【doc】 反相高效液相色谱法测定竹红菌中竹红菌甲素的含量

【doc】 反相高效液相色谱法测定竹红菌中竹红菌甲素的含量 反相高效液相色谱法测定竹红菌中竹红菌 甲素的含量 第24卷第6期 2005年11月 分析测试 FENX1CESHlXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis) VoI.24No.6 13O一132 反相高效液相色谱法测定竹红茵中竹红菌 甲素的含量 顾晓天,周家宏,冯玉英,魏少华,王雪松,张宝文 (1.南京师范大学分析测试中心,江苏南京210097;2.南京师范大学化学与环境科学学院, 江苏南京210097;3.中国科学院理化技术研究所,北京100101) 摘要:建立了高效液相色谱法测定竹红菌提取物中竹红菌甲素含量的.样晶用C18柱为分离柱,甲醇一 水(体积比83:17)为流动相,检测波长为300n/ll进行分析.竹红菌甲素在进样量0.252,2.52gg范围内峰面 积线性关系良好(r=0.9999),【?j收率为98%103%,方法的RSD为0.20%一0.36%(n=5).该分析方法简便 快速,适合作为常规分析方法. 关键词:高效液相色谱;二极管阵列检测器;竹红菌;竹红菌甲素 中图分类号:0657.72;R986文献标识码:A文章编 号:1004—4957(2005)06—0130—03 DeterminationofHypocrellinAinHypocrellaBambusaebyHPLC/DAD GUXiao—tian’,ZHOUJia—hong,FENGYu—ying,WEIShao—hua, WANGXue.song’.ZHANGBao.wen l1.AnalysisandTestingCenter,NanjingNormalUniversity,Nanjing210097,China;2.~%hoo1ofChemistry, NanjingNormalUniversity,Nanjing210097,China;3.TechnicalInstituteofPhysicsandChemistry, ChineseAcademyof~iences,Beijing1(30101,China) Abstract:ThequantitativedetemfinationofHypocmllinA(HA)inHypocrellaBambusaesampleswasconduct— edbyusinganHPLC/DADmethod.AZorbaxExtend—C18column(4.6ltlln I.D.×150mill,5m)and amobilephaseconsistingofmethanol—water(83:17byvolunle)wereemplo yed,TheHPLCconditions wereasfollows:flowrate:1mL/min:injectionaliquot:101~tL;columntemperature:30?.andUVdetec- tionwavelength:300nlt1.ThecontentofHAinthesamplesweredeterminedbytheexternalcalibration method.TheHPLC/DADmethodiSsimpleandquickthereforecanbeusedas aroutineanalytica1method f0rthedeterminationofHA.Thel~,asonrtheuniquechoiceofthiskindofcolu mnsandinfluenceofthemo- bilephasewerealsodiscussed. Keywords:Liquidchromatography;DAD;HypocrellaBambusae;Hypocre llinA 竹红菌生长在海拔三千到三千五百米的高寒区箭竹上,主要产地为我国云南省和四川省.近年来, 从竹红菌中提取的竹红菌素(Hypocrellin)成为我国首次发现并应用于临床的新型药物.临床中广泛用于 治疗肥厚性瘢痕,皮肤淀粉样苔藓,牛皮癣,白癜疯等皮肤病….由于它在光敏条件下能产生各种活性 氧,对癌细胞具有明显的抑制作用而具有良好的抗癌活性,越来越 被国内外研究者所重视. 竹红菌素中最主要的光敏成分为竹红菌甲素(HA),其结构如图1, 属于羟基芄醌类衍生物.有关它的药理作用等方面的研究目前已很深CH 入,但有关它的定量分析研究目前还少见报道,主要是用分光光度法cH 定量’,这种方法容易受杂质影响,不能用于复杂体系样品的测量, 使竹红菌甲素药物的定量准确性受到限制. 含量A霎F图ig…Molecu…larstructure, ofDAD含量进行测定的方法,并参比标准竹红菌甲素的光谱图,实现定’”一一 基金项目:江苏省教育厅自然科学基金资助项目 (IMKJB150068,04K.]DI50110);南京师范大学优秀高层次人才启动 基金(184070H2B43) 作者简介:顾晓天(1967一),女,江苏南京人,讲师,双硕士,Tel:025—83997177,E—mail:guxiaotian@ojnu.edu.cn 第6期顾晓天等:反相高效液相色谱法测定竹红菌中竹红菌甲素的含量131 量和定性的准确性.该方法快速简便,具有较高的实用价值. 1实验部分 1.1仪器与试剂 Agilent1100型高效液相色谱仪,配备二极管阵列检测器及色谱工作站.H66025T超声清洗机. 甲醇为色谱纯(Merck公司),其他试剂均为分析纯,水为超纯去离子水.竹红菌甲素对照品由中国 科学院理化技术研究所制备,纯度在96%以上. 1.2色谱条件 色谱柱:ZorhaxExtend.C18column(4.6mnlIDx150ITI1TI,5m),柱温:30?;流动相:甲醇一水(体 积比83:l7),流速:1.0mL/min;紫外检测波长:300nm;进样量:10L.在此条件下,竹红菌甲素的 保留时间在4.5rain左右,理论塔板数以竹红菌甲素峰计算为5500. 1.3标准溶液的ll~itiU 准确称取竹红菌甲素25.2nag置100rnL量瓶中,用甲醇定容,用超声振荡至完全溶解,再逐级用甲 醇稀释至所需浓度. 1.4样品前处理 准确称取已干燥粉碎的竹红菌样品约1g,加入甲醇250mL,称重,于避光条件下在70?水浴中回 流50rain.冷却后加甲醇补足减失质量,摇匀后过滤.续滤液过0.45m微孑L滤膜后进行分析. 2结果与讨论 2.1色谱柱的选择 大量实验表明,竹红菌甲素在一般的C18,C8以及离子交换色潜柱上,均呈现拖尾达数分钟甚至扁 平的色谱峰,改变流动相的洗脱强度,pH值以及缓冲盐浓度等均无法使之优化,其色谱峰峰形差,理论 塔板数很低,达不到可行的分离效果.这种现象可能是由竹红菌甲素分子中的羟基,羰基以及甲氧基 等基团与色谱柱中的硅羟基的作用所引起.因此,结合目前色谱柱技术对不同色谱柱硅羟基活性的研 究成果,实验中选用不同的已知硅羟基活性的色谱柱进行对比,结果发现,色谱柱硅羟基活性越高, 色谱峰越扁平,拖尾越严重.也就是说,竹红菌甲素的色谱分析必须选用硅羟基活性很小的色谱柱. 根据这一结果,我们选用这种运用双倍封端保证很低硅羟基活性的ZorhaxExtendC18柱,获得良好的峰 形,竹红菌甲素色谱峰的理论塔板数达到4000以上. 2.2流动相条件对保留的影响 2.2.1pH值的影响为了研究流动相pH值对保留时问的影响, 在甲醇与水的流动相体系中将水的pH值用乙酸和三乙胺分别调到: pH=3.5,4.2,5.0,7.5,8.2.与未加酸碱调节的流动相比较发现, 随着pH值逐渐降低,保留时问略有增加,且峰形展宽;而碱性流动 相使保留时略有减小但样品组分问分离度降低.总体讲,pH值 改变对样品分离的影响不大.从分子结构角度来看,竹红菌甲素分 子中含有羟基,羰基等基团,但羟基中的H已和旁边羰基的O原子 形成氢键,而这样的稳定结构使流动相的酸碱度对其影响不大. 2.2.2甲醇与水的比例随着甲醇比例的增大,竹红菌甲素保留 时间迅速减小.考虑到分析时问,分离度及峰形等综合因素,选择 甲醇一水的体积比为83:17. 2.3定性鉴定 在1.2色谱条件下得到竹红菌提取物的色谱图(如图2).竹红 菌甲素的鉴定方法:首先采用保留时间对照及标准加入法初步定 性;进而用DAD采集紫外光谱(紫外波长范围是200—400n/n),得 02468 IR/rain 048 IR/rain 图2竹红菌甲素标准品(A),竹红菌 提取液样品(B)的液相色谱幽 Fig.2HPLCchromatogramofHAstandard (A)andHypocrellaBambusaeextract(B) PeakI:HA 分析测试第24卷 到纯度因子为907,说明峰纯度较高,不受干扰;并将得到的紫外光谱与竹红菌甲素的标准紫外光谱图 对照而定性. 2.4线性方程及检出限 配制竹红菌甲素标准溶液,质量浓度分别为25.2,50.4,100.8,201.6,252.0mg/L,在1.2色谱条 件下得到竹红菌甲素的回归方程为:A=一35.95+13.32』0(mg/L),r=0.999,线性范围25.2—252mg/L, 检出限(S/N=3)为1.2嚷. 2.5竹红菌提取物样品的测定 取采自云南浦江县的竹红菌样品3批,按1.4法经过前处理后,对其中的竹红菌甲素含量进行分析, 得到其中的竹红菌甲素含量分别为30.6,24.5,28.7mg/g. 2.6回收率实验与精密度实验 称取已测出竹红菌甲素含量的样品约1g各3份,分别添加准确称量的竹红菌甲素约50mg,按上述 供试品溶液制备方法处理后,每个样品进样5次,测定峰面积,考察方法的回收率与精密度.得到回收 率分别为98%,98%,103%以及相对标准偏差(RsD)分别为0.35%,0.36%,0.20%. 2.7溶液稳定性 竹红菌甲素相对稳定,但对光敏感,实验过程中样品溶液要注意避光. 参考文献: [11WANXiangyi,CHENYuanteng[J】.ChinaScienceBulletin(万象义,陈远腾[J1科学通报),1980,25(24):1148— 1149 [2】MARXJL1[J】.Science,1987,235(4788):529—533. [3】Lt3Xiaogan,WANGJuying.….ChinaJournalofPhatanaceutiealAnalysis(吕效敢,王菊英.….药物分析杂志),1983, 3(1):42—43. 【4jLINHaiping,CHENHong,YEYong,eta1.IJjJournalofZhejiangForestry College(林海萍,陈虹,叶勇,等fJj.浙 江林学院),2002,19(2):157—160. [5】LIUGuoquan,YUZhaolou.TechniquesofChromatographicColumns[M】.Beijing:ChemicalIndustryPress(~11崮诠,余兆楼.色 谱柱技术[M1.北京:化学工业出版社),2001.193—218. 0,.,0,.,,i\!,!?,i,,.,&/g-~,i,,!,,.,一,,一0,0,i (上接第129页) 表1丹酚酸B加样回收实验结果(n:3) TablelRecoveryofthemethod(n=3) !/,!/.,,!/,!’,,,!/ 2.5样品测定 精密吸取上述供试品溶液10L,分别注入液相色谱仪,按外标法计算含量,结果BL厂家样品未检 出丹酚酸B,而YA厂,SW厂,sH厂,XG厂家样品中的丹酚酸B含量分别为1.388,1.213,2.421, 1.152mg/mL,1LSD(n=3)分别为1.31%,0.93%,1.37%,2.00%. 参考文献: 【1jPENGSixun,ZHAOShouxun,LIAOQingiiang,eta1.AdvancementofPh ammeeuticalChemistry【M】.Beijing:ChinaMedical TechnologyPress(彭司勋,赵守训,廖清江,等药物化学进展(第一 卷)fM】.北京:中国医药科技出版社),2000. 201—215.. 12JDrugSmnd~dofMinistryofPublicHealthofthePeople’sRepublicofChi naPhannaeyotChineseRaditiona]PatentMefticinelSJ (中华人民共和崮卫生部药品标准:中药成方制剂[S】),1998,V17:200. [3lZHANGQiwel,zHANGYing,LIJiping,eta1.ChinaJournalofChineseM ateriaMediea(张启伟,张颖,李汁萍,等.中国 中药杂志),2001,26(12):848—849.