血清胱抑素C测定的临床意义及方法学进展

血清胱抑素C测定的临床意义及方法学进展 胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并完全降解，而肾脏是清除循环中胱抑素C的惟一器官，血清胱抑素C浓度主要由肾小球滤过率决定。此外，血清胱抑素C检测不受年龄、性别、炎症、饮食、体重以及肝功能变化的影响。由 此可见，胱抑素C是一种理想的反映肾小球滤过率变化的内源性标志物。 肾小球受损时血中的Cys C升高比较显著，肾小球、肾小管均受损时，血、尿中的Cys C均升高比较显著，有利于临床医生判断肾小球、肾小管是否受损，以便及时采取相应的治疗措施。 血清胱抑素C测定的临床意义及方法学进展 摘要在肾小球滤过功能试验中，血清肌酐、尿素及内生肌酐清除率是最常用的指标。由于以上指标尚存诸多不足，故人们一直在寻找新的反映肾小球滤过率变化的指标。胱抑素 c是一种低分子量蛋白质，是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成员之一，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素 c仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标志物。血清胱抑素 c浓度在作为肾功能试验时优于血清肌酐浓度。至于胱抑素 c测定的方法学，已有快速、简便且可自动化的“颗粒加强免疫比浊法”的最新报道，使血清胱抑素 c测定的广泛临床应用成为可能。 关键词:胱抑素 c;肾功能试验; gFR;肌酐 胱抑素 c( cystatin c)是一种低分子量蛋白质， grubb等首先报道其血清浓度与 gFR [1]密切相关，可作为肾小球滤过功能指标。近年来有关胱抑素 c测定的临床应用及方法报道日渐增多，本文就胱抑素 c的结构与功能，作为反映肾小球滤过功能的内源性标志物及方法学进展作一综述。 1胱抑素 c的结构与功能 ，以前也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，是一种低分子量、碱性非糖化 胱抑素 c 蛋白质，分子量为13KDa,由120个氨基酸残基组成，是一种分泌性蛋白质。细胞先合成一个带信号肽的前体蛋白，编码胱抑素 c的基因位于人类第20号染色体，大约为4.3Kb，包含3个外显子，基因上游45-50核苷酸处为“ tATA盒样”序列( aTAAAA)。胱抑素 c基因5′-侧翼区 gC含量较高，转录起始位点上游400bp序列的 g+C,70%，富含 gC的“岛”也包括外显子1及内含子1、5′侧的一部分，整个富含 gC“岛”约900bp， g+C含量为73%。此区域 cpG/GpC比值接近于1，因此此区 cpG是非甲基化的。在胱抑素 c基因5′侧翼1Kb序列中发现了2个“ gC盒”( gGGCGG)，此区也发现了增强子核心样序列( gTGGAAGG)。 由以上可见，胱抑素 c基因5′侧翼序列与“看家基因”的启动子区具有相同的特性，即缺乏典型的“ cAAT盒”、富含 gC、有与转录因子 spl结合的“ gC盒”。故可将胱抑素 c基因看作是“看家基因”( house-keeping gene)，即此基因在所有组织恒定持续地转录及表达。 northernx印迹也发现胱抑素 c基因在所有的被观察的组织均表达，包括肾、肝、 [2]胰、肠、胃、肺及胎盘。 由于胱抑素 c是一种分泌性蛋白质，故广泛地存在于各种体液中，如脑脊液、血液、唾液、精浆等。至于胱抑素 c的确切生物学功能目前还了解不多，研究发现胱抑素 c是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成员之一，是目前发现的对组织蛋白酶 b抑制作用最强的抑制物，对木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、组织蛋白酶 h及 l也有抑制作用，故胱抑素 c的一个生理学功能可能是调节半胱氨酸蛋白酶的活性。胱抑素 c基因突变可导致遗传性胱抑素 c淀粉样血管病( hCCAA)，可发生脑动脉血管破裂，这是目前发现的直接与胱抑素 c相关的临床疾病。 2胱抑素 c作为反映肾小球滤过功能的内源性标志物 由于胱抑素 c基因属“看家基因”，能在几乎所有的有核细胞表达，无组织学特异性，故机体胱抑素 c产生率相当恒定。因胱抑素 c是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素 c的唯一器官，所以血清胱抑素 c浓度主要由 gFR决定，由此可见胱抑素 c是一种理想的反映 gFR变化的内源性标志物。 [1] grubb及 simonsen等首先研究了血中低分子量蛋白质(β-微球蛋白、视黄醇结合蛋2 51白、胱抑素 c)浓度与 gFR( cr-EDTA清除率)的相关性，发现血清胱抑素 c、β-微球2蛋白及视黄醇结合蛋白浓度的倒数与 gFR的相关系数γ分别为0.75、0.70及0.39，血清肌酐浓度倒数与 gFR的相关系数γ为0.73。可见胱抑素 c是低分子量蛋白质中与 gFR最相关的内源性标志物，甚至优于血清肌酐。血清β-微球蛋白浓度由于在炎症、肿瘤及免疫2 疾病时也可升高，故不是理想的 gFR内源性标志物，视黄醇结合蛋白的代谢十分复杂，且部分与前白蛋白结合，不能自由经肾小球滤过，故血清视黄醇结合蛋白浓度的倒数与 gFR相关性最差，不能作为 gFR的内源性标志物。胱抑素 c即使在炎症状态下，其产生率也不 99m会改变，血清浓度受年龄、性别、疾病的病情变化的影响较小。 pergande等用 tc-DTPA清除率作为肾小球滤过功能的“金标准”(,1.36ml/s为肾小球滤过功能受损，分析了胱抑素 c、β-微球蛋白及肌酐的血清浓度的诊断敏感性，结果发现它们诊断肾功能异常的敏2 [3，4][5]感性分别为88.2%、64.7%及52.9。随后 newman报道血清胱抑素 c、肌酐浓度诊断异 51常 gFR的敏感性分别为78.1%及57.1%，各自浓度倒数与 gFR( cr-EDTA清除率)的相关 [6][7]系数分别为:0.81、0.50。 kyhse andersen及 filley的最近临床应用也表明血清胱抑素 c浓度与 gFR的相关性优于血清肌酐浓度。 rOC( receiver operating Characteristic)作图分析发现，通过改变“分割限”( cutoff limit)使胱抑素 c的诊断敏感性下降至70%时，其诊断特异性仍可达75%;而通过改变血清肌酐浓度的“分割限”，使其诊断敏感性下 降至50%时，才能获得100%的特异性，使敏感性增加至100%时，其特异性接近于零。各自 rOC曲线下面积相差显著( p,0.001)，说明胱抑素 c的诊断准确性明显优于血清肌酐。 表1各种测定方法比较 方法 检测限测定时间 参考范围 x? sD(范围)， 分析样 cV μ g/L mg/L 品数 % rID 300 11 38h 1.3?0.26(0.72,1.7) 46 eIA 30 10 ~12 16h 1.1?0.42(0.63,2.5) 30 rIA 1.3 n.d. 16,21h 0.96?0.20(0.6,1.7) 100 fIA 1 n.d. lor3h n.d. eIA n.d. n.d. 4.5h 1.1?0.15 20 eIA 1.9 4,5 5h 0.75?0.65(?20岁) 85 1.34?0.95(,20岁) 189 eIA 0.195 4,8 1.5h 1.25?0.22(0.86,1.7) 50 eIA 0.9 3,9 2h 1.78?0.26(女) 33 2.14?0.31(男) 33 pETIAm 150 2.0,7min (0.61?1.21) 27 3.2 pETIA 27 3,5 5min ,1.25 pENIA 170 3,5 6min (0.64,1.04) 30 3血清胱抑素 c测定的方法学 由于血清中胱抑素 c浓度较低，故其测定方法需较高的分析灵敏度及特异性。 lofberg等首先用单向免疫扩散法( rID)及酶免疫测定法( eIA)对胱抑素 c含量进行测定，按照目前的标准，当时报道的这两种方法不仅费时，而且检测限也差(分别为300、30μ g/L)。随后，又有较简单且更灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定( rIA、 fIA及 eIA)的方法 [3]报道，以改善胱抑素 c测定的可靠性。1993年 pergande等报道了一种夹心酶免疫测定方法，其检测限虽然很低(0.9μ g/L)，但测定时间仍较长，无法常规应用，更无法用于急诊测定。以上各种测定方法均属非均相测定方法，很难自动化，因此限制了胱抑素 c的广泛临床应用。胶乳免疫测定是一种均相测定方法，在胶乳颗粒上包被抗体，与抗原结合时颗粒发生凝集，此方法很容易自动化。 kabanda等于1994年报道的测定胱抑素 c的胶乳颗粒 [8][6]凝集法是一种颗粒计数免疫测定法。 kyhse andersen等于同年报道了一种颗粒增强透射免疫比浊法( particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA)，使胱抑素 c测定的时间缩短至5min左右，且可在自动生化分析仪上进行，使胱抑素 c测定的常规应用 [9]成为可能。随后， newman等也报道了类似方法。1997年， finney等报道了一种能快速自动测定胱抑素 c的颗粒增强散射免疫比浊法( particle-enhanced nephelometric [10]immunoassay, PENIA)，其测定结果与 pETIA法相关性良好。各种胱抑素 c测定方法的比较见表1。 [11,14] 从表1可见，单纯就检测灵敏度而言， rID法最差，而 eIA、 rIA及 fIA法均优于 pETIA及 pENIA法。由于 rIA法存在放射性污染， fIA法需昂贵的仪器，以及 rIA、 fIA、 eIA法测定时间长，且不能全自动化，无法用于临床大批量标本的测定。 pETIA及 pENIA法虽然检测灵敏度差些，但仍可达150μ g/L左右，远远低于健康人血清胱抑素 c浓度的下限值，可满足临床需要;这两种测定方法基本上不受血红蛋白、胆红素、类风湿因子、甘油三酯的影响，回收率可达95%,109%，批内及批间变异系数均较小(,4.5%);加上这两种方法可全自动化，故在血清胱抑素 c测定的常规临床应用中可首选 pETIA或 pENIA法。 各位研究者所报道的血清胱抑素 c浓度的参考范围有一定的差异，这一方面是由测定方法不同所致，另一方面与所用胱抑素 c标准品的来源不同有关，现应用的胱抑素 c标准品有3种类型:?从人尿中纯化的胱抑素 c;?纯化的人类胱抑素 c，并用重组胱抑素 c定值;?重组胱抑素 c，并溶于马血清。 pergande等用一种尿蛋白标准品，发现血清胱抑素 c浓度存在性别差异，其它研究者利用其它标准品时未发现性别差异。因此，应制定有关标准品制备的统一标准，以便进行方法比较及参考范围的建立。 4小结 在肾脏疾病治疗中已涌现出许多新方法，如抗炎药物、肾移植及透析等。在应用这些方法的过程中，肾移植后排斥反应的监测及肾毒性药物肾毒性监测等。均需一种快速、简单且 [15]能准确地反映 gFR变化的指标。无论从理论上还是实践中，血清胱抑素 c的测定均优于血清肌酐的测定，加上能自动化的检测的 pETIA及 pENIA方法的建立，已使胱抑素 c的广泛临床应用成为可能。在今后的实践中，应注意测定方法的标准化问题;观察血清胱抑素 c浓度在不同肾脏疾病状态下的变化规律;应在更大的人群内测定血清胱抑素 c浓度，以分析是否存在年龄及性别相关的差异;从而最终确定胱抑素 c的敏感性及特异性。