大鼠体外循环基础上应用停跳液心脏停跳模型的建立

大鼠体外循环基础上应用停跳液心脏停跳模型的建立 大鼠体外循环基础上应用停跳液心脏停跳 模型的建立 346肺血管病杂志2009年9月第28卷第5期JournalofCardiovascular&PulmonaryDiseases,September2009,Vo1.28,No.5 DOI:10.3969/j.issn.1007-5062.2009.05.016 大 心 鼠体外循环基础上应用停跳液 脏停跳模型的建立 朱斌MihaiV.PG.BurkhardM叶铁虎黄宇光 ? 基础研究? [摘要]目的:在大鼠普通体外循环(CPB)模型基础上,建立灌注心停跳液心脏停跳(CA)模型,比 较CA模型与普通CPB模型实验大鼠心肌缺血再灌注损伤情况;观察CA模型大鼠术后的存活和恢复情 况.方法:借助血管穿刺置管技术,在大鼠普通CPB模型基础上,通过右侧颈总动脉置入双腔气囊导管, 充气套囊,阻断升主动脉及灌注心脏停跳液使心脏停搏.比较CPB模型大鼠(n:6)和CA模型大鼠(n = 15)心肌缺血再灌注损伤的区别;分别在术后1d,1周和2周3个时点观察CA模型大鼠恢复情况(n= 5).结果:CA大鼠在心脏缺血再灌注60min后,心型脂肪酸结合蛋白(HFABP)和心肌肌钙蛋白I(cTnI) 明显高于术前基础值和普通CPB组水平,在复灌后3h达到顶峰,术后1d降低,在术后1周和2周的观 察时点回降至术前水平.左心室射血分数(EF)在2组动物之间差别不大;舒张早期 血流峰值/舒张晚期 血流峰值比值(E/A比值)在CPB后降低,而在CA后进一步下降.CA组大鼠均存活, 但术后质量明显降 低,在术后1周时最为显着,2周时大鼠质量已经恢复,并且超过术前水平.结论:本 实验在普通的CPB 模型基础上成功的建立了CA模型.同普通CPB模型大鼠相比,CA模型大鼠在 CPB心脏缺血再灌注 后,出现了明显的心肌损伤.CA大鼠具有较高的存活率. [关键词]体外循环;心脏停跳模型;缺血再灌注;心肌损伤;大鼠 [中图分类号]R54[文献码]A[文章编号]1007—5062(2009)05—346.05 TheestablishmentofCardioplegicArrestmodelonthebasisofgeneralcardiopulmonarybypassinratsZHU Bin,MihaiV.P,G.BurkhardM,YET&hu,HUANGYuguangDepartmentofAnesthesio~gy,PekingUnion Hospital,CAMS&PUMC,Bei100730,China. [Abstract]Objective:Toestablishcardioplegicarrest(CA)modelonthebasisofgeneralcardiopulmonary bypass(CPB)inrats;tocomparethemyocardialischemia— reperfusioninjuryrelatedtoCAandCPBandtoobserve thesurvivalandtherecoverystatusofCAinrats.Method:Adouble— lumenballooncatheterWfl$cannulatedthrough therightcarotidarteryintotheascendingaorticartery.Thecardioplegicarrestwasachievedbyintraaorticclamping throughballooninflationandbycardioplegiainfusion.Tocomparethemyocardialischemia—reperfusioninjuryrelated toCAandCPBandrespectivelyobservethesurvivalandtherecoveryofCAratsat1day,1weekand2weeksafter cardioplegiearrest.Reset:Atsixtyminutesaftercardiacarrest,HFABPandcTn1weresignificantlyincreased comparedwithbaselineandtheratsinCPBgroup,reachedpeakvalueat3hoursafterreperfusion,reduced1day postoperativelyandreturnedtobaselinelevelsat1and2week.Leftventricularejectionfractiondidn'tshowobvious changebetweenCAandCPBgroup;E/AratiowasreducedafterCPBandfurtherreducedafterCA.Allratssurvived withsignificantbodyweightloss1dayand1weekpostoperativelybutfullyrecovered2weeksaftersurgery. Conclusion:ThecardioplegicarrestmodelissuccessfullyestablishedonthebasisofgeneralCPBmodelinrats.CA ratsshowedsignificantmyocardialinjurybutpresentedasatisfactorysurvivalrate. [KeywordsjCardiopulmonarybypass;Cardioplegicarrestmodel;lschemia— reperfusion;Myocardiaminjury; Rat. 作者单位:1~730中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医 院麻醉科(朱斌叶铁虎黄宇光);美国杜克大学医学中心麻醉科 (MihaiV.P,G.BurkhardM) 尽管外科手术,麻醉,体外循环以及围术期心肌 保护方法已经取得了很大的进步,但是心脏手术术 后心肌梗死(myocardialinfarction,MI)的发病率仍为 肺笪痈杂志2009年9月第28卷第5期Jouma1ofcardi0vascuIar& 7%,l9%..心脏手术后MI可能是多因素的综合 结果,如直接外科手术操作引起的创伤,心脏停跳复 跳的心肌缺血再灌注损伤以及体外循环 (cardiopulmonarybypass,cPB)的全身影响等.目前 模拟心脏手术的实验模型多局限在大动物,而与大动 物相比,大鼠相对廉价,易存活,因此模拟心脏手术的 大鼠CPB模型则具有经济,可重复性强等优势. 本实验室和其他一些研究者已经成功在大鼠上 建立起了普通CPB模型H..和临床心脏手术实际 相比,这些模型最突出的一个问是不能利用停跳 液使大鼠心脏停跳.Gtinzinger等曾尝试直接阻断 主动脉并灌注停跳液,大鼠心脏成功被停跳.由于 研究者是在正中开胸和双侧颈总动脉置管结扎前提 下进行的实验,实验大鼠理论上讲术后没有存活的 可能. 本研究拟以血管穿刺置管技术,在大鼠普通 CPB模型基础上,通过右侧颈总动脉置入双腔气囊 导管建立起灌注心停跳液心脏停跳模型(cardiopleg— icarrest,CA),以比较CA与CPB心肌缺血再灌注损 伤的区别;并观察CA模型大鼠的存活情况. 资料与方法 本动物实验经过杜克大学动物委员会批准,并 符合美国国立卫生研究院关于使用实验室动物的相 关规定(No.86—23,revised1996).雄性Sprague— Dawley大鼠(鼠龄14,16周,体质量400,450g,购 于Harlan,Indianapolis,IN,USA),禁食12,16h,自 由饮水.于术日晨以5%异氟烷吸入诱导麻醉后, 行经口气管内插管,接呼吸机型行机械通气,吸入 50%空一氧混合气,调整潮气量和呼吸频率,以确保 呼气末二氧化碳(PCO)在32,42mmHg(1mmHg = 0.133kPa)之间.在以下的手术准备期间,持续 吸入2%异氟烷维持麻醉.将针型YSI552体温计 (YSITemperature,Dayton,OH,USA)置于大鼠头部 皮下进行持续体温监测.其余手术操作遵循无菌操 作原则,手术区域以1%利多卡因浸润.在显微镜 下共进行5支血管的穿刺置管.以聚乙烯导管 (PE一10)置人腹壁尾侧浅动脉行持续动脉压监测;以 24号静脉留置套管针套管进行腹壁尾侧浅静脉穿 刺置管,建立起输液给药静脉途径并予以肝素400 IU/kg;以20号静脉留置套管针进行大鼠腹侧尾动 脉穿刺置管,作为CPB动脉回流管道;通过右侧颈 外静脉置入4.5F多孔套管(改制于4.5French Desilets—Hoffman儿科引导管,CookInc,Bloomington, 347 IN,USA),其尖端至右心房水平,作为CPB静脉流 出通道.多孔导管位置通过超声定位(Sonos7500, PhillipsMedicalSystems,Andover,MA,USA).通过 右侧颈总动脉插入球囊直径3.5rrtm的双腔球囊扩 张导管(SprinterOTW,MedtronicInc,Minlqcapolis, MN,USA)至大鼠升主动脉.利用超声定位,确保导 管尖端距离主动脉瓣0.25,0.35cm,(图1).所有 置管用丝线原位固定防止滑脱或进气.在外科准备 完成后,测量动脉血气和心功能基础值,并抽取血液 标本,低温离心后.80%冰箱保存,用以测量心肌损 伤指标(cTnI和HFABP). 图1双腔球囊套管在升主动内位置 本图套管尖端与主动脉瓣距离为0.351em CPB管道包括一个特制的容积为8mL的静脉 贮血器,蠕动泵(Masterflex,Cole—Parmer仪器公司, VemOBHills,IL,US),流量探测器(2N806流量探头和 T208流量计;TransonicsSystems,Inc,Ithaca,NY,US), 特制膜氧合器(JostraAG,Hi~lingen,Germany),预充 量4mL,气体交换面积558cm2.上述各部分以1.6 mm内径无菌硅胶管连接.整个CPB管道预充9mL 6%羟乙基淀粉胶体溶液,CPB流量维持在于大鼠正 常心输出量水平:160,180mL一?kg,?nll.n. CPB动脉灌注温度通过变温水浴系统进行调解.外 科准备和CPB管道连接情况见图2. 实验分为2部分:第一部分,在普通CPB模型 基础上建立停跳液CA模型,并比较CPB模型大鼠 (=6)和CA模型大鼠(=15)心肌缺血再灌注损 伤的区别;第二部分,分别在术后1d,1周和2周3 个时点观察CA模型大鼠恢复情况(=5).所有实 验大鼠在开始CPB前,静脉途径予以肝素400 IU/kg,芬太尼25~g/kg,泮库溴铵0.2mg/kg,并将吸 人异氟烷浓度降低至1%.将呼吸频率减半,CPB 模型组大鼠在整个CPB过程中维持该呼吸频率的 机械通气,CPB气体流量根据血气结果调整,CPB持 续75min.CA模型大鼠在CPB开始后降温,15min 3482009,Vo1.28,No.5心肺血管病杂志2009年9月第28卷第5期Jou— rnalofCardiovascular& 图2手术准备和CPB管道连接情况模式图 (修改自LangeFDetal.) 后,大鼠体温接近33?,充气升主动脉内双腔球囊 扩张导管套囊,阻断升主动脉,通过导管中心管腔灌 注氧合含血冷心脏停跳液2mL.停跳液成份包括: 3份氧合血液,1份艾司洛尔(10mg/mL)和2份冷晶 体停跳液(5%葡萄糖,0.225%氯化钠,95mEq/L氯 化钾,238ml/L三羟甲基氨基甲烷,枸橼酸盐磷酸盐 右旋糖液60ml/L).通过心电图和实时经胸超声证 实心脏停止搏动.当成功建立CA后,完全停止机 械通气.本实验心脏停跳时间为45min,在停跳至 25min时,追加1.5mL氧合含血冷心脏停跳液,其 间如果超声监测发现心脏有跳动迹象随时追加停跳 液0.5mL.CA组大鼠术中如果出现不能停跳或停 跳后提前复跳,则视为失败.大鼠在CA35min时 开始复温,心脏停跳45min后,套囊放气,重新恢复 心脏血供.CA期间持续静脉输注去甲.肾上腺素维 持平均动脉血压>40mmHg(1mlTlHg=0.133kPa), CA后持续输注肾上腺素以利于心脏复跳,如果动物 出现明显代谢性酸中毒(BE<一6),给予碳酸氢钠纠 正.CA组大鼠在复跳后继续CPB15min.所有实 验动物在CPB后都顺利脱机,恢复正常机械通气. CPB管道中剩余血液常温下以3000转/min,离心2, 3min以浓缩预充所致的血液稀释,将浓缩所得红细 胞缓慢回输给实验大鼠.逐步退出所有血管置管,并 结扎相应血管及缝合伤口.约90min后大鼠麻醉后 苏醒,恢复自主呼吸并拔除气管插管.密切观察2组 动物麻醉复苏活动情况,2组实验大鼠全部存活,于 手术第二天将动物送回动物房饲养,CA模型组大鼠 分别观察1d,1周和2周3个时点(n=5). 所有实验动物持续监测体温,动脉血压及CPB 流量.分别在CPB前,CPB15min,CA5rain(CPB20 min),CA20min(CPB35min),CA45min(CPB60min), 复灌5min(CPB65min)以及复灌后60min测定动脉 血气(GEMPremier3000血气分析仪,Instrumentation Lab0ratory,lexington,MA,US).记录2组实验动物 去甲肾上腺素,肾上腺素和碳酸氢钠用量. 心肌肌钙蛋白I(cardiactroponinI,cTnI)用于诊 断心肌梗死.心型脂肪酸结合蛋白(heart.typefatty acidbindingprotein,HFABP)用于早期监测心肌损 伤.本研究分别利用大鼠HFABPELISA试剂盒 (|JifeDiagnosticsInc.WestChester,PA,USA)和大鼠 高敏感cTnIELISA试剂盒(LifeDiagnosticsInc.West Chester,PA,USA)测定CPB前和复灌60min后的 cTnI和HFABP水平. 本研究中,二维彩色多普勒超声心动图仪 (Sonos7500,PhillipsMedicalSystems,Andover,MA, us)除用于静脉流出管道和升主动脉内双腔球囊扩 张导管定位外,还分别在CPB前和复灌60min后测 定左心室射血分数和舒张早期血流峰值,舒张晚期 血流峰值比值(E/A比值)以评估大鼠心功能状况. 所使用超声探头为S12新生儿5,12MHz心脏相位 排列探头.在获取图像即刻,暂停机械通气. 对于CA模型组大鼠,分别在术后1d,1周和2 周3个时点(n=5)测量大鼠体质量,了解手术创伤 后恢复情况.在异氟烷麻醉诱导下完成气管插管行 机械通气.超声测量大鼠心脏左心室短轴缩短率 (fractionshortening,FS).利用血管穿刺置管技术完 成尾动脉和右侧股动脉置管以测定动脉血压和获取 测量心肌损伤指标的血液标本.在完成相关指标测 量后,处死实验大鼠. 统计学分析:应用SPSS10.0软件进行处理和统 计分析,资料以均数?差表示,不同时点间均数 比较用单因素方差分析,两两比较用I_SD检验 (Least—significantDifference,最小显着差值法);CPB 组与CA组之问比较用t检验,P<0.05为差异有统 计学意义. 结果 1.CPB组和CA组大鼠的血气和基本生理指标 比较2组大鼠血气和基本生理指标比较见表1. 大鼠体温在CPB开始后下降,在CA期间维持在浅 低温32?,33?之间,明显低于其基础值.CA组血 压在心脏停跳阶段位于>40mmHg的较低水平,明 显低于基础值和普通CPB组,但是复温复灌后,血 压保持在CPB前水平,与CPB组接近.CA组大鼠 CBP流量在心脏停跳阶段明显高于基础值和普通 !堕笪杂2009年9月第28卷第5期Journal0fcardi0vascuIar& 表l2组血气及基本生理指标 349 缉另『l坚!呈!!!!——竺!垒篁 PreCPBR60minPreCPBR60minPreCPBR6ominPreCPBR60rain 注:与PreCPB相比,P<0.05;与CPB组相比,P<0.05 CPB组.pH在2组动物之间变化相似,在复灌或 CPB后期都较术前值有所降低.二氧化碳分压 (PaCO)和动脉血氧饱和度(SaO)在手术前后都保 持在正常范围.血钾浓度在CA组复灌后有一过性 显着升高,但是仍保持在l临床正常范围内.乳酸浓 度在CA组动物心脏缺血开始后升高而同时碱剩余 降低.血红蛋白浓度在2组大鼠变化类似,在CPB 后都存在一定程度的稀释.CPB组大鼠不需要使用 血管活性药物和碳酸氢钠;而CA组大鼠必须使用 去甲肾上腺素(平均用量50,100ptg),肾上腺素(平 均用量8O,150btg)和5%碳酸氢钠(3z均用量0.6, 1.2mL)才可以维持合适的血压和血气(表1). 2.CPB组和CA组大鼠心肌损伤程度和心功能 比较CA大鼠在心脏缺血再灌注60min后,心型 脂肪酸结合蛋白(HFABP)和心肌肌钙蛋白(cTnI)明 显高于术前基础值和普通CPB组水平.左心室射 血分数在2组动物之间差别不大;E/A比值在CPB 后降低,而在CA后进一步下降(表2). 3.CA组大鼠在术后存活和恢复情况在CA 组,所有成功进行心脏停跳的实验大鼠均存活.术 后体质量明显降低,在术后1周时最为显着,2周时 大鼠体质量已经恢复,并且超过术前水平(表3). 表3CPB和CA后实验大鼠体质量恢复情况(n=5) CA组大鼠在心脏缺血再灌注60min后,cTnI和 HFABP显着升高,3h达到顶峰,术后ld降低,但是 cTnI仍显着高于术前值,在术后1周和2周的观察时 点,cTnI和HFABP降低至术前水平(图3).CA组大 鼠心脏左心室短轴缩短率在心肌缺血再灌注60min E e 矮 图3CA组大鼠术后心肌损伤指标变化 与PreCPB相比,尸<0.05 3502009,vo1.28,No.5肺血管病杂志2009年9月第28鲞雪塑— JournalofCa— rdiovascular& 后显着升高,在术后3h和1d仍高于术前,在术后1 周和2周的观察时点,FS降低至术前水平(图4). 时间 图4CA组大鼠术后左心室短轴缩短率(FS)变化与 PreCPB相比,P<0.05;与PmCPB相比,P<0.01 讨论 本研究在普通CPB模型基础上成功建立了CA 模型.同普通CPB模型大鼠相比,CA模型大鼠在 体外循环心脏缺血再灌注后,出现了明显的心肌损 伤;尽管左心室EF与单纯CPB相比变化不大,但舒 张功能显着降低.由于所有CA模型大鼠在心脏停 跳期间和复灌后先后或同时输注了去甲肾上腺素和 肾上腺素,测量所得的心脏功能指标可能难以真实 反映受试大鼠当时的实际心功能状况.所有CA大 鼠均成功存活至实验所需的观察时点.心脏缺血再 灌注损伤所释放的心肌酶在术后1d后逐渐恢复回 落,1周后恢复正常,而实验大鼠体质量在术后明显 降低,l周时最为显着,2周时大鼠体质量已经恢复, 并且超过术前水平. 同普通CPB相比,本模型的关键在于如何利用 超声定位确保升主动脉内双腔球囊扩张导管尖端的 准确位置.本实验表明,当导管尖端距离主动脉瓣 0.25—0.35ClTI时,灌注停跳液可以获得较好的心脏 停搏效果.位置过深,距离过短时,在球囊充气后, 导管尖端可能"滑"向左心室,此时灌注2mL停跳液 非但不能使心脏停搏,反而可能因过度扩张左心室 导致心肌损伤.位置过浅,距离过长时,充气球囊部 分可能位于头臂干内因而难以完全封堵升主动脉, 即使灌注过量的停跳液也难以获得良好的心脏停搏 效果.因导管位置不佳而导致的心脏停搏不能是本 CA模型失败的主要原因,即便受试动物不因此死 亡,但是失去了继续实验的意义.在本实验室,因为 这类问题而放弃的体质量在400,450g之间的sD 大鼠接近l0%. 由于本大鼠CA模型在最大限度上模拟了心脏 手术和CPB所造成的心肌缺血再灌注损伤,而且实 验动物具有较高的存活率和与临床类似的恢复过 程,这为研究心脏手术术后的心肌梗死病理生理机 制和心肌保护策略提供了优异且经济的动物模型. 参考文献 [1]ManganoDT.Effectsofacadesineonmyocardialinfarction, stroke,anddeathfollowingsurgery.Ameta—analysisofthe 5internationalrandomizedtrials.11leMulticenterStudyof PerioperativeIschemia(McSPI)ResearchGroup.JAMA, 1997,277:325—332. 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