产粘嗜热链球菌的筛选及其胞外多糖的纯化与流变性质的研究（可编辑）

产粘嗜热链球菌的筛选及其胞外多糖的纯化与流变性质的研究（可编辑） 产粘嗜热链球菌的筛选及其胞外多糖的纯化与流变性 质的研究 江南大学 硕士学位论文 产粘嗜热链球菌的筛选及其胞外多糖的纯化与流变性质研究 姓名:齐沙沙 申请学位级别:硕士 专业:营养与食品卫生 指导教师:陈卫;艾连中;吴正钧 2011-07 摘 要 产粘嗜热链球菌的筛选及其胞外多糖的纯化与流变性质研究 学科、专业:预防医学、营养与食品卫生 入学时间:2008 年 9 月 1 日 硕士研究生姓名:齐沙沙 答辩时间:2011 年 3 月 11 日 指导教师:陈 卫 教授 授予学位时间:2011 年 4 月 摘 要 本文采用粘丝法初筛与酸乳发酵性能复筛相结合的从开菲尔粒发酵乳中筛选 到了一株具有良好产粘性能和复配发酵性能的菌株 ST-1。经形态学观察、生理生化特性 鉴定结合 16s rDNA 全序列测定，鉴定为嗜热链球菌。该菌与 Streptococcus thermophilus -9 有 100%同源性，命名为Streptococcus thermophilus ST-1。 LMD 该菌株单菌 ?发酵， 凝乳良好，粘度达 ( )，酸度为 ， 42 4.5h 907mPa??s 64r/min 82?T 感官评价较好，将其与 Lactobacillus bulgaricus LB40 复配发酵酸乳，1d 和 7d 后各项指 标都比较好，接近市售酸乳水平。对三种不同酸乳样品的质构、流变和感官三方面进行 比较得出，使用粘性菌株发酵的酸乳综合品质最好。 为收集多糖样品进行后续研究，从接种量、发酵温度、发酵时间三个因素对菌株胞 外多糖 (EPS )产量的影响进行分析，并通过响应面分析法得出最佳条件为:接种量 4% 、 发酵时间 14h、发酵温度42 ?，EPS 的产量为 346.51?1.05mg/L 。 粗多糖经 DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换柱分级纯化，由含 0,1.5/L NaCl 的 Tris-HCL 缓冲液线性梯度洗脱后得到两个组分 EPS- ?和 EPS- ?，选择含量高的组分 EPS- ?过Sepharose CL-6B 凝胶柱直至检验为单峰 EPS-A 。结合 HPLC 检验，确定 EPS-A 为均一多糖。 EPS-A 经紫外和红外后确定为不含蛋白质的多糖。HPLC 法检测推断出 EPS-A 分子量为 802804Da，由半乳糖和葡萄糖组成，峰面积之比约为 1:1.21。 通过对 EPS-A 溶液的流变行为研究，发现其在较高浓度时存在剪切变稀现象，低浓 度时无此现象;溶液的粘度随温度的升高而明显降低;溶液的粘度与 pH 的关系不大; 盐可以使得溶液粘度有所降低，其中一价盐的影响更为明显，且降低多少与浓度有关。 关键词:嗜热链球菌，筛选，粘性菌株，胞外多糖，纯化，流变 I Abstract Abstract This study screened ropy Streptococcus strain with viscosity and fermentation performance from kefir fermented milk by sticky silk-screening method and further confirmed by fermentation performance in milk. The full length sequence of 16s rDNA of strain ST-1 was found 100% homology with Streptococcus thermophilus LMD-9,and the strain was classified as Streptococcus thermophilus ST-1 based on morphology ， biochemical characteristics as well as the result of 16s rDNA analysis. The curd was well at 4.5 h,the viscosity arrived at 907 mPa??s 64r/min ,the acidity was organs was 82?T,and the evaluation of sense- relatively well when the monoxenie was fermented.at 45?.Campared with Lactobacillus bulgaricus LB40 to yogurt fermention, objective index and the score of the senses from 1d to 7d were good, which approached to the level of commercial yogurt.Test the texture,rheological,and sensory of different yogurt samples,the result displayed the yogurt femention use ropy stains have the best Integrated quality. The effacts of different inoculum concentration,fermentation time and fermentation temperature on EPS produced by Streptococcus thermophilus ST-1 was studied inorder to get enough EPS for further study.This experimental obtained the optimum conditions by RSM:inoculum concentration 4%,fermentation time 14h, fermentation temperature 42 ?.The EPS production is 346.51?1.05mg/L. Exopolysaccharides produced by strain ST-I in skim milk were purificatied by anion exchange chromatography on DEAE Sepharose Fast Flow column, two polysaccharide ? ? , components EPS- and EPS- were obtained by the elution of Tris-HCl buffer with 0 ? 1.5mol/L NaCl.Choose EPS- which had high contant continue to purify by Gel filtration chromatography of Sepharose CL-6B column until single peak EPS-A appear,then detected by HPLC to make sure it was homogeneous polysaccharides. EPS-A was identified as non-protein polysaccharide detected by ultraviolet and infrared,and it was made of galactose and glucose peak area ratio1:1.21 ,with the Molecular Weight 800000Da,from the result of HPLC. There were some conclusions from rheological behavior of EPS-A solution: shear-thinning phenomenon was find at high concentration, no such phenomenon of low concentrations; Solution’s viscosity decreased with the temperature increasing; pH had little effect on the viscosity of the solution;salt could make the solution’s viscosity decrease, especilly by monovalent salt, and it will be affected by concentration. Keywords: Streptococcus thermophilus,screening,ropy strain,expolysaccharides, purification, rheology II 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名: 日 期: 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定: 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名: 导师签名: 日 期: 1 引言 1 引言 1.1 酸奶简介 1.1.1 酸奶的定义 酸奶是一种半流体发酵制品，既保持了牛奶的营养成分又利于人体对牛 奶中 营养物质的消化吸收，加之其酸甜适中的口感，使其成为一种非常受欢迎的 大众 食品。联合国粮农组织、世界卫生组织及国际乳品联合会在 1977 年对酸奶进行了 定义，即:在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的共同作用下，使得添加(或不添加) (或脱脂乳粉)的乳(杀菌乳或浓缩乳)进行乳酸发酵而制得的凝乳状乳粉 制品， 终产品中需含有大量相应的活菌[1] 。标准条文中对定义另有补充:在生产过程中， 除了添加以上定义中必须的两种菌株外，也可以添加其它乳酸菌如双歧杆菌、嗜 酸奶杆菌等其它乳酸菌[2] 。 1.1.2 酸奶的分类及发展趋势 市售酸奶种类繁多，概括来讲主要分为以下五种[2] :按发酵方式可分为凝固型 和搅拌型酸奶，这其中也包括果味和原味酸奶;按生产原料可分为纯酸奶、 调味 酸奶和果料酸奶;按脂肪含量可分为高脂、全脂、低脂和脱脂酸奶;按健康特性 可分为普通酸奶和特殊酸奶，如双歧酸奶和益生菌酸奶;按加入糖的量可分为含 糖酸奶和无糖酸奶。 权威机构的调查分析表明，酸奶的保健价值远高于纯牛奶和豆奶。目前我国 酸奶的年人均消费量小于 0.5kg ，但是每年有将近 40% 的增长率，酸奶市场巨大。 随着饮食中热量摄入过多而导致肥胖等问题的产生，酸奶逐步向脱脂、低脂、无 糖、保健等方向发展[3-4] 。与此同时，生产和消费量均居世界之首的欧美地区酸奶 [5] 已朝向天然、有机、低脂低胆固醇、功能健康性等方向迈进 。 1.1.3 脱脂酸奶的主要质量问题 脱脂酸奶是由脂肪含量低于 0.8% 的原料乳发酵而成。可分为含糖脱脂酸奶和无糖 [6] 脱脂酸奶两大类。由于脂肪对酸奶的品质具有着重要的作用 ，因此对于脱脂酸奶而言， 存在着质地稀薄、粘度偏低、口感和风味欠佳、持水力较低的诸多问题，且在储存过程 中容易出现乳清析出，凝胶断裂等情况，严重的影响了酸奶的品质及销售[7] 。因此，为 了克服以上问题，生产者多采用添加增稠剂、稳定剂的方式来稳定酸奶品质。然而，酸 奶行业走在世界前列的欧洲多国早已明确禁止在酸奶中使用动物或者化学改性的植物 [8] 性添加剂 ，因此，从酸奶长久发展的利益考虑，必须努力寻找可以完全或者部分替代 脂肪的天然、安全的物质，以赋予脱脂酸奶良好的质地和感官。 1 1 引言 1.2 产粘菌株对酸奶品质的影响研究 1.2.1 改善酸奶的流变学特性 使得酸奶在发酵过程中呈现粘性的菌株称为产粘菌株。研究已经证明菌株产粘是由 [9] 于产生了某种性质胞外多糖 简称 EPS 的结果 。多糖的种类、分子量、亚结构单位、 链长度、回旋半径、刚度等因素都会影响到酸奶的流变学性质及粘度[10。Elisabeth J. -12] Fabera 等[13]研究结果表明，产高分子量多糖的菌株比产低分子量多糖的 菌株发酵所得的 酸奶粘度大，间接证明了酸奶粘度大小与多糖的产量不直接相关而是受到分子量高低的 影响。DJC van den berg 等[14]发现多糖的单糖键连接方式的不同对酸奶的影响也有差异， β-1,4 糖苷键比 β-1,3 糖苷键连接的单糖刚度要大，其形成的酸奶粘如 度则普遍较高。李 全阳等[15]在研究中也指出，使用粘性菌株发酵酸奶相对于非产粘菌株具有更高的表观粘 度以及更好的触变性。 1.2.2 改善酸奶的质构特性 使用粘性菌株对酸奶质构特性的影响主要反应在对凝固型酸奶的持水力、胶体脱水 收缩作用敏感性、硬度、内聚性、黏度等指标上[16] 。除此以外，近年来扫描电镜的广泛 应用也能直观清晰的观察到酸奶质地的差异，有的学者利用此方法直观的看 出粘性酸奶 相对非粘性酸奶来说凝胶连续性好，网孔小而密集，蛋白胶束较细腻[17] 。也有研究表明: 酸奶凝胶结构的变化主要是因为高分子多糖与蛋白质聚合体的不相容性引起的，发酵过 使所得凝块硬程中内源性多糖的产生一定程度上破坏了酪蛋白分子的交联，度降低[18] 。 Guzel-Seydim[19]等研究发现使用产粘菌株发酵的凝固型酸奶的各项质构指标明显较高 尤其是显著减少了乳清析出。 1.2.3 改善酸奶的感官特性 对发酵酸奶的感官评价中，酸奶的滋味气味、组织状态和色泽是三个最重要的因素。 添加产粘菌株，一般来说对色泽的影响不大，对滋气味的影响也主要是因为菌株的差异 而非多糖的差异引起，因此最显著的影响在组织状态方面。诸多研究表明使 用产粘菌株 发酵的酸奶多具有外观细腻、均匀，无乳清析出或乳清析出较少的现象，以赋予产品更 [20-21] 好的感官特性 。 1.3 产粘酸奶发酵剂菌株的筛选研究现状 1.3.1 常用酸奶发酵剂的种类及菌株筛选标准 根据发酵剂在酸奶中的使用情况，可将其分为三类:天然发酵剂、继代式发酵剂和 直投式发酵剂。发酵剂的菌种最为常用的为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。Brian[22]在 研究中曾提出:要根据菌株作为发酵剂的适应性进行分类和筛选，筛选的项目可根据实 际试验需要所制定。一般来说筛选指标有:成酸及后酸能力、产香能力、产粘能力、蛋 [23-26] 白分解能力和氨基酸生成能力、与复配菌株的相容性以及噬菌体不敏感性等 。而结 合本实验的实际情况，需要筛选一株产粘好，与复配菌株相容好的菌株。 2 1 引言 1.3.2 粘性酸奶发酵菌株的国内外研究状况 由于产粘菌株能够很好的改善酸奶的品质，一定程度上可作为脂肪的替代品应用于 脱脂或低脂酸奶中，减少了增稠剂的使用，具有很好的使用前景。在过去的几十年中， 国外学者已经先后从各地传统的发酵制品中分离出了多种产粘乳酸菌并用于改善酸奶 的质地研究，同时研究了乳酸菌产粘的基因特点并将其产物多糖分离纯化以进一步研究 其结构、功能等[26-28] 。我国在这一领域的研究也日益增多。学者筛菌选取的样品大都来 源于新疆、西藏、东北、青海、甘肃等西北部地区具有悠久自制发酵制品历史的地区， 其中以各种发酵乳、乳酒、藏灵菇、发酵泡菜等为主;筛选方法主要有菌落拉丝法、胞 -32] ，其中以胞外多糖产量为指标的方法外多糖产量法和分子生物学法[29 最多。 1.4 乳酸菌产胞外多糖的条件研究 1.4.1 菌种的影响 能够产生 EPS 的乳酸菌种类很多，乳品工业中应用最多的德氏保加利亚乳杆菌、干 酪乳杆菌、嗜酸奶杆菌、嗜热链球菌、乳酸奶球菌乳脂亚种等常见菌种都能产生。但研 究中发现，不同种属乳酸菌的 EPS 产量差异很大，即便同一种属的菌种产量差异也很大， 国内外报道的也有不同。部分乳酸菌EPS 产量情况见表 1。 表1 部分乳酸菌胞外多糖产量表 Tab.1 The production of EPS from part of the LAB 乳酸菌名称 EPS 产量 mg/L 发酵条 件及参考文献 氏乳杆菌乳保加利亚亚种 75 德 42?,16h[33] CNRZ397 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 170 42 ?,pH6,化学合成培养基[33] CNRZ416 植物乳杆菌 182.98 30?,24h[34] 乳酸乳球菌乳脂亚种 B-6 184 30?,72h[34] 瑞士乳杆菌 BCRC14030 530 37?,84h[35] 干酪乳杆菌 LC2W 160.55 32.5?,26h[36] 嗜热链球菌 BCRC14085 730 37?,32h[35] 嗜热链球菌 BCRC14085 930 37?,60h[35] 嗜热链球菌 1275 406 37 ?,24h[37] 嗜热链球菌 1275 1029 37?,pH5.5,添加 WPC[37] 1.4.2 底物的影响 碳源和氮源是对产糖条件最为重要的两种底物。向发酵培养基中添加不 同的底物或 者添加不同浓度的相同底物状态下，菌株 EPS 的产量 都会有差异。顾瑞霞[38] 的研究中 指出，在培养基中添加葡萄糖或乳糖能显著提高嗜热链球菌 EPS 产量;Yuksekdag 等[39] 通过向三种不同的乳酸菌发酵过程中分别添加葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖，发现葡萄糖 是最有效的碳源，以嗜热链球菌 W22 为例，添加葡萄糖的组 EPS 产量为 120mg/L，是 添加蔗糖组产量的四倍。另有学者同样利用这四种糖作为嗜热链球菌的碳源发酵时，却 3 1 引言 发现乳糖最有利于 EPS 的合成[40] 。艾连中[36]研究了四种常见蛋白胨作为氮源时对干酪 乳杆菌产糖量的影响，发现大豆蛋白胨效果最好;B.Zisu 等[37] 向脱脂乳培养基中添加了 0.5% 的浓缩乳清蛋白粉 WPC ，使得嗜热链球菌 1275 的多糖产量比不添 加的时候增加 了将近三倍。 1.4.3 发酵条件的影响 发酵条件对菌株产胞外多糖的影响因素主要包括接种量、发酵温度、发酵时间、pH 等[37,41] 。接种量直接影响到微生物的生长状态和产物的积累，出于菌株本身的差异，每 种菌能够生成最大 EPS 产量时最适接种量各异，所以每个菌株需要单独研究。发酵温度 和发酵时间对乳酸菌产 EPS 的影响多种多样，并无一致规律可循。报道指出，不同菌株 合成 EPS 的最佳温度低于、等于或者高于其最适生长温度的情况都有出现[38,42,43] ，其 本质原因与菌株的个体差异性有关。最佳发酵时间则大都集中在菌株生长的指数期或者 稳定期，这可能是由于这段时期磷酸异戊二烯得到较多积累，利于 EPS 的 合成;也有个 别情况产糖量最高点会出现在衰亡期的某个阶段[35] ，可能在这个时候菌体开始出现死 亡，细胞壁中的多糖成分释放到发酵液中所致。诸多研究表明，发酵液接近中性或者偏 EPS 的形成[44] 。但是在乳品生产的实际过程中，很酸性的条件下有利于 难实现pH 的控 制。 1.5 乳酸菌胞外多糖的理化性质研究 1.5.1 乳酸菌胞外多糖分子量及单糖组成 乳酸菌所产的 EPS 可分为同型多糖和异型多糖两大类。一般说来，同型多糖的分子 量比较大[45] 。目前文献中报道的乳酸菌分子量范围分布极为广泛，达3,26500kDa ，菌 株、培养基成分 主要是碳源、氮源含量的高低 和发酵时间都会对分子量的大小产生影 响[35,45] 。有的菌株在发酵后期多糖的分子量明显减小，这可能是因为产生了某种 EPS 降解酶，能将大分子量的多糖降解到 10000Da 以下，而胞内酶(endo-enzymes )和胞外 [46] exo-enzymes )能够将 EPS 降解成小分子聚合物，但仍然主要以胞内酶( 酶的作用为主 。 乳酸菌胞外多糖常含有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖三种，有的只含有其中的一种或两 种，有的则含有除此以外的单糖组分如甘露糖等[47] 。除了菌株的差异对单糖组成有影响 外，培养基的成分不但影响多糖分子量的高低也会引起多糖组分的改变。有研究表明， 德式乳杆菌保加利亚亚种 NCFB 2772 在以乳糖作为碳源的培养基中发酵，所产的 EPS 同时含有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖三种成分，而在以果糖为碳源的培养基中发酵时，其 EPS 的化学组成只含有半乳糖和葡萄糖，且 EPS 的产量也有所下降[48] 。目前研究者多 采用高效液相(HPLC )法、高效凝胶过滤色谱法(HPGFC )、高效离子色谱法 (HPAEC-PAD )、光散射法、粘度法等来分析多糖的分子量，用气相色谱法、液相色谱 法、阴离子色谱法等来分析单糖组成。 1.5.2 乳酸菌胞外多糖的流变性质研究 乳酸菌多糖作为增稠剂、脂肪替代品、或者其他工业用途，都与其自身的流变性质 4 1 引言 有关[49] 。不同菌株发酵产生的多糖具有不同的流变学行为，这是因为 EPS 种类繁多、 结构及化学组成各有差异、水溶性、酸碱相容性也不尽同。已报道的各种 EPS 溶液具有 假塑性、增稠性、稳定性、悬浮性和乳化性以及与其他增稠剂协效性等多种流变学行为 [50] 。流变性作为 EPS 溶液体系的一种宏观动力特性，会受到多种因素的影响。绝大多 象，但是由于数乳酸菌多糖溶液的粘度会随着剪切速率的增大呈现降低的现同时受到浓 度的影响，在低浓度区域会发生粘度不变或者略微上升的情况[51] 。此外，温度、pH 、 盐、糖等也会对 EPS 溶液的流变性行为产生影响[51] 。 1.6 立题意义及主要研究内容 1.6.1 立题背景及意义 酸奶是人们非常喜爱的发酵食品，随着我国人民生活水平的日益提高和人们对健康 饮食的追求，酸奶在中国的消费市场越来越大。目前，在市场占有主导地位的酸奶品牌 国内主要有伊利、蒙牛、光明和味全，此外还有部分地域性的酸奶品牌;国外品牌主要 有达能、卡夫、明治等。发酵剂是影响酸奶品质最重要的因素。而以上的企业生产所用 的直投式商品发酵剂大都来源于外企，如丹尼斯克或者汉森，自主研发的发酵剂非常少。 这必然在长远发展中存在一定的限制，也使得企业很难做出自己的特色。因此，有必要 不断进行优质酸奶发酵剂的筛选，以便拥有自主的知识产权。 本实验室人员前期研究中保留了一株发酵性能良好的保加利亚乳杆菌，但是该菌产 粘性非常差，单菌发酵乳外观品质不好。所以本研究旨从传统的发酵制品中筛选出一株 具有良好产粘性能且能与该菌复配良好的嗜热链球菌，以便将来通过对二者的进一步研 究，生产出拥有自主品牌的发酵性能良好的发酵剂。 再者，利用筛选得到的产粘菌株研究其对酸奶品质的影响状况，并希望将引起酸奶 粘性增大的物质即胞外多糖分离、制备并做进一步纯化，了解其部分理化性质，以尝试 从更深层次上探索产粘菌株对酸奶品质影响的原因，并且为今后对研究该多糖的结构、 生理功能以及对其进一步开发应用等打下基础。 1.6.2 主要研究内容 1、产粘嗜热链球菌的筛选及菌株鉴定 以天然发酵乳制品为菌株筛选来源，以发酵乳粘丝法和发酵乳品综合质量法相结合 进行初筛和复筛，对筛得菌株进行鉴定及保存，并绘制其生长曲线及产酸曲线。 2 、产粘菌株对酸奶品质的宏观影响研究 使用产粘菌株和非产粘菌株发酵酸奶，通过对不同类型酸奶的质构和流变指标的测 定及感官评定，探讨产粘菌株对酸奶品质的宏观影响;向非粘性酸奶中添加一定量增稠 剂，分析产粘菌株与增稠剂对酸奶品质的影响差异。 3、嗜热链球菌 ST-1 产胞外多糖的条件优化 研究接种量、时间、温度三个发酵条件对胞外多糖产量的影响，并通过响应面分析 法获得最佳产糖发酵条件。 5 1 引言 4 、胞外多糖的分离、制备及纯化研究，多糖纯化组分的分子量测定及单糖组成分 析。 5、纯化组分EPS-A 的流变性质研究 从浓度、温度、pH 、盐等因素来分析EPS-A 的流变学性质。 6 2 材料与方法 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 菌株来源 筛选样品:青海牧民家自制发酵乳一份(样品一);西藏藏灵菇发酵乳一份(样品 二);内蒙古开菲尔发酵乳中分离出的已知产胞外多糖的球菌 12 株(样品三)。 现有菌株:保加利亚乳杆菌 LB40 ，光明乳业技术中心保存;嗜热链球菌 ST-NV， 丹尼斯克有限公司提供。 2.1.2 培养基 M17 琼脂培养基、M17 液体培养基:用于球菌菌落计数，菌株的分离、纯化与活化; MRS 琼脂培养基、MRS 液体培养基:用于杆菌菌落计数与培养; 脱脂乳培养基(SM):12% w/v 的脱脂乳，115?灭菌 15 min，用于菌株传代及发 酵实验。 2.1.3 实验试剂 纯化琼脂粉、甘油、过氧化氢、结晶紫染液、番红染液、氢氧化钠、三氯乙酸、乙 醇、苯酚、浓硫酸 优级纯 、盐酸、NaCl 、NaOH 、三(羟甲基)氨基甲烷、葡萄糖， 以上购自国药集团上海化学试剂公司;白砂糖(食用级)，购自当地超市;脱脂乳粉， 新西兰乳品公司;增稠剂(变性淀粉 GRD350，果胶 STG-08)，上海爱普香精香料有 限公司。 2.1.4 主要仪器设备 Avanti J30I 高速冷冻离心机，Beckman Coulter 公司; PHS-25 型 PH 计，奥立龙公司; 型紫外分光光度计，BIO-AQUARIUS 公司;ZD-2 酸度计 上海雷磁仪CE7250 器厂;透 析袋 截留分子量 12000,14000 u ;高效液相色谱，美国 Waters 公司;NICOLET NEXUS 470 型红外光谱仪，Thermo Electron Corporation 公司;AR-G2 型旋转式流变仪，美国 TA 公司;TA.HD.plus 质构仪，美国 TA 公司;粘度计，美国 Brookfield 公司;均质机， 丹麦 RaNVIE 公司;Optilab rEX 示差折光仪，美国怀亚特技术公司。 2.2 实验方法 2.2.1 菌株的初筛 2.2.1.1 发酵乳中乳酸菌的分离、纯化及保存 -3 -4 -5 取供试三个发酵乳样品各 1mL，混匀后用无菌水梯度稀释。选取 10 、10 、10 、 -6 10 四个梯度的菌液各0.1 mL 分别涂布于 M17 琼脂培养基，37?恒温培养 24h,48h 。 观察培养皿上菌落形态，挑选出生长较好的单菌落在同种培养基上反复划线培养，镜检 直至菌株纯化。纯化的球菌菌株依次进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，将镜检结果为 7 2 材料与方法 阳性、过氧化氢酶实验显示为阴性的菌株初步确定为产乳酸的球菌，并接种 于 M17 液 体培养基中，培养 24h 后，在超净工作台中滴加 30% W/W 无菌甘油，放置在-85?超低 温冰箱中保存。 2.2.1.2 凝乳实验 保存的菌株经三代活化后，接种于 10mL 的脱脂乳液体培养基中，42 ?恒温培养， 每隔 0.5h 观察一次，分别记录菌株初始凝乳时间。凝乳时间判断:将培养管倾斜 45? ， 内容物不流动即为凝乳记录时间点。 2.2.1.3 发酵乳粘丝测定试验 保存的菌株经三代活化后，接种于 10mL 的脱脂乳液体培养基中，42 ?恒温培养至 4 ?冰箱 24h ，取出样品混匀，用棉签棒沾取倒入平皿中凝乳后迅速放置 的待测样品， 垂直上拉，旁边固定刻度尺用以测量拉丝的长度。每种菌落做三个平行，拉丝长度以 cm 计，结果为三次测量的算术平均值。 2.2.2 菌株鉴定 2.2.2.1 菌落菌体形态观察 菌株在 M17 琼脂平板上划线，37?培养 48 h 左右，待平皿表面菌落长好后观察菌 落形态;用接种环挑取适量新鲜单菌落于载玻片上进行涂片，革兰氏染色后进行镜检。 2.2.2.2 生理生化鉴定 根据细菌鉴定手册[52-54]，选取相应的指标进行试验、检测及比对。 2.2.2.3 16SrDNA 序列测定[55] 2.2.3 菌株生长曲线测定 将活化好的菌株按照 3%的接种量接种于200mL 的 SM 液体培养基中，37?恒温培 养 24h ，期间每隔一定时间取样，测定发酵液中的活菌数、pH 值和酸度。pH 值用 pH 计测定，酸度采用酸碱滴定法(具体见方法 2.2.5 )测定，活菌计数采用平板(M17 琼 脂培养基)计数法。 2.2.4 酸奶样品的制作 2.2.4.1 酸奶制作工艺流程 :本文中酸奶制作所采用的工艺流程如图 1 所示。 8 2 材料与方法 酸奶制作工艺流程图 脱脂乳 12%(m/v) 加入7% m/v 白砂糖、 搅 拌 添加剂(根据要求添 加 或不添加) 加热到65? 均 质 杀菌(95?，5min) 冷却至43?， 接种(根据不同比例 添加，混匀) 分 装 发酵(42?) 发酵(42?) 75-80?T 取出 75-80?T取出 搅拌、分装 4?后熟24h 4?后熟24h 成品(凝固型酸奶) 成品(搅拌 型酸奶) 图1 酸奶制作工艺流程图 Fig.1 production flow chart of Yogurt 2.2.4.2 不同酸奶的构成 制作三种不同的酸奶样品，分别为粘性酸奶样品 Ya ;非粘性酸奶样品Yb ;添加与 Ya 中胞外多糖含量相当的增稠剂的酸奶样品 Yc (Ya 酸奶样品发酵至酸度 75?T,80?T 取出冰箱静置后熟 24h 后，测定胞外多糖含量，测定方法见 2.2.8 )具体样品编号及相应 发酵剂组成见表 2 。. 表2 酸奶样品编号及发酵剂组成 Tab.2 The number of yogurt samples and compose of starter 酸奶样品号 发酵剂组成 及含量 Ya ST-1+LB (1.5%，1.5%) Yb ST-NV+LB (1.5%，1.5%) Yc 增稠剂+ST-NV+LB (1.5%，1.5%) 9 2 材料与方法 2.2.5 酸度的测定 后熟 24h 的酸奶样品采用酸碱滴定法测定[17] 。 2.2.6 粘度的测定 将后熟 24h 后的发酵乳样品从冰箱中取出混匀，倒入粘度仪测试筒中。测试筒放置 于冰水混合物中调节温度，使测定温度保持在 4 ?左右。选用 2 号转子， 64r/min 条件下 测定 3min 左右，等待示数稳定后读取结果。每个样品做三个平行，结果取三次测定的 算术平均值。 2.2.7 酸奶样品的质构分析 2.2.7.1 质构仪分析 取后熟 24h 的Ya 、Yb 、Yc 三个酸奶样品，采用 TA.HD.plus 质构仪进行指标检测。 选用 P25 探头(高 3.5cm，直径2.5cm 的不锈钢圆筒)，测试条件为:穿入速度2mm/s ， 测试速度 2mm/s ，上升速度2mm/s ，测试深度:20mm 。每个样品做三个平行。 2.2.7.2 持水力测定 WHC [17] 酸奶持水力的计算公式为: 剩余沉淀物重量(g ) WHC% ×100% 酸奶样品总重量(g ) [56] 2.2.7.3 酸奶对胶体脱水收缩作用敏感性(STS)的测定 结合参考文献中乳清析出量的测定方法，根据以下公式计算酸奶胶体的脱水收缩作 用敏感性，每个样品设置两个对照，结果为三次计算的平均值。 乳清析出量(g ) STS% ×100% 酸奶样品总重量(g ) 2.2.8 酸奶样品的流变性质测定 待测酸奶混合均匀，取适量样品置于样品台，采用AR-G2型流变仪:直径40mm 的 平行板夹具，板间距1 mm。板间距固定后，将多余样品刮掉，罩上保护罩以防止测定 过程中水分的蒸发。根据各样品要求设置相应参数进行检测。 2.2.9 感官评定[57] 将各种酸奶样品分别装入一次性品尝杯中，约 25mL 并编号。请 9 名评定者进行 样品的品评。其中男女各半，包括食品行业的博士，硕士，本科生及普通 消费者。对 不同样品的风味、组织状态、色泽用 5 分制进行评分。指标所占的比重标准见参考文 献，具体指标描述及分值分布为: 风味(包括滋味和气味)的描述及分值 优质酸奶(5 分):酸奶酸甜适中，有发酵乳特有的香气，且香气浓郁。. 良质酸奶(4 分):稍微偏酸或者偏甜，有发酵乳特有的香气，香气一般。 次质酸奶(3 分):明显偏甜或者偏酸，无发酵乳特有香气或有异味。 组织状态的描述及分值 10 2 材料与方法 优质酸奶(5 分):无气泡，凝乳均匀细腻，外表光滑，无乳清析出或少量 乳清析出。 (4 分):无气泡，凝乳比较均匀，外表略有粗糙感，有乳清析出。 良质酸奶 次质酸奶(3 分):有气泡，凝乳粗糙，大量乳清析出或分层状。 色泽的描述及分值 优质酸奶(5 分):色泽均一，呈乳白色或略微一点乳黄色。 良质酸奶(4 分):色泽较均一，呈微黄色或者略带灰暗浅黄色。 次质酸奶(3 分):色泽不均，颜色偏暗。 低于 3 分的为感观评价人员主观不可接受的指标。 2.2.10 胞外多糖的提取流程 发酵乳 10mL?沸水浴 10min?冷却离心 (20min ，10000g，4 ?)?上清液加入 80% (w/v )的三氯乙酸至终浓度4% (w/v )?4 ?冰箱静置过夜?离心(20min ，12000g， 4 ?)?上清液添加 95% (v/v )乙醇至终浓度75% (v/v )?4 ?静 ?离心(20min ， 置 22h 15000g，4 ?)?取沉淀用去离子水溶解?透析?定容?检测。每个样品做两个平行。 制备流程与提取类似，不同处为:样品为全部发酵乳进行沸水浴，经过以上流程 获得透析液后进行浓缩、冷冻干燥得粗多糖。 2.2.11 胞外多糖的测定[36] 以葡萄糖为标准，490nm 下测定吸光度制作标准曲线，如图 2 。 1.0 0.8 0.6 值 D O 0.4 0.2 0.0 0 50 100 150 200 250 300 多糖浓度(mg/L) 图2 多糖含量标准曲线 Fig.2 The standard curve of polysaccharide 2 根据标准曲线可得回归方程为:y 0.0031x+0.029 ，R 0.9935 2.2.12 发酵条件对胞外多糖产量的影响 2.2.12.1 接种量对胞外多糖产量的影响 将活化好的菌株设定 1%,6%六个接种量分别接入 SM 液体培养基 中，37?恒温 培养 24h ，测定体系中胞外多糖的含量。 11 2 材料与方法 2.2.12.2 发酵时间对胞外多糖产量的影响 将活化好的菌株以 4% 的接种量接入 SM 液体培养基中，37?恒温培养 36h，每隔一 定时间测定体系中胞外多糖的含量。 2.2.12.3 发酵温度对胞外多糖产量的影响 将活化好的菌株以 4% 的接种量分别接入 SM 液体培养基中，设置 30?、34?、37?、 42 ?、45 ?五个不同温度下培养 12h，测定体系中胞外多糖的含量。 2.2.12.4 响应面法优化发酵条件提高 EPS 产量 本实验选取接种量，发酵时间，发酵温度作为考察因素，以 EPS 的产量为响应值， 根据 Box-Behnken 的中心组合实验设计原理，采用响应面法优化EPS 的发酵条件，实验 因素水平表见表 3 。 表3 响应面分析因素水平表 Tab.3 Factors and levels of Response surface analysis 代 码 水 平 因 素 原始值 编码值 -1 0 1 接种量(% ) X1 x1 3 4 5 发酵时间(h ) X2 x2 8 12 16 发酵温度(?) X3 x3 39 42 45 胞外多糖的制备流程 2.2.13 发酵乳?沸水浴搅拌 20min?冷却离心(20min ，9200g，4 ?)?上 清液浓缩至原 体积的 1/2?加入 80% (w/v )的三氯乙酸?4 ?冰箱静置过夜?离心 (20min ，9600g，4 ?) ?上清液添加 95% (v/v )乙醇?4 ?静置 22h?离心(20min ，10000g， 4 ?)?95% (v/v ) 乙醇洗涤沉淀?离心(20min ，10000g，4 ?)?沉淀用去离子水溶解?透 析?悬蒸浓缩 ?冷冻干燥?粗多糖 2.2.14 多糖的纯化研究 2.2.14.1. DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换柱纯化 取冷冻干燥所得的粗多糖样品 37mg，溶解于 10mL Tris-HCL 缓冲液(0.05mol/L， ph7.60 )，上DEAE Sepharose Fast Flow 柱(D4.6×30cm )层析。用0,1.5mol/L NaCl 的 Tris-HCL 缓冲液洗脱，洗脱速度为:3mL/min,每 6mL 收集一管。蛋白含量由核酸蛋白 检测仪在紫外 A280nm 条件下在线检测;多糖含量采用苯酚-硫酸法在紫外 A490nm 条 件下逐管检测。根据检测结果，合并单一组分，去离子水透析，冷冻干燥得到粗分组分。 2.2.14.2 Sepharose CL-6B 凝胶柱纯化 离子交换柱分离得到的组分 EPS- ?，称量、复溶、离心、上样。上样量 10mg，溶 解于 1.5mL 含 0.1mol/L NaCl 的Tris-HCL 缓冲液(0.05mol/L，ph7.60 )中，上Sepharose CL-6B 凝胶柱(D1.6×100cm )层析，用同种缓冲液进行洗脱。洗脱速度为:6mL/20min， 每 6mL 收集一管。根据检测结果，合并单一组分去离子水透析，冷冻干燥。蛋白含量 12 2 材料与方法 及多糖含量的检测同方法 2.2.14.2 。 2.2.15 HPLC 法测定EPS-A 纯度及分子量 仪器:美国 Waters HPLC 系统组件:Waters 717 ;600E;2414 和 empower pro 工作 站 。色谱柱:TSK-GEL G4000PWXL 与 TSK-GEL G3000PWXL 串联，规格均为 7.8mm×300mm TOSOH，日本 。色谱条件:柱温:35?C ;流动相:0.3 mol/L NaNO3 和 0.1 mol/L NaH PO ;流速:0.5mL/min ;2414 示差折光检测器。 2 4 2.2.16 高效阴离子色谱法测定EPS-A 单糖组成 2.2.16.1 样品预处理流程 2mg 样品?水解(2mol/L TFA ，110 ,3h ? )?减压蒸干(,40 ?)?3mL 甲醇蒸干 ?重复操作 4~5 次?样品?溶解(超纯水)?定容(50mL )?稀释 4 倍?上样 2.2.16.2 检测条件 戴安 Dionex ICS2500 系统:GS50 四元梯度泵、ED50A 电化学检测器(金电极)、 C30 柱温箱(30?);Chromeleon 6.5 色谱工作站;CarboPac PA20 阴离L 子交换分析柱 150 mm×3 mm i.d. ;进样量25μL ;淋洗程序:2mmol 的氢氧化钠淋洗液，0.45ml/min 的流 速，30min 。 2.2.17 多糖的紫外光谱分析 用蒸馏水配制 0.1,0.2mg/mL 的 EPS-A 的溶液，充分溶解后用 0.22uL 滤膜过滤， 在 190,400nm 波长范围内进行紫外全波长扫描。 2.2.18 多糖的红外光谱分析 采用衰减全反射(ATR-Ge )法制样，测试条件为:分辨率:4cm-1 ，扫描次数:64 次。 2.2.19 EPS-A 溶液流变性质研究 采用 AR-G2 型旋转式流变仪对多糖 EPS-A 进行流变性质研究。测定条件为:直径 40mm 的平行板夹具，板间距 1 mm。为防止溶剂挥发对结果造成影响， 测定期间加盖 溶剂保护罩。 2.2.19.1 浓度对 EPS-A 溶液粘度的影响 用蒸馏水配置质量浓度为 8%的多糖溶液，静置过夜使其充分溶解，然后梯度稀释 到 4% ，2% ，1%，0.5% 四个浓度。测定在剪切速率 1/s,1000/s 连续变化的过程中，以 上四个浓度在 25 ?条件下的表观粘度。 2.2.19.2 温度对 EPS-A 溶液粘度的影响 配置质量浓度为 1%的 EPS-A 溶液，静置过夜使其充分溶解。以 2 ?/min 的速率升 温，在恒速 50 1/s 的条件下，测定0,80?连续升温过程中 EPS-A 溶液粘度的变化。 对 EPS-A 溶液粘度的影响 2.2.19.3 pH 用 pH 值分别为 3、5、7、9 的四个范围配置质量浓度 1%的EPS-A 溶 液，静置过夜 13 2 材料与方法 使其充分溶解。测定在剪切速率 1/s,1000/s 连续变化的过程中，测定 25 ?条件下，溶 液表观粘度的变化。 2.2.19.4 盐浓度对 EPS-A 溶液粘度的影响 分别考察在剪切速率 1/s,1000/s 连续变化的过程中，25 ?条件下质量浓度 2% 的 EPS-A 在一价盐(NaCl )和二价盐(CaCl2 )溶液中表观粘度的变化。在向EPS-A 溶液 中加入盐的时候，需要在40 ?水浴中不断搅拌，使其能够溶解充分。 2.2.20 数据处理及分析 酸奶实验中所涉及的实验数据，均采用 SAS 软件 SAS Institute Inc, Cary, USA 在 P 0.05 水平进行显著性分析。 14 3 结果与讨论 3 结果与讨论 3.1 菌株的筛选与鉴定 3.1.1 菌株的初步分离 样品一初步分离获得产乳酸的球菌 15 株，标记为“QH-”系列;样品二初步分离获得 产乳酸的球菌 25 株，标记为“XZ-”系列;样品三检测获得产乳酸的球菌 6 株，标记为“S-” 系列。样品的初步分离总共获得 46 株疑似目标菌株，做进一步筛选。 3.1.2 粘丝法为指标初筛结果 [31,32] 目前许多研究采用菌落拉丝法或者粘液状菌落来初步筛选产粘菌株 。但是前者 因培养时间、培养基等条件的不同结果差异比较大。在筛选过程中发现，有些菌株在平 板培养 12h 以内菌落有明显拉丝性，但是超过一定时间，拉丝性就会消失;同一菌株在 但是在 M17 培养基上同等条脱脂乳琼脂培养基上一定时间内呈现拉丝性， 件下却不表 现此性质。所以菌落拉丝法对于本实验具有一定的筛选局限性。P.Ruas-Madiedo 的研究 也表明平板表观呈粘液状的菌株不一定是粘性菌株[25]，因此，在初筛时选用发酵乳初始 凝乳后，后熟样品的粘丝作为指标的“粘丝法”具有条件限制少、更准确、更接近实际生 产的优点。在 42?C 培养条件下，菌株所得发酵乳粘丝长度及菌株凝乳状况见表 4 。 表4 粘丝长度为主要指标初筛结果 Tab.4 screening results via Length of sticky silk as the main indicator 42 ?凝乳时 粘丝 42 ?凝乳时 粘丝 菌株 菌株 间 长度 间 长度 编号 编号 (h ) (cm ) (h ) cm QH-1 11 0 QH-14 22 8.5?0.5 QH-2 24 5.2?1.0 QH-15 6 0 QH-3 10.5 17.2?0.5 XZ-16 ― ND QH-4 ― ND XZ-17 ― ND QH-5 ― ND XZ-18 ― ND QH-6 3.5 20.5?2.1 XZ-19 10 0 QH-7 21 7.3?1.5 XZ-20 18 0 QH-8 16 3.9?1.5 XZ-21 ― ND QH-9 12 0 XZ-22 4 0 QH-10 12 0 XZ-23 ― ND QH-11 5 15?1.0 XZ-24 ― ND QH-12 ― ND XZ-25 ― ND QH-13 ― ND XZ-26 7.5 13.1?1.0 15 3 结果与讨论 表4 粘丝长度为主要指标初筛结果 Tab.4 screening results via Length of sticky silk as the main indicator 42 ?凝乳时 粘丝 42 ?凝乳时 粘丝 菌株 菌株 间 长度 间 长度 编号 编号 (h ) (cm ) (h ) cm XZ-27 22.5 15.7?0.4 XZ-37 ― ND XZ-28 ― ND XZ-38 9 5.4?1.2 XZ-29 10 0 XZ-39 9 5.9?0.5 XZ-30 ― ND XZ-40 9 4.1?0.5 XZ-31 ― ND S-41 4.5 25.8?0.7 XZ-32 ― ND S-42 5.5 16.6?1.0 XZ-33 ― ND S-43 8.5 0 XZ-34 8 11.2?0.9 S-44 ― ND XZ-35 15.5 9.2?2.4 S-45 ― ND XZ-36 ― ND S-46 ― ND 注:―表示 24h 内未凝乳;ND 表示未进行测定 根据表 4 的结果，选取凝乳时间相对较短，粘丝长度?5cm 的菌株 进行试管接种传 代，传代次数 10 代。在传代过程中，继续以这两个指标为依据，淘汰发生 退化的菌株， 最终得到遗传性状稳定的、凝乳较快、产粘较好的菌株共 5 株，编号分别 为:QH-6、 QH-11、XZ-34 、S-41、S-42。 3.1.3 菌株的复筛结果 用初筛得到的 5 株菌制作单菌发酵乳，对每个样品进行相关指标的分 析测定，测定 结果见表 5 。 表5 发酵乳各项指标测定结果 Tab.5 determination results of the fermented milk indicators 菌株号 粘度 mPa??s 酸度 ?T 质地 气味 QH-6 784?7b 135.2 细腻 香气中等 QH-11 427.3?14.2e 97.5 较细腻 香气中等 XZ-34 628.7?8.3c 85 细腻 香气中等 S-41 907.7?15.3a 82.1 细腻 香气浓郁 S-42 550?19.3d 109 细腻 香气中等 注:脚标中小写字母不相同的代表差异性显著(P ,0.05 ) 表 5 各项数据和结果显示，五株产粘菌株生产的发酵乳质地和风味都比较好，其中 S-41 在风味方面更具有优势。粘度数据表明，粘度值与拉丝的长短不具有严格的线性关 16 3 结果与讨论 系，这与拉丝方法作为一种非严格定量法本身的误差性有关。但还是可以基本上体现出 拉丝较长的菌株发酵乳粘度值较高有一定的关联性，五株菌发酵乳后熟后粘度值有显著 QH-6 和 S-42 后酸现象比较严重，不适于酸奶的实际应用，性差异。菌株 故决定舍弃。 最终保留 S-41，XZ-34 ，QH-11 三株产粘菌进行菌株鉴定。 3.1.4 菌株的生理生化特性 菌株的生化特性鉴定结果见表 6，其中糖发酵试验中选取的糖为比较有 代表性几类， 如:单糖、二糖、三糖及糖醇等。 表6 菌株的生理生化特性结果 Tab.6 physiological and biochemical results of strains 菌株编号 菌株编号 检测指标 糖发酵检测指标 S-41 QH-11 XZ-34 S-41 QH-11 XZ-34 硝酸盐还原试验 - - - 葡萄糖 + + + 产 H S 试验 - - - 蔗糖 + + - 2 运动性试验 - - - 半乳糖 + + + 1%美兰牛乳试验 + + + 阿拉伯糖 - - - 葡萄糖产气 - - - 麦芽糖 - - - 10?生长试验 - - + 乳糖 + + + 45 ?生长试验 + + - 海藻糖 - - + pH9.2 生长试验 - - - 果糖 +