电化学石英晶体阻抗和FTIR-ATR研究牛血清白蛋白在羟基磷灰石、TiO2表面的吸附

电化学石英晶体阻抗和FTIR-ATR研究牛血清白蛋白在羟基磷灰石、TiO2表面的吸附 电化学石英晶体阻抗和FTIR-ATR研究牛血清白蛋白在羟基磷灰石、TiO2表面的吸 附 第24卷第2期 2007年2月 应用化学 CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRY Vo1.24No.2 Feb.20o7 电化学石英晶体阻抗和FTIR.ATR研究 牛血清白蛋白在羟基磷灰石,TiO2表面的吸附 杨琴刘美玲张友玉谢青季姚守拙 (湖南师范大学化学化工学院,化学生物学及中药分析省部共建教育部重点实验室长沙410081) 摘要用电化学石英晶体阻抗法(EQCI)和衰减全反射红外光谱法(F11R-ATR)研究了牛血清白蛋白 (BSA)在纳米生物活性材料TiO,和羟基磷灰石(HAP)上的吸附行为,获得了BSA吸附过程中电极表面的质 量变化和电极/蛋白质界面双电层中电容变化以及BSA构象变化等信息.以2步骤连串反应机理分析BSA 吸附动力学.结果表明,BSA在2种电极表面的吸附过程均分为吸附和重排2个过程,BSA在TiO上吸附速 度慢于在HAP上的吸附.且难达到稳定状态.根据Sauerbrey方程结合Martin方程估算了BSA在TiO和HAP 上饱和吸附时的表面质量覆盖度,分别为1.12×10和1.09×10g/cm.红外谱图结果还表明,生物材料 的表面组成对蛋白质吸附动力学和蛋白质结构变化均有影响.BSA在HAP表面吸附时的响应更大,并对蛋 白质二级结构的变化影响更大. 关键词牛血清白蛋白,电化学石英晶体阻抗,衰减全反射红外光谱法,TiO,羟基磷灰石,吸附动力学 中图分类号:O614文献标识码:A文章编号:1000-0518(2007)02-0128-06 医疗上常用移植生物活性材料来取代坏死或受损硬组织.生物材料植入体内,材料表面直接与活 体组织接触,其生物相容性很大程度决定于材料的表面特性.在材料表面吸附的蛋白质可以调节组织 细胞对外来植人体的生理反应_1].有现象表明吸附在生物材料界面上的蛋白质数量以及构象决定了吸 附细胞的种类,并进一步影响细胞的活性及其扩散和迁移【2].紫外光谱【3],红外光谱【4],x射线光电子 能谱【5],椭圆偏振光谱[和圆二色光谱[,表面等离子体波共振【8]及高效液相色谱【9都可应用于蛋白 质的研究.但存在如灵敏度不很高或难以获得实时信息等不足.电化学阻抗研究蛋白质已有文献报 道【l...然而,很少有文献报道用电化学压电石英晶体阻抗系统研究蛋白质在不同生物活性材料包括 HAP和TiO,表面上的吸附过程. 本文应用电化学压电石英晶体阻抗(EQCI)能实时,灵敏监测电极表面过程,提供电极表面质量变 化和体系物理化学性质变化信息以及FYIR.ATR能分析物质表层成分结构信息的特点,比较研究了 BSA在HAP,TiO,2种纳米生物材料表面的吸附动力学和吸附机理,考察其吸附过程中的构象变化. 1实验部分 1.1试剂和仪器 BSA(美国Amresco公司),纳米TiO,(粒度为515nm,日本恒和化学公司),纳米HAP按文献 [11]方法自制.其它试剂均为分析纯或优级纯.BSA储备液用pH=7.4的0.05m0l/,LPBS配制,于冰 箱内保存.水为二次蒸馏水. Nexus670型傅立叶变换红外光谱仪(NicoletInstrumentCo.,Madison,WI),配以衰减全反射附件 (ATR,45.入射角,ZnSe晶片);氘代硫酸三甘肽(DTGS)检测器;OMNIC5.1数据处理软件,谱峰拟合使 用GRAMS/AI软件(GalacticIndustry,Inc.,Salem,NH);S-570型扫描电子显微镜(日本日立). 1.2电化学石英晶体阻抗测试 本文采用文献[10]测试装置.实验用直径为l2.5mm双面镀金的AT切9MHz压电石英晶体 2006-03-21收稿,2006-06-30修回 国家自然科学基金(20335020,20675030),重大基础研究前期研究专项(2003CCC00700)和湖南省教育厅重点项目资助 通讯联系人:张友玉,女,博士,教授;E-mail:zhangyy@hunnu.edu.cn;研究方向:电分析化学与电化学 第2期杨琴等:电化学石英晶体阻抗和~I'IR—ATR研究牛血清白蛋白在羟基磷灰石,TiO:表面的吸附 (PQC)电极(JA5B型,北京707厂),金电极直径6.0mm.露在空气中的电极接人HP16092A阻抗测 试架非地端,晶体触液面金电极接人HP16092A地端作为工作电极,参比电极为饱和甘汞电极(SCE), 对电极为直径1mm,长1cm的碳电极. 为去除金电极表面污染,电极表面用1滴浓硝酸处理5min后用双蒸水彻底清洗.取3OLTiO悬 浊液(1×10一mol/mL,由一定量TiO,分散于二次蒸馏水中超声30min制得)均匀覆盖在PQC电极的 Au表面,自然蒸发水分后在红外灯下烘烤5h固化,制成TiO,修饰电极.同法制备HAP修饰电极. 将修饰电极放人盛有20mLPBS(pH=7.4,0.05mol/L)电解池中,当PQC响应频率稳定后,向其 中加入一定浓度BSA.在测定电化学石英晶体阻抗同时监测振荡频率,等效电路参数和界面电容变化. 1.3样品制备和测试 TiO膜参照文献[12]方法制备,取2001×10I2mol/L的TiO悬浊液,均匀地铺满ZnSe晶片,溶 剂水蒸发后,在ZnSe晶片表面形成一层均匀的TiO,薄膜.同法制备HAP膜. 室温下收集ZnSe晶片的谱图背景光谱,分辨率4cm,,扫描256次,再分别收集样品溶液和空白溶 液的红外光谱.样品谱图差减空白溶液谱图得蛋白质谱图,经基线校正及7点Savitsk—Goly函数平滑 后,作二阶导数和傅里叶去卷积,然后采用Gauss函数对谱图进行多次拟合,以确定各子峰与蛋白质不 同二级结构的对应关系,并根据其积分面积计算各种二级结构的相对含量.' 2结果与讨论 2.1TiO2和HAP修饰膜的表面表征 图1为扫描电子显微镜观察的2种生物活性材料修饰膜表面形貌图.图中可见,TiO(图1口)形成 一 层很均匀的膜且颗粒均匀.而HAP(图 1b)修饰膜颗粒不均匀,颗粒大小不一致, 而且比TiO,颗粒大. 2.2BSA在TiO,和HAP电极上的吸附 2.2.I饱和吸附浓度考察图2为不同 浓度的BSA在TiO,和HAP电极上吸附的 A和AR响应曲线.由图可见,随BSA浓 度增大,R上升下降.对于BSA在TiO 表面的吸附,当本体溶液中BSA的质量浓 度超过1.187g/L时.继续增加BSA的浓 度不再引起响应信号的显着变化.说明 BSA在TiO,表面上达到了饱和吸附.同 图1TiO:(口)和HAP(b)修饰膜的扫描电镜图片 Fig.1SEMimagesof(口)TiO2and(b)HAPfilmsurfaces 样,当质量浓度超过0.995g/L时,HAP上的BSA吸附达到饱和,据此,本文选用1.200g/L的质量浓度 来研究BSA在2种生物活性材料表面的吸附动力学. 2.2.2BSA吸附动力学图3为BSA在TiO和HAP电极上吸附时的,AR,AC.和AC的响应曲 线.由图可知,BSA的JmA,导致,c.和C上升下降.迅速降低表明BSA在TiO和HAP表面吸 附,且约600s后BSA在HAP表面吸附达到稳态.BSA在TiO,表面的吸附速率慢于HAP上的吸附速 率,大约1200s后PQC响应达到稳定. 描述蛋白质吸附动力学过程最简单的方法是考虑在电极/溶液界面发生的如下连串反应_】..: K, A—B—C(1) 这里A代表自由蛋白质分子,B代表吸附到电极表面的分子,而c代表重排的分子或者第2层被吸附 的蛋白质分子.频率的变化可以用2个指数函数之和表示: Y(1)=口0+口1e'一'/''+a2e'一/'(2) 式中,为频率响应,而口.,口,口:,丁和丁为待估的参数,t为吸附时间.ao代表蛋白质吸附无限长时间 应用化学第24卷 f/Sf/S 图2不同浓度的BSA在TiO(n)和HAP(b)表面吸附过程中的谐振频率()和动态电 阻(AR.)响应 Fig.2TimecourseofsimultaneousresponsesofafoandARlduringBSA adsorptiononto(n)TiO2and(b)HAPmodifiedelectrodes ArrowsindicateadditionsofBSAsolution(20L)toafinalBSAconcentration(g/L)of0.200,0 .400,0.598, 0.796,0.995,1.187,1.390,1.587inFig.2aand0.200,0.4OO,0.598,0.796,0.995,1.187inFig. 2b 图3BSA在TiO(n)和HAP(b)电极表面吸附的电化学石英晶体阻抗响应 Fig.3TimecourseofsimultaneousresponsesofARl,afo,ACoandACduringBSAadsorption onto(n)TiO2and(6)HAPmodifiedselectrodesfor1.2g/LBSAin0.05mol/LPBS(pH=7.4)at0.1V Line:experimentalresults;Circles:fittedresultsaccordingtoEqn.(2). Andtheelectrochemicalimpedanceconditionswere3kHz,5mVrnls,0.1VSCE 的频率变化.2个指数函数表示蛋白质在电极表面的吸附包括2个不同的动力学 过程.即蛋白质在电极 表面的吸附和蛋白质分子的重排.通过拟合响应可以得到相应的参数值(表1和图 3),其相对残差 的平方和定义如下: 轰=? 式中,rm和r.分别表示拟合数据和实验所得的响应值,而J7,r为响应信号的点数. 图3和表1所示拟合结果与实验结果吻合良好.根据方程(2),‰代表t一?时的频 率变化值.因 此,BSA在TiO,和HAP修饰电极上吸附达到饱和吸附时可分别导致一681和一 1741Hz的最大频率变 化.石英晶体表面刚性负载的频率变化和质量变化之间的关系符合以下Sauerbrey 方程?: afo一一2?264×lo1(4) 式中,afo为气相中频率改变(Hz),为PQC的基频即在空气中的谐振频率(9MHz),Am为负载量 第2期杨琴等:电化学石英晶体阻抗和}~FIR—ATR研究牛血清白蛋白在羟基磷灰石,TiO:表面的吸附131 (ng),Pq为石英晶体的密度(2.65g/cm),.为石英的剪切模量(2.947×10mdyn/m),A为电极的有效 面积(0.295cm).由于界面液体的黏度,密度和导电性等性质的影响,方程(4)不能简单地运用于水溶 液中石英晶体表面质量变化的计算.因此,为了合理估计BSA吸附量,评估吸附过程频率响应的非质 表1蛋白质吸附过程中PQC频率变化()和酰胺?带1545cmI1处红外吸光度的拟合结果 Table1ParametersobtainedbyfittingresponsesofandamidebandII(1545cm) absorbancegiveninFig.3and5toEqn.(2) 量效应是很重要的,动态电阻尺能反映这一因素的影响.对仅有溶液粘密度改变的纯粘性效应,溶液 中的动态电阻改变值?尺和谐振频率的改变值?.的关系可用Martin方程Ll来描述: A—lf AR.:一一47rL(5) ?' 式中,,为石英晶体在空气中的动态电感,为压电晶体的弹性常数(2.957×10mdyn/m)?.对于 9MHz的压电石英晶体,由方程(5)计算出的?对AR..的斜率约为一10Hz//Q,即由溶液的粘度,密度 变化引起的动态电阻变化(AR忆)为1Q时,理论上仅能引起约10Hz的频率改变().然而,当./ AR.的绝对值远大于10Hz//Q时,?仍可近似作为溶液中电极表面质量变化的量度_l.从本文实验 可以看出,BSA在TiO,表面上吸附时引起的动态电阻变化不大,约为2Q,相当于净粘度,密度变化引起 的频率变化仅仅约20Hz,与整个的频率响应相比几乎可以忽略不计,因此,我们认为BSA在TiO表面 上的吸附主要是质量负载.若从表1所示的频率响应中扣除20Hz,则由质量效应引起的频率变化为 一 661Hz.因此,BSA在TiO,表面上吸附的质量覆盖率为1.12×10g/cm.但从图2和图3可以看 出,当BSA在HAP电极上吸附时导致了一个很大的动态电阻的响应约110Q.因此,BSA在HAP电极 上的粘性负载不能忽略,假设引起动态电阻响应的因素为纯粘密度改变,扣除相应的纯粘度的影响,则 质量负载引起的频率响应约为一(1741,1100)Hz,相当其表面的质量覆盖率为1.09×10g/cm. 结果可见,当BSA达到饱和吸附时,在2种电极表面的质量覆盖相差不大.但BSA在HAP表面上较大 的动态电阻变化,可能是由于HAP表面大量的羟基与BSA有较强的氢键作用,BSA更容易在其表面吸 附,导致HAP表层变得相对疏松,使PQC在溶液中振荡时受到更多的来自环境的阻力,因而造成很大 的动态电阻变化和额外的频率响应.从表1可知,BSA在HAP表面吸附达到平衡和重排的时间都比较 短,说明BSA与HAP有较强的作用. 由图3可知,BSA在2种表面吸附后都引起了界面双电层电容C的增大,可能是因为BSA修饰后 溶液中的水分子和电解质更容易渗入吸附于电极表面修饰层,使双电层中介电常 数大的水分子和电解 质数目增多使得双电层电容C增加. 2.3FTIR.ATR研究BSA在TiO,和HAP电极上的吸附 2.3.1吸附动力学图4为BSA储备液及吸附于TiO,和HAP表面的BSA红外光谱图.酰胺I带 1636cm处的强吸收峰,主要是多肽链上酰胺基的C—O伸缩振动以及C—N伸缩振动和N—H面内 弯曲振动的耦合.1545cm处酰胺?带的强吸收峰主要是N—H面内弯曲振动以及C—N伸缩振动 和C—C伸缩振动的耦合[12].1453和1399cm处的吸收峰则分别归属于蛋白质CH,侧链上C—H的 变形振动和羧酸根离子的C—O伸缩振动.酰胺?带吸收较弱,主峰在1240cm处.C—H伸缩振动 引起的红外吸收峰位于2900cm处.由于溶剂水的吸收峰常对酰胺I带造成干扰,因此可根据酰 胺?带谱峰的吸收值变化来监测BSA的吸附情况Ll.将红外差谱中酰胺?带谱峰的吸收值对时间作 图,可以得到BSA在TiO,和HAP表面吸附的动力学曲线,如图5所示.实验数据用方程(2)进行拟合, 132应用化学第24卷 结果如图5和表1所示.拟合结果与实验结果很吻合,进一步说明BSA在2种表面的吸附分为吸附和 重排2个过程,BSA在HAP表面吸附容易达到吸附平衡,且吸附后BSA的重排时间(/.值较小)较 短,说明BSA与HAP有较强的作用,与压电石英晶体阻抗测定结果一致. 图4BSA及其在TiO,和HAP表面 吸附后的红外谱图 Fig.4IRspectraofBSAandBSA adsorbedonTiO2andHAP Theblankspectrumwasobtainedfrom0.05mol/LPBSsolution andtestsolutionWasa20g/LBSAsolutioninPBS.pH=7.4 图5BSA在TiO,和HAP表面吸附时酰胺?带 1545cm处红外吸光度随时间变化曲线 Fig.5Absorbanceat1545cm,timefor BSAadsorbedfroma20g/Lsolutiononto(口)TiO2 surfaceand(6)HAPsurface Circles:experimentalresult;line:fittedresultaccordingtoEqn.(2) 根据电化学石英晶体阻抗和红外光谱研究发现.BSA在2种材料表面的吸附程度不同,说明材料表 面性质对吸附过程有影响.据文献[1]报道,HAP提供ca和PO:一结合位点能与BSA中不同的官能团 (NH;,COO一)相结合.在中性溶液(pH=7.0)中,带负电的BSA分子通过HAPPO;…H一和 HAPCa…OOC一键吸附到HAP表面_l.在pH值大于TiO2等电点(pH值约为5_1引)的溶液中,由于 TiO,表面有大量的羟基和羧基_1'而带负电荷,这些基团与BSA分子中的一NH形成 TiO,OH--…HN一和TiOCO0-一…HN一键,导致BSA的吸附.但是由于BSA分子在中性溶液中带 净的负电荷,所以这种静电吸附力较弱,导致BSA在TiO,上的结合较慢且难达到稳态. 2.3.2BSA的红外谱图及二级结构分析由于酰胺I带对蛋白质二级结构变化较敏感,且目前谱峰归 属较成熟,常被用来分析蛋白质的二级结构变化[18],16951658cm为一转角;1658—1650cm为 ot一螺旋;16501640cm为无规则卷曲;16401610cm为一折叠.酰胺I带是不同二级结构的谱 峰加合带,彼此严重重叠.需通过去卷积和曲线拟合将重叠在一起的谱峰分开.用 GRAMS/AI软件拟 合BSA吸附前后酰胺I带去卷积和谱峰进行拟合,并将拟合所得.螺旋,一转角和一折叠各子峰的峰 面积所占含量列于表2.从表中可看出,BSA在固体表面吸附后,一螺旋结构明显减少,一折叠相应增 加,一转角变化不大,表明BSA由一螺旋结构向一折叠转变.根据上述分析,由于更强的静电吸附力,在 HAP表面吸附的蛋白质发生了更多的构象变化.在我们的研究中,BSA在HAP表面上吸附时有更大的 响应,增加了蛋白质和细胞之间相互作用的可能性.然而.同时BSA发生了更大的构象变化,这是否会 升高或降低细胞响应的活性,或者会导致类似此类蛋白质的细胞构象发生变化还有待于进一步的研究. 表2溶液中和TiO2,HAP表面吸附的BSA酰胺I带的几种二级结构含量 Table2SecondorderstructureofBSAadsorbedonTiO2,HAPcoatedsurfaces 8每l山D《 4 舛? nnn— 第2期杨琴等:电化学石英晶体阻抗和FFIR-ATR研究牛血清白蛋白在羟基磷灰石,TiO:表面的吸附133 参考文献 1HorbettTA.Su矿SciSeri[J],2003,110:393 2JahangirAR,McClungWG,CorneliusRM,McCloskeyCB,BrashJL,SanterreJP.JBiomed MaterRes[J],2002,60:135 3AndradeJD.In:AndradeJDEd.SurfaceandInterfacialAspectsofBiomedicalPolymers[M ].NewYork:Plenum Publishers,1985:1 4Sehwint~P,VoegelCJ,PicartC,HaikelY,SchaafP,SzalontaiB.JPhysChemB[J],2001,105 :11906 5ChoiEJ,FosterMD.Langmu/r[J],2002,18:557 6LeeSW,LaibinisPE.B/omater/a/s[J],1998,19:1669 7TanakaM,MotomuraT,KawadaM,AnzaiT,KasoriY,ShiroyaT,ShimuraK,OnishiM,Moc hizukiA.B/omazer/a/s[J], 2000,21:1471 8ChapmanRG,OstuniE,LiangMN,MeluleniG,PierG,IngberDE,WhitesidesGM.Langmui r[J],2001,l7:1225 9OmbelliM,CompostoRJ,MengQc,EckmannDM.JChromatogr,B[J],2005,826:198 10ZHANGYou.Yu(张友玉),XIEQing-Ji(谢青季),YUANYu(袁 玉),YAOShou-Zhuo(姚守拙).ChineseJApplChem (应用化学)[J],2001,19(1):4 11GUOGuang-Sheng(郭广生),SUNYu-Xiu(孙玉绣),WANGZhi-Hua(王志 华),GUOHong-You(郭洪猷).JBeijing UnivChem(北京化工大学)[J],2004,31:78 12MouhonSE,BarisciJN,McQuillanAJ,WallaceGG.CollidsSu矿A[J],2003,220:159 13SauerbreyG.Z脚s[J],1959,155:206 14MartinSJ,GranstaffVE,FryeGC.AnalChem[J],1991,63:2272 15ChenYL,ZhangXF,GongYD,ZhaoNM,ZengYY,SongXQ.Jcoff0Inte矿 Sci[J],1999,214:38 16Roddick-LanzilottaAD,ConnerPA,McQuillanAJ.Langmuir[J],1998,14:6479 17Servagent-NoinvilleS,RevauhM,QuiquampoixH,BaronM.JColloidInte矿 Sci[J],2000,221:273 18XIEMeng-Xia(谢孟峡),JIANGMin(蒋敏),LISong(李菘),LIUYuan(刘 媛).ActaChineseSin(化学)[J], 2004.16:1460 BovineSerumAlbuminAdsorptiononHydroxyapatite andTiO2InvestigatedbyElectrochemicalQuartz CrystalImpedanceandFTIR-ATRSpectroscopy YANGQin,LIUMei—Ling,ZHANGYou—Yu,XIEQing—Ji,YAOShou—Zhuo (KeyLaboratoryofChemicalBiology&TraditionalChineseMedicineResearch, MinistryofEducation,HunanNormalUniversity,Changsha410081) AbstractTheadsorptionofbovinesel'xlmalbumin(BSA)ontonanocrystallinehydroxyapatiteandTiO2was studiedbyelectrochemicalquartzcrystalimpedanceand17HR— ATRspectroscopy.Theresponseparametersof piezoelectricquartzcrystal(PQC)resonance,frequencyandthechangesinthedoubleelectriclayercapaci— tancewereobtainedduringBSAadsorption.Theadsorptionkineticswasanalyzedwithaschemeoftwoconsec? utivereactionsoccurringattheinterface.TheadsorptionrateofBSAonTiO2surfacewaslowerthanthaton HAPsurface.ThesaturatedsurfacecoveragesofBSAwererespectively1.09x10, and1.12x10g/cm onHAPandTiO2calculatedv/atheSauerbreysequation.VFIR— ATRspectroscopywasusedtostudythe adsorptionkineticsandthechangeoftheBSAsecondorderstructure.Theexperimentalresuhsshowthatthe structureofthebiomaterialaffectsboththeadsorptionkineticsandthesecondorderstructureoftheBSAand theeffectofHAPontheBSAadsorptionismorenotably. Keywordselectrochemicalquartzcrystalimpedance,VFIR— ATR,adsorptionkinetics,TiO2,hydroxyapatite,BSA