两性霉素B冻干脂质体的制备及体内外药剂学行为研究

两性霉素B冻干脂质体的制备及体内外药剂学行为研究 河北医科大学 硕士学位论文两性霉素B冻干脂质体的制备及体内外药剂学行为研究 姓名:王晓燕 申请学位级别:硕士 专业:药剂学 指导教师:曹德英 20080301 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则， 研究生签名:撼导师签衢院领导签;承担相应的法律责任。 矿矿罗年歹月衫日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写(，文责自负。 碱监轹王,昵轴师獬嘭陟, 缈孑年了月衫曰 中文摘要 两性霉素,冻干脂质体的制备 及体内外药剂学行为研究 摘 要 目的:两性霉素,(,,,,,,,,,;,,,，,,,)是一种治疗深部真菌感染的多烯类抗生素，对绝大多数真性致病性和机会性真菌病有很高的疗效，目前尚无适当的可替代药，仍被喻为治疗真菌感染的“黄金”。但临床使用时发现在治疗剂量时会产生比较严重的不良反应，从而使它的应用受到限锖,。 脂质体(,,,,,,,,,)是一种类似于生物膜结构的双分子层微囊。常规脂质体由磷脂和胆固醇组成的，含有脂质双层，内囊泡为水相。现脂质体技术已发展为一种定向的给药系统，可以作为各类治疗药剂的人工膜和赋形剂。这种微粒具有类细胞结构属于靶向给药系统的一种新剂型，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺等组织器官中积蓄，并优先聚集在感染炎症等部位，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。因此，基于以上考虑，本研究采用两性霉素,为模型药物，制备两性霉素,冻干脂质体，以使所输送药物定向释放、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性、使所包裹药物长效化等。 :在文献和预实验的基础上初步确定两性霉素,冻干脂质体的制备方法和处方，通过单因素考察初步确定影 中文摘要响脂质体制备因素。 对两性霉素,冻干脂质体的制备方法进行研究。采用薄膜分散法、主动载药法、乙醚注入法、逆相蒸发法四种方法制备脂质体，利用葡聚糖凝胶柱对脂质体与游离药物进行分离，测定脂质体两性霉素,的包封率。确定了薄膜分散法为两性霉素,冻干脂质体的制备方法。 以包封率和冻干复溶前后脂质体外观、粒径分布和稳定性等为指标，通过单因素考察优化脂质体的制备工艺，并考察类脂材料用量、磷脂胆固醇比例、药物用量和冻干保护剂等对脂质体的影响。在此基础上，采用四因素三水平正交试验对各种辅料用量进行筛选，并对评分结果进行分析最后确定脂质体的最佳处方。 分别绘制两性霉素,脂质体和两性霉素,溶液的体外释放曲线比较其体外释药过程，并用零级、一级、,,,,;,,和,,,,,,,方程进行拟合，考察相关系数。 以粒径，外观，颜色，氧化指数作为指标，考察了两性霉素,脂质体的物理和化学稳定性。 选用大鼠和小鼠作为动物模型，采用高效液相法分别对两性霉素,溶液和脂质体进行药物动力学及小鼠体内分布情况测定。液相条件:色谱柱:,,,,,,,,,?,,, ,,,(钻石),,,,,,,,,，,,(,,;预柱:,,,, ,,, ,,,,,,(, ,,;以乙腈:,,,,(,,,水(,(,,,,,,, ,),,:,,(,,,(,)为流动相;检测波长:,,,,,;柱温:,,。,;流速:,,,,,,,。用矩量法进行药代动力学参数处理，计算各种药动学参数。考察两性霉素,脂质体在大鼠体内的药物动力学和小鼠体内分布，并进行了靶向性评价。 中文摘要 结果:薄膜分散法所制备的脂质体包封率较高，采用正交设计，最佳处方为磷脂,,,,,，胆固醇,,,,,，药液浓度为,(,,,,,,,，蔗糖和甘露醇分别为,,,,、,,,,,。所制备薄膜分散法脂质体平均包封率为,,(,,，平均粒径为,,,(,,,，在光镜和透射电镜下呈类圆形，,,值为,(,,，粒径大小符合靶向要求。 两性霉素,脂质体和两性霉素,溶液的体外释放曲线，分别用零级、一级、,,,,;,,和,,,,,,,方程进行拟合，考察相关系数。两性霉素,脂质体和溶液体外释药均符合,,,,,,,方程， 分别为，,〔(，,(,(,)】,,(,,,，,,(,(, ,,，，,〔(，,(,(,)〕,,(,, ,,，,,(,(,, ,，相关系数分别为,,,(,,,,和,,,(,,,,。,,,为,,(,,,和,(,,,，,,为,,(,,,和,(,,,。由此可知，两性霉素,脂质体较两性霉素,水溶液具有缓释作用。 稳定性结果显示:在,,,条件下避光贮存,个月，冻干脂质体外观饱满，呈疏松粉状。复水性良好，形成均匀混悬液。包封率略有下降，粒径变化不大，稳定性较好，说明脂质体需在冷藏避光条件下保存。 药动学实验表明:两性霉素,溶液和两性霉素,脂质体静脉给药后，脂质体组与溶液组相比，在大鼠体内的消除半衰期延长，,,,,从,(,,,延长至,(,,,，,,,显著增高，清除率降低，可显著延长药物在体内的存留时间，从而延长药物到达组织的时间，可显著提高药物疗效。 小鼠体内分布实验表明，两性霉素,脂质体较两性霉素,溶液对肝脾和肺靶向性显著提高。溶液组中肝和脾,分别为,(,,矛,〕,(,,，而脂质体组中,,分别为,(,,并,,(,,，证明了两 中文摘要性霉素,脂质体对肝和脾有靶向作用，达到了设计要求。 结论:以两性霉素,为模型药物，以卵磷脂、胆固醇和冻干保护剂为主要材料，采用薄膜分散法制备的冻于脂质体，其制备工艺简单，质量可控。根据药物药理作用特点设计以肝脾和肺为靶点，作为靶向给药的新剂型具有良好的开发前景。 关键词:两性霉素,;脂质体;药物动力学;组织分布;靶向 英文摘要 ,,,,, ,, ,,, ，, ,,,,, ,,, ，, ,,,, ,,,,,,;,,,,;,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,—,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,;,,,,:,,,,,,,,,;,,, ,, , ,,;,,;,;,,;，,,,,,,,，,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,; 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,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,;,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,:,, ;,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,?, ,,, ,,, ,,—;,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,，(;,,,,,,;, ,,,,),,, ,,;,,,,,, ,,,,,,,;,,,,,(,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,;,,, ,,,,, ,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,(, ,, ,, ,(,,,(,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,;;,,,,,,, ,, ,,,,,,,，;,, ,,,,,, ,, ,,,,;;,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,;,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,, ;,,,,,,,; ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,, ;,, ,, ,;,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,(,,, ,,, ,,,,,,,;,,,,, ,,;,,,,,, ,, ,,,,,,，,,,,,，,,,,,, ,,, ,,,, ,, ;,,,,,,, ,, ,,,, ,, ;,,,,,, ,,,,,，,, ,, ;,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,, ,,, ;,, ,,,, ,,,,;,,, ,, ,;,,,,, ,,,,,,,;, ,, ,,,,,,,,, ,;,,,,( ,,, ;,,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,;,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,，,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,(,,,, ,,,,,,,,,,, ,,;,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,;,,,,(,,, ？,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,,,, ,,, ,, ;,,,,,,,,,,,, ,,,,,;,, ,,, ,,,,;,,, ;,,,,,,, ,,,,;, ,,, ,,,,;,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,;,( ,,, ,,,,,:,,,,,,,,,;,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,,;,;,,,,,,,,,;,,,;,,,,,, , 研究论文第一部分 两性霉素,冻干脂质体的制备 —‰,量 刖 舌 两性霉素,为黄色至橙黄色粉末，属于氨基糖甙类，分子式,,,,,,,,,,，分子量,,,(,,，熔点,,,。,。溶于二甲基亚砜中，微溶于,，,(二甲基甲酰胺，极微溶于甲醇中，几乎不溶于水，乙醚、无水乙醇、氯仿等„,,。其分子式结构如下所示: 两性霉素,(,,,,,,,,,;,, ,，,,,)是一种多烯类的抗生素，主要用于治疗深部真菌感染，能与真菌细胞膜上的麦角固醇结合，在膜上形成微孔，使细胞内物质外渗，导致细菌死亡乜,。对绝大多数真性致病性和机会性真菌病有很高的疗效，目前尚无适当的可替代药，仍被喻为治疗真菌感染的“黄金标准”。但,,,与真菌麦角固醇结合的特异性不高，亦能与哺乳动物的肾小管上皮细胞、肾上腺细胞、红细胞等细胞膜上的胆固醇结合，引起同样的损伤，故其毒性较大，将 研究论文,,,制成脂质体后，可以保持其良好的抗真菌活性而降低毒副反应，这主要是由于两性霉素,脂质体 (, ,,,,,,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,, ,，,,,—,)对真菌细胞膜的亲合性增强而对哺乳动物细胞膜的亲和力下降，同 时血浆中游离,,,,的浓度降低，毒副作用降低。 根据两性霉素,的性质，采用薄膜分散法、注入法、中和法、逆相蒸发法四种方法制备脂质体，确定了制备方法，并以包封率、稳定性等为指标，采用四因素三水平水平正交试验对各种辅料用量进行筛选均匀设计法对两性霉素,脂质体的制备工艺进行优化，采用综合评分法对各个处方进行筛选、评分，并对结果进行极差分析最后确定两性霉素,脂质体的最佳处方。 材料与方法,仪器与试药,(,仪器,(,,,,,智能药物溶出仪 天津大学无线电厂,,(, ,,,超声波清洗器 宁波科盛仪器厂,,,紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司,,,,,,,双光束自动记录分光光度仪 日本岛津,,,—，，，,循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司,,一,,,,集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英峪予华仪器厂,(,,,,旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司,,,,,,分析天平 上海天平仪器厂 研究论文 ,,,,,,,电子天平 上海精密科学仪器有限公司层析柱 天津玻璃仪器厂,(,药品与试剂两性霉素,原料药注射级,,,, 华北制药厂大豆磷脂(,,,,,,,) 上海爱康精细化工有限公司胆固醇 天津光复精细化工研究所麦芽糖糊精 法国,,？,,,,,乳糖 上海华茂乳制品有限公司甘露醇 石家庄市华兴医药化工厂蔗糖 石家庄市华兴医药化工厂,,,,,,,, ,一,, ,,,,,,;,,(,,,,,,)乙醚(分析纯) 天津化学试剂有限公司三氯甲烷(分析纯) 天津永大化学试剂开发中心甲醇(分析纯) 天津市大茂化学仪器供应站正辛醇(分析纯) 莱阳经济技术开发区精细化工厂磷酸二氢钠(分析纯) 天津永大化学试剂开发中心氢氧化钠(分析纯) 天津北方化玻购销中心,两性霉素,脂质体的处方工艺筛选,(,处方前研究,(,(,两性霉素,的油水分配系数测定【,】 两性霉素,油水分配系数的测定按公式: ,,,,,,,,(,—,,),,, 式中，,为药物的油水分配系数，,为药物在油相中的初始浓度，,,、,,为药物分配平衡时分别在水相和油相中测得的药物浓度。测得,,,,,,(,,,,，证明两性霉素,具有两亲性。,(,(,测定波长的选择 研究论文 分别用甲醇溶 解两性霉素,和空白脂质体，制成澄清溶液，稀释至一定浓度后在,,,(,,,,,做紫外扫描。,(,(,标准曲线的绘制 精密称取两性霉素,标准品适量于量瓶中，加甲醇溶解制成,,,,,?,,„,的标推液，精密量取,(,,，,(,,，，,(,,，,(,,，,(,,,,于,,,,量瓶中，用,,,缓冲液(,(,)稀释至刻度，用,,,缓冲液作空白，在,,,,,处分别测定吸光度，用吸光度,对浓度,作线性回归。,。,(,精密度试验 取低、中、高三浓度的标准对照液，在上述的测定条件下测定吸收度，一天,次，计算日内精密度;每日测定一次，连续测定,天，计算日间精密度。,(,(,方法回收率试验 取低、中、高三浓度的标准对照液各一份，分别按样品测定项下的方法测定，计算方法回收率。,(,脂质体的分离与包封率的测定,(,(,凝胶的选择 采用凝胶色谱法分离脂质体和游离药物测定包封率，可选用的凝胶范围较广，不同交联度的葡聚糖凝胶均有应用，本实验采用较常用的,,,,,,,,,(,,对游离药物脂质体分离。,(,(,磷酸盐缓冲液(,,,(,)的配制【,, 取磷酸二氢钾,(,,,，加,(,,,,,,氢氧化钠溶液,,(,,,，用水稀释至,,,,,即得，按此比例配制所需用量。,(,(,葡聚糖凝胶柱的制备 取一定量葡聚糖凝胶,,,,,,,, ,。,,，经磷酸盐缓冲液(,,,(,)溶胀,,,，装于,(,×,,;,的玻璃层析柱中，制备凝胶 研究论文柱，装柱高度,,;,。,(,(,洗脱曲线绘制 脂质体的分离方法有透析法、凝胶过滤法和超速离心法。本文选用常用的凝胶过滤法作为脂质体的分离方法，用少量,,,缓冲液平衡层析柱，取两性霉素,脂质体,(,,,上柱，用,,,缓冲液洗脱，流速控制为,(,,,?,,,”,左右，用刻度试管每,,,收集一份，共接取,,份，每份取,,,分别用甲醇稀释至,,,;对所有样品于,,,,,测定吸光度，绘制洗脱曲线。,(,(,柱回收率 配制高、中、低三浓度的两性霉素,标准液，分别取,(,,,上柱，按上述条件进行洗脱，收集游离药物组分后，稀释，定容，进行测定，计算两性霉素,药物的柱回收率。,(,(,加样回收率【,】 分别配制三种不同浓度的标准液，分别加入空白脂质体，得标准混合液，移取,(,,,上柱，按上述条件洗脱，收集游离药物组分后，稀释，定容，进行测定，计算柱加样回收率。,(,(,包封率测定 精密量取定量稀释后的两性霉素,脂质体,(,,,上柱，进行分离。以,,,(,的,,,缓冲液为洗脱介质，接取,,,。,,,,洗脱液于,,,,量瓶中，并用,,,缓冲液中定容，测定吸收度，按以下公式,,。刀计算包封率: 研究论文 ,胁警枷毗其中，,一系统中的总药量;,一未包封的游离药物量。,(,制备方法选择,(,(,薄膜—超声法【,(,】 精密称取一定量的磷脂和胆固醇，用适量氯仿溶解，取一定量两性霉素,用甲醇溶解，与类脂溶液混合，减压蒸发成薄膜，加入一定量的,,,缓冲液使薄膜脱落溶解，常温下用浴式超声仪使其分散均匀，得脂质体混悬液。用葡聚糖凝胶柱层析法分离游离药物和含药脂质体，测定其包封率。,(,(,主动载药法【,,】 将磷脂、胆固醇按,:,(,,,)的比例混合，用氯仿溶解，于旋转蒸发器上减压除掉有机溶剂，制备磷脂膜。然后加入,,,,的枸橼酸水溶液，缓冲液水化,,,,,，即得空白脂质体。用,,,,(,的一定浓度的两性霉素,氢氧化钠溶液，调节所得脂质体的,,值至,,,,(,，调整体积至所需浓度，所得脂质体于,,?孵育,,即得。,(,(,乙醚注入法【,,】 精密称取一定量的磷脂和胆固醇共同溶于,(,,,乙醚中，在恒温,,。 ,并搅拌下，用注射器将其缓缓注入至,,,,的药液中，继续搅拌,,除去乙醚，得脂质体混悬液。用葡聚糖凝胶柱层析法分离游离药物和含药脂质体，测定其包封率。 研究论文,(,(,逆向蒸发法【,,】 将两性霉素,,,,,溶于甲醇中配制成一定浓度的溶液备用。取磷脂,,,,,、胆固醇,,,,溶于,,,，氯仿溶液中，混合后置于梨形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸发去除有机溶剂，使在壁上形成均匀的薄膜层。加入,,,,的氯仿和乙醚的混合液(体积比为,:,)溶解脂质膜，再加入,,, ,,,,(,的磷酸盐缓冲液，超声制成均匀乳剂，,,?减压蒸发至胶态，加入适量缓冲液，水化即得两性霉素,脂质体混悬液。,(,薄膜分散法制备两性霉素,脂质体工艺考察,(,(,磷脂浓度的影响 固定药物投药量为,,,,，其它条件不变情况下，改变磷脂用量，测定所得脂质体的包封率。,(,(,磷脂和胆固醇的质量比对包封率的影响 磷脂总质量分数为,,，其它条件不变，参照文献，改变大豆磷脂与胆固醇的质量比为,:,、,:,、,:,，考察其对脂质体形成的影响。,(,(,磷脂与药物质量比的影响 固定磷脂总质量分数为,,，其它条件不变，参照文献，改变磷脂与药物的质量比为,,:,、,,:,、,:,，考察其对脂质体形成的影响。,(,(,磷脂与冻干保护剂的影响,,,,, 固定磷脂总质量分数为,,，大豆磷脂与胆固醇的质量比为,:,，磷脂与药物质量比为,,:,，其它条件不变，考察甘露醇、麦芽糖糊精、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖等不同冻干保护剂单用及合用对脂质体形成的影响。,(,(,冷冻干燥工艺条件的确定 研究论文,(,(,(,最低共熔点的确定 将配置好的冻干原液应用冷冻干燥机测定最低共熔点，从冻干曲线得到产品的最低共熔点。,(,(,(,预冻 将冻干原液置冻干机搁板上放进冰箱，在(,,?进行冷冻，时间为,,,。,(,(,(,干燥 分两个阶.