【doc】自制抗原片检测抗角质蛋白抗体的结果分析及价值

【doc】自制抗原片检测抗角质蛋白抗体的结果及价值 自制抗原片检测抗角质蛋白抗体的结果分 析及价值 河北医药2003年6月第25卷第6期HebeiMedicalJournal,Jun200— 3,Vol2— 5,No.6 自制抗原片检测抗角质蛋白抗体的结果 分析及价值 郭惠芳冯亚丽孙熠峰刘凤珍 【摘要】目的探讨自制抗原片检测抗角质蛋白抗体(AKA)价值.方法分别以自制Waster大鼠 食管抗原片和德国欧蒙公司抗原片为底物,用间接免疫荧光法检测AKA,并比较Even氏蓝复染与不采 用Even氏蓝复染对结果的影响.结果两种抗原片在阳性率和非特异性荧光出现率方面均无统计学 差异(P>0.05),Even氏蓝复染与否也无统计学差异(P>0.05);类风湿性关节炎(RA)组与非RA组 AKA阳性率差异非常显着(P<0.01);AKA对RA的诊断有较高的敏感性和特异性.结论自制Waster 大鼠食管抗原片,经济实用,适合临床应用;Even氏蓝复染与否对结果无影响;AKA对RA早期诊断具有 重要价值. 【关键词】抗角质蛋白抗体;关节炎;类风湿;诊断 C~micalvalueofdI吐ec血唱antlkeratinantibodiesbyself-madecryostatsec60璐GUO助咖,FENGYali, SUN慨,a1.SecondHospitalofHeibeiMedicalUnitersity,Hebei,跚如删050000 【Abstract】ObjectiveTobuildupadetectionmethodofantikeratinantibodies(AKA)forclinicalapplica — tion.MethodsAKAwasdetectedbyindirectimmunofluoreseenee(IW)intwokindsof$tr~u mcx)rneumofsix-week- oldW'rstarratesophagus:onewasmadebyourselves.anotherobtainedfromGermenEuroim munCom.Results(1) 娃ewasnosignificantdifferenceinpo~tiverateofsdf-madesections,aso饼np ,IredwitIlEuroimmunslides(P> 0.05),andnorwasineountemtaining(P>0.05).(2)Statisticaldifferencewasfoundbetwee nRAgroupandnon- RAgroup(P<0.O1).,I1lesensitivityandspecificityofAKAwerequitehigh.0叩cIIlsi? (1)Self-madefrozen se傩fordetectingAKAshouldbeusednlorewidelybym7technique.(2)n坝?isnoin? uenceontheresultwheth— erEven'sblueeotmtemtainingornot.(3)AKAhasaimportantvulueforearlydiagnosis. 【l喇,rds】antikerafinab0dies;arthritis;rheumatoid;diagnosis 类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是常见的风湿性疾 病,早期RA症状隐匿多变,且病情发展快,致残率高,能否早期 诊断治疗与预后密切相关,抗角质蛋白抗体(AKA)检测是RA 早期诊断的重要途径之一,但由于抗原制备,保存,阳性结果判 断不一致,使临床应用受到限制.本文通过自制抗原切片 为底物,检测患者血清中的AKA,进一步了解该抗体在早期RA 诊断中的价值,希望能找到适于临床推广的AKA检测手段. 1资料与方法 1.1病例选择所有病例均为2001年2—8月河北医科大学 第二医院免疫风湿科门诊及住院患者共120例,分为如下三组: (1)RA组:患者6o例,均符合1987年ACR的RA的诊断标准…; (2)疾病对照组:30例,包括骨性关节炎6例,系统性红斑狼疮9 例,皮肌炎4例,系统性硬化症3例,强直性脊柱炎7例,成人 Still病1例,每个病例均符合各自美国风湿病学会诊断标准; (3)健康志愿组:30例.三组在年龄,性别差异无显着性.但重 叠综合征,合并各种急慢性感染和具有严重脏器功能不全者不 列入本研究范围. 1.2标本采集所有病例均在实验前采集静脉血3ml;所有标 本均于一70?低温保存,一次冻融后测定. 1.3实验方法(1)自制AKA抗原片:取6周龄雄性Wistar大 作者单位:05OOOO河北医科大学第二医院免疫风湿科 鼠(由河北医科大学动物中心提供)食管的中1/3,不加变性剂 固定,立即一70?冰冻储存备用.实验前将食管横切为4厚的冰冻切片,置于盛有S干燥剂的密闭容器内37oC1h, 干燥后4oC过夜,一30?储存备用.(2)AJ的检测:分别以自 制抗原片和德国欧蒙公司的AKA试剂盒中的抗原片为底物,荧 光抗体均为欧蒙公司提供的异硫氰荧光素(FTT?)标记的羊抗人 I抗体,以间接免疫荧光法检测四组血清中的IgC.-Ar~,并对 比采用Even氏蓝复染与不采用Even氏蓝复染对结果的影响. (3)结果判断标准:根据Wistar大鼠食管组织学结构特点,以食 管角质层显示线状或板层状的强荧光,而棘细胞层无或显示弱 荧光为RA特异性荧光模式;若角质层,棘细胞层显示弥漫性荧 光或角质层显示点线,点片状非典型荧光则重复实验,若仍显 示此类荧光,则视为RA非特异性荧光模式.抗原片出现非特 异荧光和无荧光均视为阴性. 1.4统计学处理方法应用SAS(6.12)软件包进行分析,组间 率的比较用检验. 2结果 2.1两种抗原片AKA的结果RA组阳性率分别均为25.O% (3o,120)和27.5%(33/120),非特异性荧光出现率分别为17.5% (21,120)和15.0%(18n2o);疾病对照组和健康对照组阳性率和 非特异性荧光出现率均为3.3%和0.经Y检验两种抗原片的 阳性率和非特异性荧光出现率差异无显着性(P>0.05);而 河北医药2003年6月第25卷第6期HebeiMedicalJournal,jun2003,Vol25,No.6 RA组阳性率明显高于疾病对照组和健康对照组(P<0.05). 2.2Even氏蓝复染前后结果自制抗原片复染前后阳性率分 别为24.1%(29/120)和25.0%(30/120),非特异性荧光出现率分 别为15.8%(191120)和13.3%(16/120);欧蒙抗原片复染前后阳 性率分别为25.8%(31/120)和27.5%(331120),非特异性荧光出 现率分别为16.7%(20/120)和15.0%(18/120);复染前后二者阳 性率和非特异性荧光出现率经x检验差异均无显着性(P> 0.05). 2.3三组患者AKA检测结果AKA的阳性率分别为50.0%, 6.6%,3.3%,RA组阳性率明显高于疾病对照组和健康对照组, 差异非常显着(P<0.O1);AKA的敏感性和特异性分别为 50.0%和95.0%. 3讨论 自1979年Young等对6周龄雄性Wistar大鼠食管切片为 底物,用间接免疫荧光法检测AKA,陆续有许多学者做了诸多 研究,但因其抗原制备和保存方法不同,阳性结果判断标准不 一 致,使该抗体的敏感性和特异性差异较大. 本实验在取材后,不使用任何变性固定剂立即将食管冰 冻,超低温保存,实验前切片,抗原损失较少.自制抗原片和与 商品化抗原片在特异性荧光和非特异性荧光阳性率方面均无 差异,且取材方便,价格低廉,值得临床应用.但欧盟试剂盒标 准化程度极高,仍应作为首选. 在操作过程中应注意几点:(1)判断结果时,应将形态学特 征和荧光的颜色,强度二者结合起来,以角质层出现线状或板 层状强荧光,而棘细胞层无荧光或显示弱荧光为阳性,这样可 以减少非特异性荧光的干扰,减少假阳性率.(2)纯度较低的 荧光抗体,常掺杂白蛋白及带有阴性电荷的蛋白成份,易与标 本发生非特异性吸附,产生非特异性荧光】,故应选用高纯度 407 的FTIE标记羊抗入荧光抗体为二抗.(3)Even氏蓝复染可以掩 盖非特异性荧光,但应调整好复染液浓度,我们认为以磷酸缓 冲液呈现淡天蓝色,复染时间小于lmin为宜;此时角质层,棘 细胞层,基底层结构清晰,浓度过高可掩盖特异性荧光,浓度过 低则不能掩盖非特异性荧光.但复染与否在统计学上差异无 显着性. 本研究表明,RA组AKA阳性率明显高于疾病对照组和健 康对照组,对RA诊断的敏感性50.0%,特异性可达95.0%,与 文献L4研究一致,因此AKA对RA早期诊断具有重要价值;一 些学者也曾对发病初期AKA阳性的患者进行随访,发现这些患 者均发展为典型RA并表现出明显疾病活动性,2o%患者在发 病前表现为AKA阳性,在我们的疾病对照组中,有l例成人Stil 病患者表现为AKA强阳性,该患者是否发展为RA有待随访观 察. 本文仅对自制抗原片检测AKA及其在早期诊断中的价值 做了初步探讨,自制抗原片方法简便易行,实验前做切片抗原 损失较少,适合临床应用. 参考文献 1董怡.类风湿性关节炎.见:叶任高主编.内科学.第5版.北京: 人民卫生出版社,20O0.897. 2YoungBJ,MallyaRK,LeslieliD,et81.Anti—keratinantibodiesinrheumatoid arthritis.BrMedJ.1979,2:97-99. 3朱立平,陈学清主编.免疫学常用实验方法.第1版.北京:人民军 医出版社,20O0.365—366. 4AhoK,PalusuoP.KunkiP.MarkerAntibodiesofrIleurndarthritis:Diag— nosticandpathogeneticiraplieations.Sonills~inArthritisandRheumatian. 1994,23:379—387. 5PaimelaL,GfiperIbergM,KurkiP,eta1.Antikerafinantibodies:diagnostic andprognosticnmd(ersforearlyrheumatoidarthritis.AnnRheumDis,1992, 51:743-746. (收稿日期:2003—03—05) 重复胃伴胃癌1例 马力蔡鸿昌 患者,男,36岁.主因上腹间断性疼痛伴呕吐3余年,黑便 2个月入院.患者自出生后每次喂奶后即吐,3岁后呕吐逐渐好 转,但饮食不当时即呕吐,呕吐物为当日所进食物,吐后腹痛缓 解.近2个月来上述症状逐渐加重,伴黑便,体重较前减轻5lqg.钡餐检查疑为十二指肠梗阻(性质待定)伴内瘘.胃镜检查 示:浅表性胃炎.查体:慢性病容,贫血貌,腹平坦,肝脾未及, 上腹压痛,可及一约8cmx6cm肿块,活动度可,移动性浊音阴 性,肠鸣正常.由于胃镜不支持胃癌诊断,经科内术前讨论,拟 行剖腹探查术,术中见胃体大弯侧有一直径约6cm肿块,结节 状,质硬,色灰白,部分被大网膜包裹,肿物活动可,胃大小弯 侧,幽门上下均可见肿大淋巴结,腹主动脉周围及肠系膜根部 未见肿大淋巴结,肝,胆,脾,双肾未见异常,术中诊断:胃体癌. 行根治性全胃切除术,结肠后食管空肠吻合术,术后恢复顺利. 作者单位:073000河北省定州市人民医院~'b---科 ? 病例? 术后大体病理:胃小弯侧剖开胃腔可见大小弯侧之间有一隔 膜,隔膜上起自胃底,终止于幽门.小弯侧近端与贲门相通,远 端与十二指肠球部有一直径1.5cm孔相通.大弯侧胃腔近端 是盲端,远端与十二指肠相通,管腔直径约2.5cm.大弯侧可 见一巨大溃疡,表面污秽,质硬. 病理诊断:重复胃伴胃体高分化腺癌,已侵及至浆膜,胃大 弯,胃小弯及幽门上下诸处见淋巴结转移癌. 讨论重复胃发生恶性肿瘤,术前诊断十分困难,术后复习上 消化道造影片,钡剂系由小弯侧胃腔进入十二指肠,再反流入 胃大弯侧胃腔.因见有充盈缺损,易被诊为十二指肠梗阻;钡 剂由十二指肠进入空肠,易被误认为是内瘘. 重复胃是一种先天性胃肠道发育畸形,由于重复胃隔膜影 响,钡餐造影及胃镜检查结果常常不相符,故而临床工作中对 于胃的病变如出现上述情况,应考虑到重复胃的可能性.