食品安全检测新技术、仪器及新技术在微生物检测中应用

食品安全检测新技术及新技术在微生物检测上的运用（论文） 摘 要：研究、开发和应用食品安全检测新技术，是保证食品安全、提高食品速测效率、提高准确率，增加国际竞争力的重要途径。本文阐述了八大类最新食品检测技术、仪器、方法及新技术在微生物检测中的运用等。 关键词：食品安全、检测技术、检测仪器、微生物检测、应用 食品安全问题最令世人关注，是热点问题、敏感问题，有误区也有误导和误解。近几年来形势得到根本性的好转。 我国是食品生产和贸易大国，2006年我国规模以上食品工业总产值21586.95亿元，进出口食品贸易额达404.48亿美元（不包括农产品）。2006年全国食品抽查合格率为77.9%，2007年上半年合格率上升85.1%，31个省、市食品质量平均合格率89.2%，2007年下半年上升到95%以上，2008年上半年抽查合格率为95.8%，这与近几年来我国全面启动和建设食品安全保障体系、运用食品安全检测新技术分不开的。下面就食品安全检测新技术、最新检测仪器及新技术在微生物检测方面的运用分别论述。 一、食品安全检测技术及检测仪器 食品安全检测技术主要包括八大类仪器与方法：检测农药残留的仪器；检测兽药、渔药残留的仪器；检测有毒有害元素及其价态分析的仪器；致病菌检验和细菌鉴定的仪器；转基因农产品检测仪器；检测农产品品质和营养成份的仪器；样品前处理的仪器设备；实验室必备的中小型仪器设备。 （一）检测农药残留的仪器。包括以下几大类。1、有机氯农残检测的仪器。2、有机磷农残检测的仪器。3、氨基甲酸酯农残检测的仪器。4、除虫菊酯类农残检测的仪器。5、除草剂农残检测的仪器。6、农药多残留检测的仪器。 当今农药多残留检测得到发达国家高度重视，我国也公布实施8个农药残留检测的国标，所用的样品前处理技术方法各异，但所用的仪器均为GC-MS或LC-MS-MS。 （二）检测兽药、渔药残留的仪器。兽药大致可分15类，检测的方法和仪器有同有异。 （1）农残检测主要仪器是配有各种检测器的GC，辅以HPLC，并用GC-MS定性和验证。（2）农残残留检测仪器均为GC-MS或LC-MS-MS。（3）兽药残留检测仪器比农残检测挡次要求更高，一般用HPLC或GC-MS检测，进一步用HPLC-MS和HPLC-MS-MS定性和确证。（4）国际上高端产品为Agilent、Thermo、Waters、ABI、PerkinEImer、Dionex、Varian等统领。（5）我国近几年来在GC、HPLC、GC-MS方面取得了长足进步。如东西电子、精科、天美、伍丰、温岭、北分、依利特等，虽与上述国际名牌还有些差距，但我确信很适用于县及地（市）级食品安全的初步定性和定量检测，市场广阔，期望国产仪器大有作为。 （三）、检测有毒有害元素及其价态分析的仪器 最经典的用原子吸收光谱仪（AAS）。具有我国自主知识产权的原子荧光光谱仪（AFS）很有特色和强势，可检测砷、铅、汞、锡、硒、锗、锑等，灵敏度高、检出限低、可多元素同时检测，且价廉。ICP-MS高灵敏度，检出限可达ng/ml级、已引起重视，但价格昂贵， 元素价态不同，毒性差异很大，国外多用HPLC-AAS、GC-AAS、HPLC-ICP-MS以及CE-ICP-MS仪，但价格贵。我国已批量生产的LC-AFS联用仪，灵敏度和检出限均能满足农产品、食品安全检测，且价廉。食品安全检测中有毒有害元素检测，基本上可用国产仪器了，尤其元素价态分析和县、地（市）级食品安全质检站、企业检测室等。 （四）、致病菌检验和细菌鉴定的仪器 细菌鉴定、检验的方法有三大类：传统方法、传统法基础上数值化方法、化学及分子生物学的方法，派生出许多方法及仪器。我国以往多用传统的培养法，近几年已大量引进国外新方法和仪器，较广的是： 1、根据碳源的代谢利用率进行鉴定，如API、ATB、VITEK等； 2、利用抗原和抗体间专一性结合、免疫反应，检验致病菌，即用ELISA法，如VIDAS。 3、运用基因检测技术检测病原菌，如杜邦的BAX系统，RP系统可用于溯源的。 4、根据特征性的脂肪酸图谱进行细菌鉴定，如Agilent开发的系统； 5、基于表面等离子谐振（SPR）生物传感器开发的致病菌检验系统，如Biacore系统； 6、基于生物芯片为平台，使用致病菌检测试剂盒、检测致病菌的系统，如我国博奥生物已开发出、可检测12种食源性致病菌的生物芯片检测系统； （五）、转基因农产品检测仪器 检测农产品中有否外源基因，分为基因水平的检测和基因转录水平检测，使用仪器按检测程序分三部份； 1、用于DNA样品制备的仪器设备：试剂盒、振荡器、离心机等； 2、用于基因扩增的仪器设备：混合液、保真DNA聚合酶、PCR扩增仪等； 3、分离、分析、检定的仪器设备：电泳系统、酶标仪、定量PCR仪等； （六）检测农产品品质和营养成份的仪器。 1、定氮仪凯氏定氮仪或杜马斯定氮/蛋白质测定仪； 2、脂肪测定仪； 3、纤维素测定仪； 4、牛奶、果汁检测仪； 5、糖份（糖度）检测仪； 6、近红外农产品品质分析仪； 7、食品安全快速分析仪系列（测定亚硝酸盐、甲醛、吊白块、二氧化硫、过氧化值和农药残等等）； 8、氨基酸分析仪 （七）样品前处理的仪器设备 食品质量安全检测是在极复杂的基质中（样品中），检测μg、ng级残留物和污染物，传统的样品前处理技术已成为瓶颈，甚至无能为力，所以一系列新技术，有取代传统技术设备的趋势，这些新技术有 1、固体萃取仪； 2、固相微萃取仪（SPME）； 3、基质固相分散萃取仪（MSPDE）。该技术于2000年首次提出，优点是不必进行匀浆、沉淀、离心、PH值调节等传统方法； 4、超临界流体萃取仪（SFE）。优点是不使用有机溶剂、简便、高效、快速、选择性强 5、凝胶渗析萃取仪（GPC）。优点是纯化容量大、回收率也较高，便于和其他分析仪器联机； 6、其他如微波消解萃取仪，微孔液膜萃取，纳米富集材料等新技术，以及顶空、吹扫捕集，全自动加温加压快速溶剂萃取仪等等，都将会在食品、农产品安全检测中发挥作用 （八）实验室必备的中小型仪器设备 以往我国建设实验室时，仅注意大型仪器设备而忽视必备的中小型常用的配套仪器设备，造成只有一个发达的头脑，而没有灵巧的四肢，对此要充分关注。这些中小型仪器设备，应依不同检测任务和功能要求，针对性地配备。我国有许多企业生产，性能也大有提升，已能基本满足实际要求，应侧重提高国产品性能，甚至外观； 二、食品检测新技术在微生物检测中应用。   (一)电阻抗法  电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术，已经开始应用于食品微生物的检验。其原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中，将会使培养基中的大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢为具有电活性的小分子物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加培养基的导电性，使培养基的阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化情况，判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。该法目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测。如AOAC991.38食品中沙门氏菌电阻抗检测法。   (二)微量生化法  Bachman和Weaver在20世纪40年代后期首先开创了微量生化法的纪元。之后随着人们对细菌进行快速生化特性的需求增加，使高精密度(90%)和高重现性的商业试剂盒得以快速发展。至今，市售的微生物鉴定用试剂盒有多种，常见的有MICRO-ID、API等。API由20个含干燥培养基的微管组成，其中的培养基用于进行酶促反应或糖发酵试验。检验时将预处理的菌悬液加入微管中培养后观察颜色变化，并纪录，输入APILAB  Plus软件得出结果。API创建了独特的数值鉴定法，可鉴定15个系列、600多个细菌种。简单快速可靠。   (三)快速酶触反应及代谢产物的检测  快速酶触反应是根据细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，根据酶的特性，选用相应的底物和指示剂，反应的测定结果有助于细菌快速诊断。如美国3M Petfifilm TM微生物测试片可分别快速测定细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群等。  (四)分子生物学技术 1.核酸探针技术。核酸探针是指带有标记的特异DNA片断。根据碱基互补原则，核酸探针能特异性的与目的DNA杂交，最后用特定的方法测定标记物。探针标记方式分为放射性标记、非放射性标记。用的较多的非放射性标记，又分为生物素标记、地高辛标记、免疫标记、荧光素标记等。特点是直观、准确。例如AOAC990.13GENE-TRAK沙门氏菌检测、AOAC993.09GENE-TRAK李斯特氏菌检测均采用了核酸探针技术。 2.多聚酶联反应(PCB)技术。基因探针技术虽已广泛应用，但主要问题是灵敏度不够高，使基因探针技术应用受到限制。1983年，美国Cetus公司和加利福尼亚大学的Hulis和Erlich创建了一种能在体外进行DNA扩增的简易、快速、灵敏和高特异性的多聚酶联反应(PCR)，在一定程度上解决了基因探针所存在的问题。其原理为通过加热使双链DNA经裂解成两条单链，成为引物和DNA聚合酶的；然后减低温度，使寡聚核苷酸引物与DNA分子上的互补序列退火。通常退火温度越高，PCR扩增特异性越好。下一步把温度升高，使DNA合成得以进行，合成的DNA片断越大，所需时间越长。如此重复上述加热变性双链、引物退火和链延伸循环过程，每次循环靶DNA扩增一倍。经3-4 h后，就能使靶DNA扩增10。测定PCR产物的方法较多，如凝胶电泳法、比色测定法以及化学发光测定法等。目前，已有自动化PCR检测试剂盒对仪器，使用方便，如美国杜邦快立康公司的BAX病原菌检测系统，可检测沙门氏菌、大肠杆菌O157、单增李斯特菌等。虽需增菌且需专用设备。但PCR技术是一项全新的技术，快速、灵敏、准确，在细菌诊断方面具有广阔的前景。     (五)免疫学方法检测细菌抗原和抗体的技术  1.荧光抗体检测技术(IPA)。用以快速检测细菌的荧光抗体技术主要有直接法和间接法。直接荧光抗体检测法是在检样上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加已知细菌特异性抗血清，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的抗体后在荧光显微镜下观察结果。如沙门氏菌、炭疽杆菌检测、IFA方法简便、快速经济，但有时受到样本中非特异性荧光的干扰，影响结果的判定，并且需要昂贵的荧光显微镜。    2.免疫酶技术。免疫酶技术(EIA)是将抗原、抗体特异反应和酶的高效催化作用原理有机结合的一种新颖、实用的免疫学分析技术。它通过共价结合将酶与抗原或抗体结合，形成酶标抗原或抗体，或通过免疫方法使酶与抗酶抗体结合，形成酶抗体复合物。这些酶标抗体(抗原)或酶抗体复合物仍保持免疫学活性和酶活性，可以与相应的抗原(抗体)结合，形成酶标记的抗原-抗体复合物。在遇到相应的底物时，这些酶可催化底物反应，从而生成可溶或不溶的有色产物，或者发光。可用仪器定性或定量。常用酶技术分为固相免疫酶测定技术、免疫酶定位技术、免疫酶沉淀技术、固相免疫酶测定技术分为限量抗原底物酶法、酶联免疫吸附试验(ELISA)。酶联免疫吸附试验又分为间接法、竞争法、双抗体夹心法、酶-抗酶复合物法、生物素-亲和素系统。在病源菌和真菌毒素检测中，应用较多是竞争法、双抗体夹心法。例如，GB/T     5009.22-1996食品中黄曲霉毒素B1的测定方法第二法就采用了该技术。    3.免疫磁珠分离法(IMS)是非常有效的从食品成分中分离靶细菌的方法。应用抗体包被的免疫磁珠，用一个磁场装置即可收集铁珠，不仅缩短分析时间，而且克服了选择性培养基的抑制作用问题。  (六)仪器法     1.Bactometer系统主要由BPU电子分析器/培养箱组成。是利用电阻抗、电容抗或总阻抗等参数的自动微生物检测系统。该法目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌、肠道杆菌如大肠杆菌和沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测。可同时检测64个样品，样品不需预先稀释，结果报告可用数字及曲线图显示。如食品中沙门氏菌用Bactometer系统检测一般只需30 h。 2.Mini-VIDAS。微型全自动荧光酶标分析仪，应用酶联荧光技术(ELFA)，ELFA技术具有优异的敏感性和特异性，抗原的检测是应用一种夹GELFA技术，SPR包被针上拥有抗体包被，所测的荧光与抗体中抗原的含量成正比。内设自检系统，可检验李斯特氏菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌肠毒素、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌O157。使用该仪器操作简便，只加一次样品，按一次键整个检测过程都由仪器自动完成。多数试验50分钟内结束(不含增菌过程)，无交叉污染。SN/T   0973-2000进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌O157：H7检验就采用了该仪器。    3.Vietk-AMS。全自动微生物分析系统，能同时进行60-480个样品的分析，速度快，易操作，结果准确，细菌鉴定时间2-3小时，可鉴定C菌、G菌、厌氧菌、酵母菌、芽孢杆菌、非发酵菌等，药敏试验时间3-6小时。Vietk专家系统，保证鉴定、药敏试验结果可靠无误；电脑工作站具有较强的数据处理功能，但菌株需分离纯化。    总之，食品微生物检验技术的发展方向是：1.提高检验效率，即方便、快速和大批量；2、试验条件标准化；3.高精度和高灵敏度。 参考文献 1、王林、王晶、周景洋  食品安全检测技术手册  化学工业出版社 2、蒋士强  食品安全检测技术现状及快速检测技术的未来 3、食品安全检测与现代生物技术  化学工业出版社 4、唐英章  现代食品安全检测技术  科学出版社 5、张春晖  食品微生物检验  化学工业出版社 6、魏明奎  食品微生物检验技术  化学工业出版社 7、徐克前  分子生物学检验技术实验指导  人民生化出版社