生物素测试剂盒操作流程

维生素B7（生物素）检测试剂盒实验操作 一、实验前准备工作 1、灭菌（在做实验前，至少提前两个小时以上灭菌） 实验器材名称 规格 数量 黄色吸头 20-200ul 200个 蓝色吸头 100-1000ul 200个 带塞可离心试管 50ml 至少是当次检测样品数量 离心管 1.5-2.0ml 100个 注射器   至少比当次检测样品数量多2个       如果有一次性无菌注射器则不需要灭菌注射器 没有枪头盒时用其他器皿装枪头一起灭菌（如烧杯，灭菌时放入枪头后用报纸把烧杯口封起来），同时带两把小镊子，做实验时取枪头用。 2、配制溶液 （1）准备10mlHCL溶液：1.0mol/l （2）配制氢氧化钠溶液：1mol/l a）称取0.4 g 氢氧化钠 b）用10 ml双蒸水或去离子水充分溶解 注：用带橡胶塞的玻璃瓶储存。 3、实验过程中需要的其他设备及器材： 无菌工作台 酶标仪(540nm或630nm) 37℃黑暗条件下的培养箱 95℃水浴锅（实验前需要提前加热到95℃） 振荡器 pH测量仪或pH试纸 双蒸水 0.2um无菌滤膜 酒精棉 二、样品处理 1、称取1g奶粉样品至一个50ml无菌试管中，加入40ml无菌水摇匀，用HCL或NaOH调整pH值到8.0 ＋/- 0.2，充分混匀； 2、在95℃水浴中提取30分钟，期间所有样品试管需每隔5分钟振荡一次，并一直保持试管塞紧闭 3、迅速冷却至室温（即把样品试管放进水里，保证试管塞紧闭） 从下面这一步开始需要在无菌工作台进行 4、分别取1ml样品用0.2um无菌滤膜过滤至1.5～2.0ml无菌试管中 5、根据样品中生物素含量用试剂盒中提供的无菌水进一步稀释样品，稀释后的样品即可用于检测。 样品稀释倍数计算如下： 例如：固体样品标注浓度为80ug/100g 用该浓度除以2 计算：    80 μg ÷ 0.24 μg  ＝333 → 结果为稀释倍数大约为300 → 1 ：300 稀释 稀释步骤： a) 1 ：9（100ul样品提取溶液 ＋ 900ul试剂盒中的无菌水）， b) 1 ：9（100ul a液 ＋ 900ul试剂盒中的无菌水）， c) 1 ：2（200ul b液＋ 400ul试剂盒中的无菌水） 注：每一步稀释都需要充分混匀后再做下一步稀释，提取稀释液需立即使用。 三、检测过程 1、配制标准品 装有无菌水的瓶子：推开蓝色帽，沿着玻璃边缘垂直向上拉开，丢弃。 标准品必须在试验之前新鲜制备。 －打开生物素标准品瓶，取出盖子。丢掉盖子和红色塞子 －加入x ml无菌水，至标准品瓶中。充分溶解标准品，即配成标准品浓缩液。 注：x详见质控报告和标准品包装标签，每一批次所加体积会略有不同，无菌水必须是取自试剂盒中提供的。 －取6个无菌管（1.5～2.0ml）并按照下列准备标准品溶液。 标准曲线* μg/100g(ml) 无菌水 μl   标准浓缩液 μl   总体积 μl 空白：0 900 ＋ 0 ＝ 900 标准品1：0.08 900 ＋ 100 ＝ 1000 标准品2：0.24 350 ＋ 150 ＝ 500 标准品3：0.40 250 ＋ 250 ＝ 500 标准品4：0.56 150 ＋ 350 ＝ 500 标准品5：0.72 50 ＋ 450 ＝ 500             注：配制每一个标准品，都是取标准浓缩液进行稀释。 2、制备生物素培养基 注：培养基必须在试验之前新鲜制备。 —打开瓶盖用镊子从干燥剂中取出培养基，丢掉干燥剂。 －加入10ml无菌水（必须取自试剂盒中）至生物素培养基中。 －盖好培养基瓶，充分摇匀。 －在95℃水浴中加热至少5分钟，期间振荡至少2次，保证瓶子封闭。 －迅速冷却至室温（低于30℃）。 －使用0.2μm无菌滤纸过滤培养基至15ml无菌离心管中。 3、检测过程 －取出当次实验需要数量的微孔板条，并固定在板上，未使用的微孔板条立即放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起重新封好，储存在2-8℃条件下。 －用移液枪取150μl生物素培养基至微孔中 －用移液枪取150μl标准品或样品至指定的微孔中 －用粘合箔盖住微孔条或微孔：用手或压舌板将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条。 注意：保证粘合箔和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分。 －在37℃黑暗条件下（可用孵育器）孵育44～48小时。 注：37℃孵育不能超过48小时。 以两次平行、两个样品为例，取两条微孔板条，每孔加样如下: 150ul生物素培养基+150ul无菌水 150ul生物素培养基+150ul无菌水 150ul生物素培养基+150ul标准品1 150ul生物素培养基+150ul标准品1 150ul生物素培养基+150ul标准品2 150ul生物素培养基+150ul标准品2 150ul生物素培养基+150ul标准品3 150ul生物素培养基+150ul标准品3 150ul生物素培养基+150ul标准品4 150ul生物素培养基+150ul标准品4 150ul生物素培养基+150ul标准品5 150ul生物素培养基+150ul标准品5 150ul生物素培养基+150ul样品1（稀释后） 150ul生物素培养基+150ul样品1（稀释后） 150ul生物素培养基+150ul样品2（稀释后） 150ul生物素培养基+150ul样品2（稀释后）     4、读取数据 －再次向下挤压粘合箔，将微孔板向上放置在桌面上，在桌面上来回振荡，使微生物溶解在培养基中 －从对角开始小心揭去粘合箔，从左边开始进行； －微孔液体表面有泡沫时可以用移液枪头去除 －用酶标仪630nm（或540nm）条件下读取浑浊度 四、结果计算 推荐在计算结果时使用专业计算软件。并使用4参数计算进行结果计算。 判断检测结果有效： －OD空白值 < OD标准1 －OD标准5  > 0.6 OD 从标准曲线上读取的浓度×稀释倍数 样品中生物素含量    ＝  ──────────────────── （μg/100ml）                  样品总量 g（ml） （μg/100g） 注：稀释倍数为样品处理过程中所计算的整数倍，不包括提取过程中的40倍，这个倍数已经在曲线中考虑进去。 例如： 样品重量：                1 g 样品提取稀释倍数：        1：40（不需要被考虑进去） 其它稀释倍数：            1：300（必须考虑） 从标准曲线中读取浓度值：  0.24 μg /100 g（ml） 0.24 ×300 / 1 = 128 μg / 100 g（ml） 五、实验注意事项 1、试剂盒应存放在2－8℃条件下。 2、微孔板操作时使用的必须是无菌样品提取液或稀释液，并且样品稀释时需要使用盒中提供的无菌水。 3、样品提取和稀释必须在无菌条件下进行。 4、检测培养基有可能刺激眼睛、皮肤和黏膜。 5、完成试验后须根据规章处理检测仪器（如使用高压灭菌锅）。