MTT(溴化二甲噻唑二苯四氮唑)试验:将刚长满 瓶的细胞消化吹打成单细胞悬液后稀释成3×10'个/ m1,对应接种于两块96孔的培养板中(200/孔).于 37?5%CO:培养箱中培养,4小时后于其中一板各 孔加入MTT(sigma产品)101(5mgMTT溶于1 mlPBS溶液中),再过4小时后各孔加入1O%SDS 100l,过夜,使MTT还原产物甲趱完全溶解后,用 511酶标仪(上海第三分析仪器厂)分别测量每孔在 作者单位:广_糸医学院病理教研室(湛江?524023) 570nm和630nm波长的OD值,以此测定增殖的活 细胞数.48小时后另一板作同样处理.每次各细胞 系(株)接种8个孔,重复做三次为去除接种细胞数不 等所带来的误差,以对应的OD比值反映增殖能力的 大小. OD比值器 克隆形成成率的测定:采用改良的双层琼脂法 按每皿每毫升约含量200个细胞接种于35mm的培 养皿中,不同克隆的细胞各接种3皿.镜下证实呈单细 胞分布后置5%CO培养箱中培养,于第1O天在倒 置显微镜(10×40)下计每皿的克隆数(克隆标准:直径 大于5O,70,um的细胞圃为一个克隆)及未形成克隆 的细胞数.计算出3个平皿的克隆形成率(克隆数/接 种的细胞数). 1.2粘附力的观察 粘附力的定量测定:瓤生儿脐带静脉壁钝性分离 后,将血管壁的内皮细胞及内皮下基质用超声波粉碎 机粉碎,包被96孔板,包被24小时.每孔加入1×1 细胞.5%CO孵箱内孵育30min,60rain,90min, 120rain后.龙胆紫染色.醋酸酒精提取.用DG3022 酶联免疫检测仪测量OD值,OD值反映粘附力的强 弱.OD值越高反映粘附的细胞数越多,粘附力越强. 扫描电镜观察:无菌条件下将新生儿脐带用 Hank's}申洗干净,将静脉壁剪成直径约1cirt大小的 小块,放入培养皿里.将生长旺盛的细胞消化吹打或单 细胞悬液后稀释成1×1个/ml对应接种于培养皿 (癌症)1996年第l5卷第4期251 (1mI/皿),于37"C5%CO:培养箱中培养,分别于30 min,60rain,90min,120min取出,2.5%戊二醛固 定,扫描电镜观察. 2结果 2.1体外增殖能力的检测 MGc80—3及其克隆株体外增殖能力的检测结果 见表1. 表1MGc803殛其克隆辕体外增殖能力的比较 OD比值f检验:与母系比较,C3,C5,C2与MGe80—3比较P<0.0l.克隆问两两比较,C2,Cll与C3,C5比较P <0.0I 克隆形成率u检验:与母系比较,c2,Cll与MGc803 比较P<0001.克隆间两两比较C2,C1t与C3,C5比较P <0.001 结果表明:(1)OD比值:C11比值最高.表明其增 殖速度最快,C3最慢.z检验结果,Cll与C3,C5比较 有非常显着差异,C2与C3,C5比较差异非常显着(t 检验,P<0.001);(2)克隆形成率:克隆11最高,克隆 5最低,说明克隆11的干细胞数最多,与MGc80—3, C3,C5比较差异非常显着(u检验P<0.001). 2.2体外粘附力的观察 扫描电镜观察MGo80—3对血管内皮粘附的形 态学改变,显示癌细胞表面有微绒毛,细胞之间连接疏 松.30rain时大部分癌细胞粘附于内皮细胞的表面 (图1),伸出丝状伪足附着在管腔内表面,癌细胞多数 囝I癌细睹30n】i时的牯附 是几个一起粘附;60rain时粘附癌细胞的数量增多. 癌细胞附着处内皮细胞收缩,其间的基质被粘附的毙 细胞溶解形成沟壑.120min时,可见癌细胞潜入内庄 细胞下,表面仅可以看见癌细胞的一部分.MGc80一 及其克隆株体外不同时间对血管壁的粘附力(超声杉 碎机粉碎脐带静脉内皮及内皮下基质)见表2及线压 2 ??8012o 一 +c2臼c5Cl1 囝2MGc80—3及其克隆株体外不同时间粘附力比较线圈 表2MGc80—3殛其克隆辕对血管壁的粘附OD钏BID 经t检验:与母系比较,30mln,60min,C2,CtI与 MGc80—3比较P<0.00L.克隆问两两比较,30mn,90min c2,CIl与c3,C5比较P<0.01,60min,t20min,C2,Ctl与 C5比较P<0.叭. MGc80—3及其克隆抹对各人造血管壁都能糕 附,对各血管壁的粘附的细胞数随时间延长而增加,但 其粘附力有所不同,在30min时C2的粘附力最高, c5最低.60min,90mln和120rain时均是Cll晟 高,c5最低. 3讨论 MGc80,3及其克隆抹之间体外增殖能力不同 其中C11体外增殖力最强,C3最弱;C11干细胞数最 ???啦 252蚍运红.等人胃低分化粘涟豫癌和克隆株体外增殖粘附能力的研究 多,C5干细胞数最少.肿瘤转移过程极为复杂,不但在 原发部位经历了局部的生长,而且进入脉管运行到达 远处穿出脉管后在管外也需增殖才可形成转移瘤,最 终完成转移过程.肿瘤的增殖能力主要与肿瘤中的千 细胞相关,其本身具有的自我更新和增殖特性使肿瘤 能不断增殖形成新的群体.MGc80—3及其克隆株体 外牯附力不同,30min,60rain和90rain时C2,C11 明显强于MGc80—3,C3,C5.肿瘤转移包括肿瘤细胞 侵袭周围组织,进入脉管,运行,到达远处,粘附,穿出 并在管外增殖形成转移瘤.本实验观察了肿瘤细胞粘 附血管的形态,定量分析了其对血管壁的粘附能力.表 明MGc80—3及其克隆株体外粘附力随着时间的延 长呈进行性的增强.C2,C11在30min,60mitt,90 rain时的粘附力明显高于MGc80—3,C3,C5.这与其 他学者的研究结果相似.一般认为,癌细胞进入血液 循环系统,与血小板,血浆纤维蛋白及癌细胞自身粘连 后,发生转移的第一步是与血管内皮细胞粘附.进而与 内皮下基底膜粘连.体外MTT试验及克隆形成率均 显示较强增殖力的Cll,其粘附力也较强.表明肿瘤细 胞的增殖能力与肿瘤细胞的粘附能力密切相关.转移 过程中,肿瘤细胞除其自身粘连形成癌细胞团外,还可 能与癌细胞的增殖有关,此特点可能决定癌细胞阻留 在毛细血管,使癌细胞粘附并逸出血管壁形成转移瘤. 作者用扫描电镜观察了MGc80—3牯附血管的过程, 可见肿瘤细胞与血管内皮细胞牯附后刺激内皮细胞收 缩,暴露内皮下基底膜并与内皮下基质结合,癌细胞从 内皮细胞之间的间隙通过,肿瘤细胞溶解周围的基质 形成沟壑.目前认为介导肿瘤细胞与内皮细胞粘附的 物质是粘附分子,不但肿瘤细胞表面存在粘附分子,而 且在血管内皮细胞的表面也存在粘附分子.本实验 中肿瘤细胞是粘附在同一血管模型上,不同细胞系 (株)的粘附力不同,是否与人胃癌细胞系及各克隆株 之间粘附分子或其受体的质和量不同有关,尚待进一 步研究探讨.同一母系及不同克隆株之间增殖力,粘附 力存在异质性,增殖力,粘附力之闻密切相关.另外,本 实验用定量方法筛选出粘附能力较强克隆株C2,C11 并描述其粘附特点,为进一步研究肿瘤转移机理打下 了基础. 参考文献 1StrauliP,Wei.~1.Celllocomotionandtumorpenetrac- lion.EurJCancer.1977,13:2i 2黄瑾.安继红.薛晓梅,等MTT比色检测细胞增殖方法 的改良及实验影响因素的观察.白求恩医科大学. 1992,18(4):395 3邓嘉华.梁谋,赵明伦.改良双层琼脂法培养人癌千细胞 堪江医学院.1991.9(t):24 4齐蘼平.史文举,王吾如,等高低转穆性癌细胞的粘附性比 较.喑尔演医科大学.1988,22(3):t79 5ZhuD.PauliBU.Correlationbetweenthelungdistri— butionpatternsofLn—ECAM一1andmeianomaexperi— filchtalmetastases.IntJCancer.1993,53:628 (收稿:1995-08,2I修回#1995—10—27) ASTUDY0NTHEPROLIFERAT10NANDADHESIONPROPERTIES OFMUCOUSGASTRICCARCINOMACELLLINE(MGc80—3) ANDITSCLONESTRAINS YAOYunhongSUNNingTANGWeipingLIFeihongCAIQingzeng — DeparmentofPathology.GuangdongMedicalCollege,Zhaiang.Guangd."g.PRCHINA.52 4023 AbstractTheproliferationandadhesionpropertiesinvitroofparentaIMGc80— 3anditsclonestrain. C2,C3.C5andCllwereinvestigated.TheresultofMTTtestshowedthatthecellsofCllprolifer ationin vitrowasfasterthanthatofMGc80— 3C2,C3.C5;ThecloningefficiencyofCllWaShigherthanthatof MGc80— 3C2C3C5.Theadhesiveabilitytoembryoumbilicalcordveingroundedbyuhrasonwetetested anditisfoundthattheC2andC11clonestraincellsboundtOumbilicalveinendothelialcellsatsignificantlv higherratesthanMGc80— 3C3andC5.especiallyintheearlierstage.Theresultofscanningelectronmi. croscopyshowedthatthemetastatictumorcetlandendotheliaIcdIinteractionssuchasattachmenttoen— dothelialcellsandtheirsubsequentretractionandexposureofendothelia1basaIIaminaaswel1SStheinteraCo tionofmerastatictUlTzorcellswiththebasal1amineleadingtOinvasionandsolubilizationofthisextracelluIar matrix.Theseresultssuggestthatheterogeneityincellproliferationandadhesionproperties.Thecellprolif- erationinvitroofparentslIineanditsclonestrainswerecorrelatedwiththeadhesionproperties. KeyWOrdsMUCOUISgastriccarcinomaCloneAdhesionProliferation