基因诊断和基因治疗

基因诊断和基因治疗 概念:基因诊断的基本概况: 伴随分子生物学理论技术的发展而建立和发展。基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定DNA序列。基因的改变，DNA双螺旋遗传密码破译DNA重组会导致各种型的改变，进而引起疾病的发生。 癌基因与抑癌基因研究将基因或其组成部分发生异常的疾病统 称为基因病。地中海贫血病基因治疗和逆转录病毒载体开发 PCR、分子杂交等一系列技术发展 二、基因诊断的对象基因病分为三大类: 1、病原生物的侵入一、单基因病:由单个基因突变引起的一类疾病。病原体:病毒、支原体、细菌、寄生虫如:血友病、地中海贫血等。 检查诊断:显微镜、免疫学方法、基因诊断等。二、多基因病:由多个基因突变综合作用引起的疾病。如:恶性肿瘤、高血压、动脉硬化、尤其是当无抗体时，基因诊断成为唯一手段。糖尿病、先天畸形等、 2、先天遗传性疾病三、获得性基因病:指外源基因(DNA)侵入， 在机体产生疾病，一旦将其清除便可痊愈。遗传性疾病: 发病的原因为特定基因的突变。如:艾滋病及各种微生物感染病。 第一节基因诊断(DNA diagnosis)二、基因诊断的对象一、基因诊断的概念和基本概况 3、后天基因突变引起的疾病临床疾病诊断四种方式:肿瘤的发生:以疾病表型改变为依据。(细胞形态结构变化、代谢临床诊断产物异常、特定蛋白分子识发病机理尚不请。生化学诊断别差异等)免疫学诊断初步认为是个别细胞基因突变而引起的基因诊断对患者基因直接分析细胞无限增殖.(包括抑癌基因和癌基因) 二、基因诊断的对象基因诊断定义(概念): 基因诊断是利用现代分子生物学和分子遗4、其他 传学的技术方法，直接检测患者体内基因结构个体识别、亲子鉴定、法医物证及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断(1)用核心顺序的串联重复序列组成探针进行杂交研或辅助诊断。究，可同时检出具有高度多态性位点。(2)用southern 杂交得到DNA指纹图谱基因诊断是在DNA/RNA水平检测分析基因的遗传稳定，个体特异，因而用于法医和亲子鉴存在、结构变异和表达状态，与传统诊断方法定。 比较有其特点: (与以疾病表型改变为依据的基因诊断的特点:基因诊断的基本策略:诊断技术相比) 1、病因诊断:1、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因直接瞄准病理基因，不仅对表型出现的疾病作出诊断，还可能发现这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位潜在的致病因素，如: 确定有遗传家族史的人携带致病基因。在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因2、特异性强、灵敏度高:改变亦较清楚。选用特定基因序列作为探针，单拷贝基因采用高度扩增PCR技术。 3、稳定性高如:已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生虫的基因、目的基因是否处于活化状态均可。样品可长期保存。与致病有关的癌基因、抗癌基因、4、诊断范围广，适应性强地中海贫血、苯丙酮尿症等遗传病基因。可检测正在生长的病原体或潜在病原体。 reduction in property value. Find warning signals, timely reporting or warning, develop and implement measures against customer transfers and other acts leading to loss or increase the difficulty of clearing. Personal credit business of late, agencies should be timely collection, if necessary, ask the right institutions to bring proceedings. Non-approved by head office, agencies at all levels shall not without the following: give 核酸分子杂交,,核酸印迹杂交2、检测与某种遗传标志连锁的致病基因 遗传连锁,,同一染色体相邻的二个或二个以上的基,DNA印迹杂交(Southern blot)因或限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离几率很低，常一起遗传------称连锁。,RNA印迹杂交(Nouthern blot)染色体遗传连锁图,,用限制性内切酶酶切位点作遗传,斑点印迹杂交(Dot-blot)标志，定位与之相连锁的正常基因与致病基因，建立相应的遗传连锁图谱。,原位杂交(situ hybridization) 定位性克隆,,根据遗传连锁图进行定位性克隆。比较正常和异常基因的差别，可找出导致遗传病的分子缺陷。 定位性克隆策略是当前基因诊断的重要基础。 该策略既不需预先知道基因的生化功能或图谱定位，也不受基因数目及其相互作用方式的3、检测表型克隆基因核酸印迹杂交基本过程:影响。 针对多基因病(如:重度肥胖、哮喘、高血压、癫1、制备样品:痫、精神病、多种自身免疫性疾病)。 表型克隆技术,,是将有关表型与基因结构结合，直接提取DNA或RNA ?酶切?凝胶电泳?胶变分离该表型的相关基因，并对疾病相关的一组基因进行克隆，然后用作多种探针，来诊断多基因遗传病。1、DD-RT-PCR:分析正常和异常基因组方法:性处理(DNA)?转印核酸片段到NC膜上。寻找两者之间的差异序列 (RNA可直接用变性胶电泳，转膜)2、基因组错配筛选技术:寻找两者的全同序列，分离、鉴定与疾病相关的基因，确定导致疾病的分 子缺陷 基因诊断的基本步骤: 核酸印迹杂交基本过程:1、获得待检样品:提取核酸(PCR提高灵敏度) (2)制备探针: 2、制备和标记核酸探针探针:一段能和待检测核酸分子按碱基互补配对原则而结合的核酸分子片段。3、基因检测分析 探针需要标记可直接检测的元素或分子。 如:同位素、荧光、生物素等 核酸印迹杂交基本过程:三、基因诊断的常用技术 (3)杂交:预杂交,,封闭非特异性结合位点,核酸分子杂交杂交,,探针与核酸分子结合,聚合酶链反应(PCR),限制性片段长度多态性(RELP)(4)检测:方法依标记的探针而不同,扩增片段长度多态性(AFLP)*放射性同位素,等位基因特异的寡核苷酸(ASO)*生物素,单链构象多态性(SSCP)*地高辛,基因芯片*荧光素核酸印迹杂交可检测pg水平的靶分子 核酸印迹杂交基本过程:1、核酸分子杂交 原理: 利用核酸的变性、复性及碱基互补的性质，用已知基因的核酸序列作探针，与变性后的单链基因组DNA/RNA杂交，检测核酸样品中是否存在与探针互补的同源核酸序列，进行DNA或RNA定性定量分析。1、必需的特异探针(标记的)基因检验的两个必要条件: 2、必需的基因组DNA , agencies at all levels shall not without the following: giveapproved by head office-e, agencies should be timely collection, if necessary, ask the right institutions to bring proceedings. Nonnst customer transfers and other acts leading to loss or increase the difficulty of clearing. Personal credit business of latreduction in property value. Find warning signals, timely reporting or warning, develop and implement measures agai2 2、聚合酶链反应(PCR)其他重要的PCR衍生技术一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。反向PCR(IPCR)(无细胞分子克隆技术)。 标记引物PCR(labelled primers PCR)原理: 以待扩增DNA为，在互补模板两端序列的寡核锚定PCR(anchored PCR)苷酸引物介导下，通过耐高温DNA聚合酶催化下，按半保留复制机制延模板链延伸，快速、特异地扩差异展示PCR(DD-PCR)增特定的DNA。(见书“分子生物学技术”章节) 3、限制性片段长度多态性(RFLP)耐高温DNA聚合酶,,,Taq酶 概念:源自水栖高温菌，最适反应温度为72?，且经 90?以上加温后仍可在温度恢复后复性。人类基因组中由中性突变导致个体间核苷酸的差异称,,DNA多态性寡核苷酸引物:设计引物和确定退火温度是PCR用同一限制性内切酶完全切割同一物种的不同个体的。成功的关键基因组DNA，出现分子质量不同的同源片段，这种由限制性内切酶酶切位点变化导致的DNA片段差异，称PCR的基本过程:(循环程序)限制性片段长度多态性(RFLP)。变性(95?)?退火(55?,65 ?)?延伸(72 ?) 3,5分40’’,1分100bp/1分检出方法:Southern 印迹 n (呈2扩增速度)PCR基本过程和原理 RFLP类型: 特点:特异性强1、单个碱基的突变引起酶切位点的变化灵敏度高,,,点多态性样品可以是:2、由于链内发生较大片段的缺失、重复、插毛发、血痕入和重排导致DNA顺序的变化，因而酶切片单细胞、病原体、段改变,,,序列多态性。肿瘤残留物、犯罪现场遗留物致病基因附近或内部一般存在RFLP,可用于连锁分析的基因诊断。 (四)扩增片段长度多态性(AFLP)基因诊断中常用的PCR技术:AFLP,,串联重复的短片段的长度多态性通过PCR扩增,经限制性内切酶酶切后电泳,(1)、DNA PCR:产生显示扩增片段多态性。以DNA为模板，扩增特定核苷酸序列。用于检测特定基因片段的存在，分析鉴定基因突变。 应用于基因突变性质不明的连锁分析。(2)、RT-PCR:以总RNA或mRNA为模板，逆转录为cDNA后扩增。用(3)、PCR-SSCP:于检测特定基因表达水平的主要方法之一。检测基因未知突变的常用技术。简单、快捷、灵敏。 PCR扩增产物即等位片段之间差别只有几个bp。AFLP原理:(4)、多重PCR: 指在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增DNA首先利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研序列上不同序列片段的一种PCR技术。用于一些“超大”究对象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的人基因中大片段缺失分析。(5)、原位PCR:工接头连接，形成模板。为达到选择性扩增的目的，直接用组织切片和细胞进行PCR或RT-PCR，在组织、再在模板末端添加具有选择性核苷酸(1,3个)的不同引物，然后PCR扩增，结果只有那些两端序列与选细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特点基因序列。择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后将被扩增的(6)、实时定量PCR:片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其多态性即借助特异性结合DNA的荧光染料，实时动态检测PCR根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。扩增的DNA量的变化。 approved by head office, agencies at all levels shall not without the following: give-t institutions to bring proceedings. Nonhe difficulty of clearing. Personal credit business of late, agencies should be timely collection, if necessary, ask the righer transfers and other acts leading to loss or increase treduction in property value. Find warning signals, timely reporting or warning, develop and implement measures against custom3 四、基因诊断的临床应用:5、等位基因特异的寡核苷酸 (ASO)1、在感染性疾病检测中应用原理:目的:检测外源性基因的侵入已知基因突变部位和性质，合成基因特异的核苷酸探1、微生物针(20bp)，标记后与受检者DNA杂交诊断。(可与目标:PCR联用:PCR-ASO)2、病毒如:HIV(致艾滋病AIDS)1、合成两种探针:?已知突变位点的核苷酸序列(M)方3、寄生虫、?正常基因碱基序列(N)法2、杂交实验结果:4、不易体外培养的病原体(毒性大肠杆菌、麻风分枝:M+ N-受检者是突变基因的纯合子杆菌)M+ N+ 受检者是突变基因的杂合子5、实验室培养的病原体(克立氏体)M-N+ 受检者是不存在突变基因 M-N-受检者的缺陷基因可能是一种新的突变类型 6、单链构象多态性(SSCP)艾滋病与HIV病毒日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的艾滋病由HIV通过接触、血液、血制品及母婴传播感染所致。HIV特异地侵犯辅助性T细胞空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或(CD4)，引起人体细胞免疫严重缺陷，导致多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，顽固的机会性感染，恶性肿瘤和神经系统损空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺伤。凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙 HIV 感染后，95%感染者5个月可检出抗体烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构(也有3-4年仍不能检出抗体)。有必要进行象上有差异的分子分离开. PCR技术检测。 PCR-SSCP PCR-SSCP基本过程艾滋病与HIV病毒?PCR扩增靶DNA病毒特点:HIV属反转录病毒,,,即单链RNA反转录成双链DNA，进入宿主细胞染色体。?将特异的PCR扩增产物变性后快速复性; HIV病毒由两条单链RNA组成，9.7k / RNA，?将单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;主要基因结构和组成形成与其他逆转录病毒相同，但较之复杂，故称复杂反转录病毒?通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分检测技术:巢式-PCR、Southern、DNA序列分析析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照引物的设计:应在保守区(基因:pol, env, gag, tat)的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改 变，进而推断该DNA片段中有碱基突变. 7、基因芯片非典型性肺炎(SARS)(生物集成模片、DNA阵列、或寡核苷酸微芯片)由一种新型冠状病毒(SARS-CoV)引起，多种 途径传播，传染性强、高致死率的急性疾病。基本原理: 将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，诊断依靠:流行病学、临床表现、放射诊断、然后与标记的样品进行杂交，通过检测根据血清学(荧光免疫、ELISA)杂交分子和未杂交分子信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。PCR作为一种灵敏的早期病原学诊断必不可少(关键是引物的合成) 2、在遗传病检测中的应用基因芯片技术: •产前诊断检测妊娠8,12周的绒毛DNA或羊水细胞PCR诊断一系列遗传疾病 •镰刀状细胞贫血的诊断方法:,RFLP诊断Mst?酶切识别序列:CCTNAGG切割正常β链序列:CCTGAGG 不切割突变序列:CCTGTGG,ASO探针诊断 , agencies at all levels shall not without the following: giveapproved by head office-e, agencies should be timely collection, if necessary, ask the right institutions to bring proceedings. Nonnst customer transfers and other acts leading to loss or increase the difficulty of clearing. Personal credit business of latreduction in property value. Find warning signals, timely reporting or warning, develop and implement measures agai4 3、在肿瘤检测中的应用DNA指纹(图谱)分析: 针对可变串联重复序列(VNTR)原癌基因(VNTR是判断个体的遗传标志)生物正常细胞基因中编码关键性调控蛋白的 癌基因?、选择核心序列作探针，选在核心序列上无切割位点的限制性内切酶，酶解样品，Southern 抑癌基因blot得到DNA指纹图谱。一类抑制细胞增殖的基因，其失活可引起细?、针对VNTR侧翼保守区序列设计探针，用PCR胞转化。对该区扩增，电泳得到个体之间长度不同的条带图谱。(VNTR片段较长PCR不易扩增)。两类基因协同调控，使细胞生长处于平衡状态。 第二节基因治疗(gene therapuy)癌基因激活变化及检测: 1、基因扩增:即染色体某区段基因拷贝数增加，或癌基概念:因的扩增。将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因缺陷和异常基因引起的疾病，达到治疗目检测方法:Southern 杂交定量PCR的。导入的基因可以与缺陷基因对应、在体内表达具有特异功能的同源基因、也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。2、基因的过量表达:包括基因扩增基础上的过量表达及非概念的扩展:DNA水平的过量表达。凡是采用分子生物学方法原理，将某种遗传物质转移检测方法:Northern 杂交RT-PCR到患者细胞内，使其在体内发挥作用，达到治疗目的的方法，都可称为基因治疗。3、点突变:检测方法为各种基于PCR的方法。 抑癌基因的检测:Southern PCR基因治疗策略: 总原则:大片段的缺失、和点突变 ,,直接补替缺陷基因*两个等位抑癌基因突变才能引起肿瘤，需检 出两个等位抑癌基因。,,抑制非正常基因产物表达 ,,间接调节机体本身免疫系统的抗病能力。方法:RFLP结合PCR，进行缺失检测 ,,利用外源基因对病变细胞造成特异性杀伤点突变主要采用PCR 基因治疗的策免疫组化筛选提高检出率略: 1、基因矫正,,将致病基因的碱基进行纠正，而正常部分予以保留。肿瘤标志物:指特征性存在于恶性肿瘤或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质或宿主对肿瘤反应而产2、基因置换,,用正常基因通过体内基因同源重组，原位置换病变细生的物质。胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常 3、基因增补,,将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常(1)酶类肿瘤标志物(5)糖蛋白类抗原基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达(2)激素类标志物(6)血中癌基因蛋白产物补偿缺陷基因的功能或使原有功能得以加强。(3)胚胎抗原4、基因失活,,利用反义技术特异封闭基因表达，抑制有害基因(7)唾液酸和唾液酸酰基转移酶的表达。(4)特殊蛋白标志物(8)多胺 5、免疫调节,,将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗的目的。 6、调节性基因治疗:导入编码调控蛋白的基因，治疗法医学鉴定基因表答异常的疾病针对人类DNA 遗传差异进行的个体识别和亲子鉴定。根据可变串联重复序列(小卫星DNA)多态性7、化疗保护性基因治疗:导入单相或多相细胞毒性药高度的个体特异性物的抗性基因，使正常细胞耐受化疗药物的能力大大提高。DNA指纹分析(VNTR)常用技术:8、特异性细胞杀伤性基因治疗:利用DNA重组技术构建短串联重复序列(STR)遗传特征分析特异性杀伤靶细胞为目标的“奇异弹头”，“弹头”部分是分子重组的各种生物细胞毒素，它们以酶催化方式发挥PCR-扩增片段长度多态性(AmP-FLP)抑制蛋白合成作用，造成细胞杀伤。 9、生殖细胞基因治疗:生殖细胞或胚胎干细胞补偿性治疗PCR-mtDNA技术 approved by head office, agencies at all levels shall not without the following: give-t institutions to bring proceedings. Nonhe difficulty of clearing. Personal credit business of late, agencies should be timely collection, if necessary, ask the righer transfers and other acts leading to loss or increase treduction in property value. Find warning signals, timely reporting or warning, develop and implement measures against custom5 基因治疗基本程序;病毒介导的基因转移方法:1、逆转录病毒:正链RNA病毒将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经1、体外法适当选择系统，将重组的受体细胞回输患者(ex vivo):体内，以改善症状。(普遍采用) 直接将外源基因导入体内有关的组织器官,使其2、体内法进入相应的细胞并转录、表达而发挥治疗作用。(in vivo):选择目的基因选择基因载体选择靶细胞基本程序: 基因转移外源基因表达及检测回输体内 1、选择治疗的目的基因 逆转录病毒结构:治疗基因的来源: 基因组组成:1、野生型基因:(1)5’,帽子;3’,尾巴;-----单基因缺陷遗传病基因 -----反义核酸封闭活化的原癌基因(2)每个单链RNA含6个区:-----转入相关的抑癌基因，抑制肿瘤5’-LTR(长末端重复序列)+(组装所需的非编码序列)Ψgag(编码衣壳结构蛋白基因)pol(编码反转录酶基因)2、重组DNA和分子克隆技术，人工合成特异env(编码外壳蛋白基因)基因。3’-LTR 用于基因治疗的基因应满足以下条逆转录病毒生活周期:件:1、感染靶细胞(1)体内仅少量表达就可显著改善症状。2、利用自身编码的逆反转录酶，以RNA为模板合成DNA。 3、将病毒DNA转运至宿主细胞核(2)该基因的过量表达不会对机体造成危害、 4、病毒DNA整合到宿主染色体(3)在抗病毒和抗病原体的基因治疗中，所选5、以病毒DNA为模板转录RNA择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中6、在细胞中翻译Gag、Pol和Env蛋白起重要作用，并且该序列是特异的。7、形成衣壳，RNA单链和反转录酶一起包装进衣壳。 8、形成病毒颗粒并分泌到胞外。逆转录病毒逆转录病毒宿主细胞宿主细胞2、选择基因载体:RTRT理想的载体具有以下特征:cDNAcDNA 1、容易生产---商业化生产，广泛应用，易运输，易保存病毒RNA病毒RNA病毒RNA双链双链2、持续表达---一旦转入体内，应能在一定时间内持续表达基因产插入插入物，或能通过某种方法精细调节其表达。 基因组基因组3、弱免疫源---转入后不应引起免疫反应。DNADNART逆转录酶4、组织靶向性---定向输入某种细胞。 5、包装容量载体对转染基因的大小应没有限制。 6、复制、分裂和整合能力:特异性定位整合，或以游离基因形式逆转录病毒感染过程逆转录病毒感染过程存在于细胞核内。 7、能感染分裂期细胞和未分裂期细胞 构建逆转录病毒载体:基因载体: (1)构建重组野生性病非病毒载体(裸DNA、脂质体)毒:插入相关外源基因，改造成DNA载体优点:大量生产，毒性小，低免疫性分类:(包括插入选择性标缺点:效率低。记)，替代病毒的编码基因。病毒载体(2)制备辅助细胞(293T细胞)，为载体DNA提(反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒)供其丧失的功能。(3)载体DNA导入辅助细优点:多数病毒可感染特异细胞，不易降解，胞，产生病毒载体。RNA病毒能整合到宿主染色体，表达(4)用病毒载体感染细水平高等。 胞，外源基因在宿主细胞中表达。 , agencies at all levels shall not without the following: giveapproved by head office-e, agencies should be timely collection, if necessary, ask the right institutions to bring proceedings. Nonnst customer transfers and other acts leading to loss or increase the difficulty of clearing. Personal credit business of latreduction in property value. Find warning signals, timely reporting or warning, develop and implement measures agai6 逆转录病毒载体的缺陷:转染细胞后的筛选: 方法:1、只能转染处于增殖状态的细胞1、标记基因筛选法:2、所携带的外源基因不能太大。 2、基因缺陷型受体细胞的选择性3、感染依赖靶细胞表面受体的限制 3、基因共转染技术4、理论上不扩散其它细胞，但某些情况会造成目的基因或原位杂交野生型病毒爆发。标记基因作4、分子生物学方法:Southern杂交为探针。5、有致细胞癌变的可能。斑点杂交 6、逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩过程。 腺相关病毒(AVV )5、外源基因表达的检测:一种小的、非致病的、单链DNA病毒。是从属病毒，需方法:(目的基因和标记基因的表达)要其他基因才能复制。原位杂交、Nouthern杂交、RNA点杂交(检测mRNA的转录)结构:rep基因,,编码病毒的复制、整合功能所需蛋白 免疫组化染色(检测基因翻译出的蛋白质)cap基因,,编码病毒结构组分 ITRs序列,,反向末端重复，定义基因的开始和结束，制约DNA序列大小，包裹入衣壳。 细胞对AVV病毒的亲和力高，AVV载体适用范围广泛。 3、选择靶细胞6、回输体内 (禁止使用生殖细胞，只能用体细胞)将治疗性基因修饰的细胞通过不同方式回输选择原则:入体内，以发挥治疗效果。1、较坚固，耐受处理，易于由人体分离，便于输回体内。如:-淋巴细胞经静脉回输入血2、具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月或几年，-造血细胞经自体骨髓移植至病人的整个生命。3、易于受外源遗传物质的转化。-皮肤成纤维细胞经胶原包裹后埋入皮下组织4、在选用病毒载体时，目的基因具表达最好具有组织特异性的细胞骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞 常用细胞:组织专一性表达的调节片段:与目的基因一起重组入反转录病毒，用于基因靶1、骨髓细胞:最被重视和常用的靶细胞。向表达。优点:?易接受各种处理、?已积累丰富经验，?多数遗传疾病涉及骨髓细胞、?源自骨髓的细胞遍布全身。缺点:-骨髓干细胞含量少(占骨髓细胞0.1%)1、肝专一性表达:磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶启动子-治疗基因在核骨髓细胞表达时间短(几个月)。-只有部分干细胞有活性2、肌肉专一性表达:肌苷激酶的调控片段-造血干细胞分化可能导致基因失活。2、肝细胞:是许多遗传代谢缺陷的靶细胞。-有些遗传疾病与骨髓干细胞无关。3、乳腺专一性表达:β酪蛋白，乳清酸蛋白3、皮肤细胞:易于繁殖及转化。4、黑色素专一性表达: 酪氨酸和酪氨酸相关蛋白(TRP)4、淋巴细胞:易采集、分离，大量繁殖，连续5、胶质瘤专一性表达:鞘磷酸碱性蛋白基因上游片段多次输入 6、肺癌专一性表达:人表面活性蛋白A5、癌细胞:肿瘤治疗常用细胞。 4、基因的转移基因治疗的应用及展望 应用治疗:方法:显微注射法•遗传病(学友病、囊性纤维病、家族性高血压1、物理法:电穿孔法•恶性肿瘤基因枪技术•心血管疾病•感染性疾病(AIDS、类风湿等)磷酸钙沉淀法2、化学法:DEAE-葡萄糖法脂质体法 3、融合法 4、病毒感染法 approved by head office, agencies at all levels shall not without the following: give-t institutions to bring proceedings. Nonhe difficulty of clearing. Personal credit business of late, agencies should be timely collection, if necessary, ask the righer transfers and other acts leading to loss or increase treduction in property value. Find warning signals, timely reporting or warning, develop and implement measures against custom7 , agencies at all levels shall not without the following: giveapproved by head office-e, agencies should be timely collection, if necessary, ask the right institutions to bring proceedings. Nonnst customer transfers and other acts leading to loss or increase the difficulty of clearing. Personal credit business of latreduction in property value. Find warning signals, timely reporting or warning, develop and implement measures agai8