丛枝菌根真菌对番茄信号物质的诱导效应

丛枝菌根真菌对番茄信号物质的诱导效应 王彬1  李辉2  徐丽娟3  李敏1  刘润进1* 1青岛农业大学菌根生物技术研究所 青岛 266109 2青岛农业大学理学与信息科学学院 青岛 266109 3青岛农业大学生命科学学院 青岛 266109 摘  要：盆栽番茄Lycopersicon esculentum幼苗分别接种丛枝菌根（AM）真菌摩西球囊霉Glomus mosseae、地球囊霉G. versiforme、根内球囊霉G. intraradices、幼套球囊霉G. etunicatum及珠状巨孢囊霉Gigaspora margarita 35d后，开始测定番茄植株内源信号物质水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、一氧化氮（NO）和过氧化氢（H2O2）含量变化，抗性相关酶活性，丙二醛（MDA）含量以及生长量等指标。结果表明，接种AM真菌增加了番茄植株鲜重、株高、地上部和地下部干重、叶片和根系NO、JA、H2O2含量和结合态SA含量，其中，以摩西球囊霉G. mosseae诱导作用最大，叶片和根系内NO、JA、H2O2和结合态SA 含量分别比对照增加了3.3和1.9倍、6.8和8.0倍、0.9和1.2倍、1.9和2.6倍，而根系中游离态SA含量一直处于较低水平，只有摩西球囊霉G. mosseae处理在诱导高峰时根系游离态SA含量比对照略有增加。接种AM真菌处理的番茄叶片和根系超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性显著增加，其中以摩西球囊霉G. mosseae的诱导效应最大，与未接种对照相比分别增加了0.6和0.3倍、7.9和3.1倍、0.4和1.2倍、2.3和1.9倍；幼套球囊霉G. etunicatum的诱导效应最小：与未接种对照相比分别增加了0.26和0.14倍、2.3和1.0倍、0.1和0.28倍、0.55和0.31倍；而MDA含量下降，分别降低了66%和68%、34%和41%、51%和50%、12%和26%、18%和29%。表明AM真菌能诱导植物同时产生多种信号物质，而且这些信号参与了AM真菌-番茄共生体系统抗性的表达。 关键词：球囊霉，生长量，内源信号物质，抗性相关酶，丙二醛 Induction of tomato signal substances by arbuscular mycorrhizal fungi WANG Bin1 LI Hui2 XU Li-Juan3 LI Min1 LIU Run-Jin1* 1Institute of Mycorrhizal Biotechnology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China 2College of Sciences and Information, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China 3College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China Abstract: In order to evaluate the induction of plant signal substances by arbuscular mycorrhizal (AM) fungi, a pot experiment by using Lycopersicon esculentum seedlings inoculated with Glomus mosseae, G. versiforme, G. etunicatum, G. intraradices and Gigaspora margarita was carried out. The content of endogenous salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA), nitrogen monoxide (NO) and hydrogen peroxide (H2O2), the related resistant enzyme activity, and malondialdehyde (MDA) contents in tomato seedlings were determined in 35 days after inoculation. The results showed that AM fungal inoculation increased significantly the seedling growth (plant fresh weight, plant height, shoot and root dry weight), SA, JA, NO, H2O2 and SA glucosidate content in roots and leaves. The maximum induction effects occurred in G. mosseae and the content of NO, JA, H2O2 and SA glucosidate in leaves and roots had increased by 4.3 and 2.9 times, 7.8 and 9 times, 1.9 and 2.2 times, and 2.9 and 3.6 times respectively over the control. The free SA content in mycorrhizal plants was lower than that in control, but the content in plant treated with G. mosseae was a little higher than that in the control at induction peak. Superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and peroxide catalase (CAT) activities in mycorrhizal plants were greater than those in control. G. mosseae gave the maximum induction effectiveness, and the activity of SOD, POD, CAT, and PAL in roots and leaves had increased by 1.6 and 1.3 times, 8.9 and 4.1 times, 1.4 and 2.2 times, 3.3 and 2.9 times as compared with the control; the G. etunicatum gave the minimum induction effectiveness, and the activity of SOD, POD, CAT and PAL in roots and leaves had increased to 0.26 and 0.14 times, 2.3 and 1.0 times, 0.1 and 0.28 times, 0.55 and 0.31 times as compared with the control; MDA content reduced by 66% and 68%, 34% and 41%, 51% and 50%, 12% and 26%, 18% and 29% as compared with the control. It was concluded that AM fungi could simultaneously induce many plant signal substances, and these signal substances were involved in the resistant expression in AM fungi-tomato symbiont. Key words: Glomus, growth, endogenous signal substance, related resistant enzyme, malondialdehyde 丛枝菌根（AM）真菌能促进番茄Lycopersicon esculentum植株生长，提高抗病性（Garcia-Garrido & Ocampo 1988）。进一步的研究证实，AM真菌所诱导的抗病性与植物体内信号物质如水杨酸（SA）或茉莉酸（JA）水平有关。在一定条件下，AM真菌可诱导植物合成SA、JA、多酚类化合物类黄酮/异类黄酮、Ca2+信号、一氧化氮（NO）或过氧化氢（H2O2）等信号物质（刘润进和陈应龙 2007；王彬等 2009）。例如，Kapoor（2008）发现与接种番茄枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici对照相比，接种大果球囊霉Glomus macrocarpum或聚球囊霉G. fasciculatum番茄茎叶中JA含量是前者的9倍，而苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、酚类物质含量也相应升高，抑制了镰刀菌的侵染，认为JA参与了AM真菌诱导的系统防御反应。利用3种相对独立的染色技术，发现蒺藜苜蓿Medicago truncatula接种根内球囊霉G. intraradices后根皮层细胞中H2O2含量升高，尤其是当菌丝开始穿透皮层细胞以及丛枝形成期H2O2能够迅速积累（Fester & Hause 2005），而且接种AM真菌的番茄植株中JA诱导抗病性作用更强（El-Khallal 2007）。然而，这些研究往往仅测定了一种信号物质，未同时检测其他信号物质被诱导的状况。因此，在研究AM真菌诱导植物信号物质过程中，很有必要同时测定多种信号物质含量，以尽可能真实反映AM真菌诱导植物内源信号物质所产生的生理生化作用。本试验将番茄幼苗接种AM真菌后同时测定了根系和叶内SA、JA、NO和H2O2等含量的变化，旨在比较全面和系统的评价AM真菌诱导植物内源信号物质的效应，为进一步揭示AM真菌提高植物抗逆性的生理机制提供依据。 1 材料与 1.1 材料 1.1.1 供试植物：番茄Lycopersicon esculentum品种为菜都982，山东寿光金田种苗有限公司生产。 1.1.2 供试AM真菌：供试AM菌种分别为摩西球囊霉Glomus mosseae、地表球囊霉G. versiforme、根内球囊霉G. intraradices、幼套球囊霉G. etunicatum和珠状巨孢囊霉Gigaspora margarita预先经三叶草盆栽繁殖，用其孢子、根外菌丝、菌根根段的混合菌剂接种。 1.1.3 供试土壤：砂壤土pH 6.83，有机质0.79%，碱解氮36.15mg/kg，全磷0.35g/kg，速效磷20.54mg/kg，速效钾59.21mg/kg，高压蒸汽灭菌（121℃，1h）后1,000g灭菌土装入花盆（上口径13cm，高11cm）备用。 1.2 实验设计 实验在青岛农业大学菌根研究所温室进行，设5个接种处理：4片真叶番茄苗接种摩西球囊霉Glomus mosseae、地表球囊霉G. versiforme、根内球囊霉G. intraradices、幼套球囊霉G. etunicatum、珠状巨孢囊霉Gigaspora margarita和1个不接种对照，随机排列，重复15次。 1.3 接种与管理 番茄种子用0.1%的升汞溶液浸泡10min后用清水洗净，再用55℃的温水浸种15min，然后用清水浸种12h，于25℃恒温箱内催芽，待胚芽露出后播种，每育苗穴盘播入2粒，然后覆土盖种。当幼苗长出4片真叶后移栽于加入AM真菌接种物约12,000接种势单位（Liu & Luo 1994）的花盆内，每盆3棵；对照则加等量灭菌接种物和接种物滤液。全部盆栽生长于温室内并加盖防虫网；根据植株生长需要适当补充30%的Hoagland营养液，其他均常规管理。 1.4 测定指标与方法 接种AM真菌35d后，连续9d采集根系和第4、5片成熟叶于液氮中速冻后，贮存于-72℃下，用于测定信号物质和酶活性。 1.4.1 AM真菌侵染率：根样用10% KOH溶液透明，2% HCl酸化，0.1%酸性品红染色。于Olympus BX51显微镜下观察测定AM真菌侵染状况（刘润进和陈应龙 2007）。 1.4.2番茄植株生长量：采用常规方法定期测定植株高度、茎粗、节点数等；接种AM真菌45d后收获测定地上部和地下部干鲜重等。 1.4.3信号物质：（1）JA：采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定，试剂盒购自中国农业大学化控研究室。（2）NO：采用改进的Griess法测定，选取番茄完全展开叶，剪碎混匀后，称重。根样选取须根和主根的根尖部分，先用清水将根洗净后，再用蒸馏水冲洗，用滤纸将水吸干，剪碎混匀后称重。用液氮速冻后，贮存于超低温冰箱中待测。称取1g叶片放入40mmol/L HEPES（pH7.2）缓冲液1mL研磨，4mL缓冲液冲洗，用2层纱布过滤后，在4,440r/min离心10min，取上清液参考试剂盒说明书进行测定（试剂盒购自南京建成生物工程研究所）。0.1mL上清液加0.2mL反应液37℃反应60min，然后常温下710r/min离心10min，取0.5mL上清液加显色剂0.6mL显色，室温静置10min后，蒸馏水调零，用分光光度计在550nm、0.5cm光径比色测定吸光度，每处理重复3次。（3）H2O2：参照Feguson et al.（1983）的方法略加改动进行测定，取0.1g叶片用预冷丙酮1.6mL研磨成匀浆，3,000r/min离心10min。取1mL提取液，加20% TiCl4浓HCl溶液0.1mL，浓氨水0.2mL，3,000r/min离心10min，沉淀用丙酮悬浮洗涤5次后溶于3mL 1mol/L的H2SO4，测定A410值，然后换算成通用单位μmol/g FM，表示H2O2含量。（4）SA：采用高压液相色谱法（HPLC）测定，样品提取与测定参照张玉等（2004）的方法略加改动进行测定，取1g植物材料充分研磨后，加2.0mL 5%的三氯乙酸，加水至10mL后再加入15mL乙醚，充分摇匀，提取12h后，离心取出乙醚相，水相经乙醚重复提取2次，合并乙醚相，于旋转蒸发仪蒸干后，加入0.5mL 50%甲醇+50%乙酸钠（pH3.2）的混合液将其溶解后，得到游离态SA，置于小离心管中保存。水相加入18.5%的HCl至终浓度为3.2%，于80℃水浴中加热1.0h，冷却后经乙醚提取3次，合并乙醚相，蒸干后加入0.5mL 50%甲醇+50%乙酸钠（pH3.2）的混合液将其溶解后，得到结合态SA，置于小离心管中保存。样品经0.22μm的微孔过滤器过滤后，进行HPLC检测。根据峰面积计算标样的平均回收率为85%－95%。 1.4.4 抗性相关酶活性：过氧化物酶（POD）酶活性采用愈创木酚法（叶凡等 2007）、过氧化氢酶（CAT）采用Klapheck et al.（1990）描述的方法、超氧化物歧化酶（SOD）采用NBT法（吕秀兰等 2004）、PAL参照薛应龙（1985）的方法、MDA含量用硫代巴比妥酸法（李合生 2000）测定。 1.5 数据 实验数据经DPS数据处理系统处理，LSD法作多重比较分析，显著水平为5%。 2 结果与分析 2.1 AM真菌对番茄植株生长的影响 接种摩西球囊霉Glomus mosseae处理的番茄根系菌根侵染率最高，接种幼套球囊霉G. etunicatum的最低。接种AM真菌显著地促进了番茄植株的鲜重、植株高度、地上和地下部干重，以接种摩西球囊霉G. mosseae促进生长的效果最为显著（表1）。 2.2 AM真菌对番茄内源信号物质的影响 2.2.1 对番茄根系和叶片SA含量的影响：接种AM真菌后，根系和叶片内源结合态和游离态SA含量均呈现先升高后下降的趋势；接种AM真菌40d达到最大值，其中，摩西球囊霉G. mosseae诱导的含量最高；叶片中游离态SA含量明显高于结合态，且高于根内游离态SA；而根系中游离态SA含量一直低于对照，仅在诱导高峰时略高于对照（图1）。 表1 AM真菌对番茄植株生长的影响 Table 1 Effect of AM fungi on tomato plant growth 处理 Treatment 侵染率 Colonization rate (%) 植株鲜重 Plant fresh weight (g) 地上部干重 Dry mass of the ground part (g) 地下部干重 Root dry mass (g) 株高 Plant height (cm) 对照Control 0 10.1 c 2.63 d 0.63 d 23.8 e 地表球囊霉Glomus versiforme 53.5 b 14.9 ab 3.95 ab 1.66 b 33.5 ab 摩西球囊霉Glomus mosseae 76.5 a 15.6 a 4.07 a 1.86 a 35.8 a 珠状巨孢囊霉Gigaspora margarita 51.5 b 14.7 ab 3.86 b 1.57 b 32.0 b 幼套球囊霉Glomus etunicatum 41.5 c 13.4 b 2.76 cd 0.97 c 28.8 c 根内球囊霉Glomus intaradices 49.5 bc 14.1 b 2.98 c 1.13 c 25.7 de             注：于接种AM真菌后45d测定，同列中不同小写字母表示在5%水平差异显著. Note: The results were determined in 45 days after inoculation with AM fungi. Different small letters in the same column mean significant at 5% level. 图1 AM真菌对番茄根系和叶片中SA含量的影响  A：番茄根系中结合态SA的含量；B：番茄叶片中结合态SA的含量；C：番茄根系中游离态SA的含量；D：番茄叶片中游离态SA的含量. Fig. 1 Effects of AM fungi on SA content in tomato roots and leaves. A: SA glucosidate content in tomato roots; B: SA glucosidate content in tomato leaves; C: Free SA content in tomato roots; D: Free SA content in tomato leaves. 2.2.2 AM真菌对番茄根系和叶片NO含量的影响：AM真菌处理的番茄根系和叶片内源NO含量均显著增加，接种后38和39d分别达到最大值，其含量是对照的3－4倍，而第44天则基本与对照相同。叶片NO含量达到最大值的时间要晚于根系，含量也低于根内。摩西球囊霉Glomus mosseae所诱导的NO量最多，变化幅度也最大（图2）。 图2 AM真菌对番茄根系和叶片中NO含量的影响  A：番茄根系中NO的含量；B：番茄叶片中NO的含量. Fig. 2 Effects of AM fungi on NO content in tomato roots and leaves. A: NO content in tomato roots; B: NO content in tomato leaves. 2.2.3 AM真菌对番茄根系和叶片JA含量的影响：接种AM真菌的番茄根系和叶片中JA含量均显著增加，根内含量明显高于叶内含量，且叶内JA累积高峰滞后于根系；摩西球囊霉G. mosseae所诱导的内源JA含量最高；接种AM真菌40d后，番茄根系和叶片中JA含量均开始明显下降，43d后低于不接种对照（图3）。 2.2.4 AM真菌对番茄根系和叶片H2O2含量的影响：接种AM真菌的番茄根系和叶片中H2O2含量均有所增加，根内含量明显高于叶内；接种38d后根内H2O2含量最高，而叶片滞后于根系1d出现高峰；接种40d后，番茄根系和叶片中H2O2含量均低于不接种处理，摩西球囊霉G. mosseae诱导的H2O2含量最高，而后迅速降低（图4）。 图3 AM真菌对番茄根系和叶片中JA含量的影响  A：番茄根系中JA的含量；B：番茄叶片中JA的含量. Fig. 3 Effects of AM fungi on JA content in tomato roots and leaves. A: JA content in tomato roots; B: JA content in tomato leaves. 2.3 AM真菌对番茄植株SOD、POD、CAT、PAL活性的影响 接种AM真菌40d后，番茄根系和叶片中SOD、POD、CAT、PAL活性均显著高于对照；根内4种酶活性高于叶内；以摩西球囊霉G. mosseae的诱导效果最为显著（表2和表3）。 2.4 AM真菌对番茄植株MDA含量的影响 接种AM真菌的番茄根系和叶片中MDA积累量低于对照；根内MDA积累量低于叶内；接种摩西球囊霉G. mosseae处理的MDA含量最低，而接种幼套球囊霉G. etunicatum处理的最高（表2和表3）。 图4 AM真菌对番茄根系和叶片中H202含量的影响  A：番茄根系中H2O2的含量；B：番茄叶片中H2O2的含量. Fig. 4 Effects of AM fungi on H2O2 content in tomato roots and leaves. A: H2O2 content in tomato roots; B: H2O2 content in tomato leaves. 表2 接种AM真菌对番茄根系抗性相关酶活性的影响 Table2 Effect of different AM fungi on activities of resistance associated enzymes in tomato roots 处理 Treatment SOD活性 SOD activity (U/g) POD活性 POD activity (U/g·min) CAT活性 CAT activity (U/g·min) PAL活性 PAL activity (U/g·min ) MDA含量 MDA content (nmol/g) 对照Control 122.6 d 16.3 e 136.2 e 17.9 e 18.2 a 地表球囊霉Glomus versiforme 147.7 ab 51.6 b 223.5 b 33.2 c 10.7 b 摩西球囊霉Glomus mosseae 158.2 a 66.7 a 298.2 a 52.2 a 5.8 d 珠状巨孢囊霉Gigaspora margarita 147.6 ab 54.9 b 241.1 b 41.6 b 9.1 c 幼套球囊霉Glomus etunicatum 139.2 c 33.3 d 174.2 d 23.4 de 13.5 b 根内球囊霉Glomus intaradices 145.1 bc 42.8 c 191.0 c 26.5 d 13.0 b             注：于接种AM真菌后40d测定，同列中不同小写字母表示在5%水平差异显著. Note: The enzyme activities in tomato roots were determined at 40 days after inoculation with AM fungi. Different small letters in the same column mean significant at 5% level. 表3 接种AM真菌对番茄叶片抗性相关酶活性的影响 Table 3 Effect of different AM fungi on activities of resistance associated enzymes of tomato leaves 处理 Treatment SOD活性 SOD activity (U/g) POD活性 POD activity (U/g·min ) CAT活性 CAT activity (U/g·min) PAL 活性 PAL activity (U/g·min) MDA 含量 MDA content (nmol/g) 对照Control 56.2 d 2.9 e 27.4 c 12.2 f 8.3 a 地表球囊霉Glomus versiforme 80.5 b 17.6 bc 34.6 ab 28.7 c 5.5 c 摩西球囊霉Glomus mosseae 88.1 a 25.8 a 38.2 a 39.9 a 2.8 e 珠状巨孢囊霉Gigaspora margarita 78.8 b 21.5 b 34.9 ab 33.6 b 4.1 d 幼套球囊霉Glomus etunicatum 70.9 c 9.7 d 30.0 bc 18.9 e 7.3 b 根内球囊霉Glomus intaradices 73.5 bc 13 cd 32.0 bc 23.9 d 6.8 b             注：于接种AM 真菌后40d测定，同列中不同小写字母表示在5%水平差异显著. Note: The enzyme activities in tomato roots were determined at 40 days after inoculation with AM fungi. Different small letters in the same column mean significant at 5% level. 3 讨论 业已表明，AM真菌能诱导植物合成内源信号物质。Blilou et al.（1999）观察到摩西球囊霉Glomus mosseae侵染豌豆突变体的初期能够诱导游离态SA暂时积累；另一研究中烟草根内游离态和结合态SA含量均低于对照（Medina et al. 2003）。而本研究的结果则表明接种AM真菌不仅能提高番茄根系和叶片中游离态SA含量，还能促进结合态SA的积聚；叶内游离态含量高于根内的。也有研究发现接种根内球囊霉G. intraradices后，烟草植株内源JA和SA含量都保持不变（Riedel et al. 2008）。这说明除了不同植物的影响之外，采样时间和所测定的植物器官也可能会影响到测定结果。基于AM生长发育特点与番茄生长规律，本研究从接种35d后其侵染率达到较高水平并进入快速侵染阶段时，开始测定番茄根系侵染率、叶和根内信号物质含量，而Kapoor（2008）则是从番茄幼苗接种大果球囊霉G. macrocarpus 3个月后开始测定茎叶内JA含量。因此，在分析和比较AM真菌诱导效应时应注意到不同寄主植物生理特性、AM真菌种类、测定时间、部位和技术等导致的差异。