小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞性别鉴定方法研究

小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞性别鉴定方法研究 : :. :: : , ,独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发或出版过的研究成果,文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 巧百龟 ?旺年月 学位论文作者: 签字日期: 这日 学位论文版权使用授权 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院筹可以将学位 论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书,本论文:口不保密, 年 月止. 口保密期限至 导师签 学位论文作者签名:佰乜 签字日期:矽,年多月日 签字日期: 挑年月易日目 录 目录 摘 要.??.?.. 第一部分文献综述?. .哺乳动物性别鉴定研究简史 .哺乳动物性别决定机理.早期胚胎性别鉴定主要方法 .细胞遗传学法。 .免疫学方法?。 ..间接免疫荧光分析法. ..细胞毒性法..囊胚形成抑制法??。 .生物化学方法.. .分子生物学方法 ..聚合酶链式反应法?. ..法. ..探针法?。:??. .,、鼠附植前胚胎及成纤维细胞的双重性别鉴定法. .小鼠附植前胚胎取样技术..毛细管吹吸法。 ..显微手术法?。 ..徒手分割法?。 。..免疫手术法?. ..酸性溶液溶解透明带法??. .成纤维细胞的形态特点??。 .小鼠成纤维细胞的研究及其应用在胚胎移植的应用进展? .性别鉴定法的类型? .法胚胎性别鉴定技术的应用前景?.. 第二部分试验部分? 试验一引物设计及其合理性检测?. .实验材料.实验动物 .实验仪器与设备 .主要药品、试剂和溶液的配置 ..主要药品与试剂??. ..主要溶液配制??。 西南大学硕学位论文 .试验方法?.. .引物设计与合成?:? .小鼠基因组的制备.引物合理性检测??。 .结果与分析.. .小鼠基因引物设计合理性检测 .小鼠基因引物设计合理性检测 .双重鉴定小鼠肝脏细胞性别的研究? .讨论??.? .引物设计合理性对双重性别鉴定效果的影响 .以小鼠肝脏组织基因组为模板的双重性别鉴定.,、结??. 试验二小鼠.细胞胚胎卵裂球的双重性别鉴定方法的研究??。 .实验材料?。 .实验动物.实验仪器与设备.主要药品、试剂和溶液配置. ..主要药品与试剂..主要溶液配制 .试验方法 .小鼠.细胞胚胎的获取 .小鼠.细胞胚胎卵裂球的获取.小鼠早期胚胎的提取一 .小鼠.细胞胚胎卵裂球的双重性别鉴定??。 .结果与分析?,??. .小鼠.细胞胚胎卵裂球的体外培养 .小鼠.细胞胚胎卵裂球的性别鉴定. .讨论??.: .反应体系及反应条件对性别鉴定效果的影响。 .胚胎因素对双重性别鉴定效果的影响 .其他.:.: .,、;言 试验三的分离培养及基因性别鉴定~ .实验材料..。 .实验动物??. . .实验仪器与设备. .主要药品、试剂和溶液配置一 ..主要药品与试剂??.目 录 ..主要溶液配制 .试验方法?.. . .小鼠胎儿的获取??.. . 的分离培养?. . 的传代培养?:.. . 的提取? . 的性别鉴定.结果与分析 . 的分离、培养与传代.. . 的性别鉴定?.. .讨论??. .,、结??. 结论 参考文献附录缩略词表 致谢.?.. 发表论文一览表??.两南大学硕士学位论文摘要 小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞 性别鉴定方法的研究 / 摘 要 哺乳动物的早期性别鉴定是人为进行性别控制的手段之一。在畜牧业生产中, 通过性别控制能够建立优化商品畜群,充分发挥母畜的繁殖能力及公畜的生长优 势,提高畜产品经济效益,并能够在生产前排除潜在有害基因型,防止性连锁疾 病;在分子生物学、胚胎细胞学及发育遗传学等基础学科的研究中,胚胎性别鉴 定是探索胚胎发育机制、深化干细胞研究、实现肿瘤分子调控等热点研究课题的 环节之一;胚胎成纤维细胞具有细胞体积大数目多、来源广泛且取材方便以及在 体外培养条件下能够迅速生长繁殖,并且能够长期传代等优点,广泛应用于 胚胎 干细胞的分离与培养、体细胞克隆与核移植等课题的研究,因此小鼠早期胚 胎及 成纤维细胞的性别鉴定在畜牧生产、遗传育种、胚胎发育学及临床应用范围 内均 具有实用价值。本课题使用双重法对小鼠附植前.细胞胚胎以及小鼠胎儿成 纤维细胞进行了性别鉴定,旨在探寻一种简便可靠的双重性别鉴定方法,为 小鼠细胞培养、体细胞克隆及胚胎移植等研究提供参考。具体内容包括: 引物设计及其合理性检测:以雄性特异性基因序列设计了一对特 异性引物,即上游引物:’.’及下游引 物:.’;以雄性及雌性共有的锌指结 : 基因序列设计另一对内标引物, 构 , : 不.’ 为上游引物 ’.广’为下游引物:使用离心柱式动物基因组 提取试剂盒提取小鼠肝脏组织基因组作为模板,在适宜的反应体系及条件 下,分别用两对引物进行体外扩增,扩增产物以%琼脂糖凝胶电泳进行结果检 测。结果表明基因引物对能够对雄性基因组扩增出约的目标条带,雌 性基因组扩增结果为空白,而基因引物对可对雄性及雌性小鼠肝脏组织基因 组均扩增出大小的目标条带;使用已知性别小鼠肝脏基因组为模板,同时 用两对引物进行扩增,结果雄性小鼠扩增结果为内标条带及判断条带同时存 在, 而雌性小鼠扩增结果为一个条带,说明试验所设计引物具备有效性及合理 性; 将适龄健康的雌鼠注射和后与雄鼠合笼,将见栓后的两南大学硕学位论文 雌鼠进行无菌手术,取出子宫并以操作液冲洗,得到.胚龄的胚胎。将所 得胚胎经.%链霉蛋白酶于处理去除透明带,操作液洗涤后,从每 个一细胞胚胎吸取个卵裂球用于性别鉴定:将卵裂球加入此后以此 石蜡油覆盖,恒温煮沸后.‘冰浴,离心,取上清液 用于扩增,扩增体系为: ;; ; .; ;引物;引物 ;样本.;酶.;反应条件为: 预变性?,变性?,;退火?,;延伸?,,共 个循环;。,,?保存。扩增结束后取产物在.%琼脂糖电泳上电 泳检查结果。本试验共对枚小鼠附植前胚胎进行性别鉴定,结果显示其中 枚胚胎电泳检测扩增结果出现大小的判断条带及大小的内标条带, 由此判断此枚附植前胚胎为雄性胚胎; 枚.细胞胚胎卵裂球提取后 进行体外扩增后,电泳结果显示大小的内标条带,判断条带为阴性,因此 判断为雌性胚胎;另有枚胚胎因条带缺失或模糊不明无法进行性别判断。性 别 鉴定成功率为.%。 将适龄健康的雌鼠注射激素后与雄鼠合笼,后将雌鼠处死进行无菌 手术,摘取完整子宫并以取出.胎龄的胎鼠用于分离;将所得 的细胞密度调整至个/,于?、%、饱和湿度培养箱中培养,每 换液一次,待.%细胞贴壁时进行传代培养,并观察贴壁情况,得出 代贴壁及发育状况均优于其他代细胞;取第代按离心柱型细胞基因 组提取试剂盒提取总;使用自主设计的基因引物及基因引 物对 进行体外扩增,扩增体系为:: ; ;; .; ;引物 山;引物 .;样本肛: 酶.“;反应条件为:预变性?,:变性?,;退火?,: 延伸?,,共个循环;?,,保存。扩增结束后取“产物 在.%琼脂糖电泳上电泳检查结果。本试验共对只小鼠.胎儿所制备的 第代进行了性别鉴定,结果表明其中个为雄性,电泳结果同时 显示大小为的判断条带及大小的内标条带,个为雌性,其 样本体外扩增电泳结果仅显示基因内标条带,另有个细胞系由于条 带缺失无法进行性别判断,其检出率为.%。 本试验自主设计了雄性小鼠特异性基因引物对及雌雄小鼠共有的 基因引物对,并以已知性别小鼠肝脏基因组作为模板进行体外扩增,对引物 合理 性及有效性进行了检测,成功地建立了双重性别鉴定体系;根据此体系对小 鼠附植前胚胎及进行了双重性别鉴定,其检出率分别达到.%及 ?摘要 .%。通过对试验结果的分析讨论得出,从.细胞胚胎中吸取个卵裂球为体 外扩增的适宜模板量,从.胎龄制备的经过次传代后贴壁发育情况 较优,适宜用于提取基因组进行性别鉴定,此结论对小鼠细胞培养、体细胞 克隆及胚胎移植的研究提供了参考,具有一定实际意义。 关键词:昆明小鼠:细胞胚胎;胎儿成纤维细胞;性别鉴定;双重 两南大学硕学位论文 ,. . , 、航 ., .: :: ’一’ : : ’一 汀. ’; 、析 : : ’.不一’ : ’’.. ,;诚 % . 、析;、析’. 埘 吐 , . . 、 .% , ,. “ ? , , : , , 西南大学硕十学位论文 . ; ;十 ;; ; .; 肛; ; ; : , ; , ; ?, ; , , ;?, ?. .% . , ..%. . . ./, ?,%, .. , %, ; : ,; . ; ; ;;; .: ; ;斗;?, ?, ?, ; ; ; ?, , ;?, ?. . “ .% 谢 ,;..%. . ’.% .%. . 、? ,, 弱 . ; :; ; ;. 第一部分文献综述 第一部分文献综述 哺乳动物的早期性别鉴定是人为进行性别控制的手段之一。性别控制技术应 用于畜牧业生产能够通过干预雌性哺乳动物按照人们的意愿繁殖特定性别后代, 使得母畜的繁殖能力以及公畜的生长优势得到充分发挥,由于在畜牧生产中许多 经济性状都跟性别相关,采用这一技术有助于提高肉类、乳类、蛋类及皮毛等畜 产品的经济效益;通过性别鉴定能够在生产前排除潜在的有害基因型,防止性连 锁疾病,建立优化商品畜群,促进新品种的选育,大大提高生产效率。随着分子 生物学、细胞遗传学等相关学科的发展,对性别决定的机制认识逐渐深入,性别 鉴定技术也随之发展到分子水平,成为探索胚胎发育机制、深化干细胞研究、实 现肿瘤分子调控等热点研究课题的环节之一:早期胚胎性别鉴定技术还应用于人 类临床染色体连锁隐性遗传病、性别发育异常、性别反转等疾病的诊吲。此外, 具有体积较大、数目较多、来源广泛、 由于胎儿成纤维细胞, 易于取材、在体外培养条件下能够迅速生长繁殖并支持长期传代、培养成活率较 高等优点,能够作为核移植供体细胞,广泛应用于体细胞重编程、成骨诱导生成 等方面的研究,还可用于新药试验及细胞治疗研究,在医学上的研究及应用也越 来越广泛,因此其性别鉴定对体细胞克隆及胚胎移植具有重要的参考意义。 .哺乳动物性别鉴定研究简史 最初等发现染色体是动物性别决定因子【;年等【通 过染色体组型鉴定,确定了日龄兔胚胎的性别;年,肌等【】使用免疫学 方法,利用间接免疫荧光对牛、猪、绵羊等动物的胚胎进行了鉴定;年 等】首次使用牛染色体特异性探针鉴定囊胚期胚胎性别;年,等人 【】人发现了染色体上的性别决定基因,并将其命名为基因 ,随后掣】指出基因为染色体所特有, 具有高度的保守性及同源性:同年,等【】使用技术以牛外周血淋巴细胞 快速检测染色体,成功地建立了家畜胚胎性别鉴定法;年等【建立 了牛胚胎鉴定技术,之后等【】又建立了适合体外成熟以及体外受 精来源胚胎的性别鉴定体系;年,等【】通过基因设计通用 引物,建立了牛胚胎性别鉴定技术;年杨建吲】等通过扩展牛染色 体特异性序列鉴定牛早期胚胎性别。随着分子技术的发展,利用检测 基因已经成为胚胎性别鉴定常用方法,年,黄淑帧等通过基因 等开始利用双重 对转基因试管牛和试管羊进行了性别鉴定;年, 技术扩增基因,在体外条件下鉴定了羊的早期胚胎性别;吴阳升等【】证明对 牛的雄性特异性片段及雌雄共有片段进行多重扩增时,其结果准确率达到西 南大学硕十学妒论文 %以上。在此基础上,王栋等【】发明了两温度梯度多重方法,将扩增时间 大大缩短,且得到的产物较小、条带相差较大,电泳检测时能够快速得到明 显的结果。迄今为止,已发现包括基因在内的、、、.及 .等种基因参与了胚胎性别决定中从未分化原始生殖嵴开始到两性内生殖 器官形成的全过程。 .哺乳动物性别决定机理 在发育早期阶段,哺乳动物胚胎性别尚未分化,仅在中肾内缘具有生殖器官 分化潜能的原始生殖嵴,染色体存在与否决定了其性别分化的方向,中性的 原 始生殖嵴分化为雄性或雌性性器官的过程即性别决定。雄性分化的关键是存 在于 ,。 染色体短臂上一个微小片段,即性别决定区在早期胚胎发育过程中,性腺中胚层尚未分化,如果存在染色体,基因就 会自动启动转录,在睾丸组织细胞系中表达产生因子,继而激活苗勒氏体抑 制物 ,的表达,抑制苗勒氏管及卵巢的发育, 并同时作用于间质细胞,促使雄性器官的形成。而对于雌性动物,由于不存在基因,染色体短臂上的逆性别剂量敏感基因位点基因 ,能够顺利转录,促进卵巢发育产生的雌激素,促使中肾管发育成 雌性器官。因此性别决定是以基因主导的多基因参与的有序协调过程,不同 物种基因表达时间不同,小鼠在.左右开始表达。等将含有 基因的片段作为外源基因导入雌性小鼠胚胎中,结果引起了部分性反转,由 此证明是哺乳动物的性别决定主宰基因。 .早期胚胎性别鉴定主要方法 随着免疫学、发育生物学、分子遗传学等相关学科的发展,早期胚胎性别鉴 定技术已经由利用染色体组型细胞遗传特性进行鉴定的经典方法发展到分子水 平。 .细胞遗传学法 细胞遗传学方法主要是通过核型分析来对胚胎性别进行鉴定,即通过鉴定胚 胎细胞中的性染色体类型来判断胚胎性别。哺乳动物早期胚胎的发育过程中,雌 性胚胎的一条染色体会暂时处于失活的状态,并形成巴氏小体 ,因 此可以通过查明胚胎细胞中的性染色体是否具有巴氏小体来鉴定胚胎的性别。其 主要步骤一般为取少量的胚胎细胞,然后进行活体细胞分析,利用乙酰甲基秋水 仙素来阻止细胞的有丝分裂,使细胞的有丝分裂停留在中期,再经过固定染色, 第一部分文献综述 可以得到停留在分裂中期的染色体分布图。年, 等就用细胞遗传 学方法对第五天的家兔胚胎的性别做了性别鉴定,对取样的细胞进行处理,判定 巴氏小体的存在与否,少部分细胞继续发育为囊胚,移植后得到预期性别的后代。 等对体外授精胚胎进行性别鉴定,囊胚、早期囊胚、扩张囊胚以及扩张后 囊胚的鉴别准确率分别达到%、%、%和%,并证明了性别鉴定的准确 率和发育时期有着显著的关系四。该方法进行胚胎性别鉴定理论可达到%的准 确率,但这种方法对胚胎损伤较大,操作复杂,耗时长,不适用于生产实际,目 前主要用来验证其他性别鉴定方法的准确率。 .免疫学方法 .抗原是雄性哺乳动物细胞膜上的一种糖蛋白,是雄性特异.抗原基因 的产物。免疫学方法主要是运用.抗血清或.单克隆抗体来检测胚胎中是否 具有雄性的.抗原,以达到性别鉴定的一种方法。免疫学方法又可细分为间接 免疫荧光分析法、囊胚形成抑制法以及细胞毒性分析法。 .. 间接免疫荧光分析法 将胚胎与.抗血清或.单克隆抗体共孵育,并以异硫氰酸荧光素 标记球蛋白为第二抗体,在荧光显微镜下 , 检查特殊荧光的方法称间接免疫荧光法。如果有特殊荧光,则为雄性,如果没有, 则为雌性。虽然该方法对胚胎损伤小,但由于.抗原是弱组织相容性抗原,其 产生的抗体特异性不高,并且对荧光强弱的判断具有相当程度的主观性,因此, 该方法的鉴定准确率不高【博。 ..细胞毒性法 细胞毒性分析方法主要利用在补体存在的情况下,.抗体可以和阳性 胚结合,并且会导致其中的一个或多个卵裂球溶解,引起卵裂球呈现出不规则的 体积和形状,抑制了胚胎的进一步发育。实验中将胚胎培养在含有.抗血清与 补体的培养液中,其中具有.抗原的胚胎会出现一定程度的细胞溶解,将此类 胚胎判断为雄性胚胎,而其他的无此种现象的判断为雌性胚胎。王达珍等别用免 疫学的方法制备出.抗血清,运用细胞毒性试验检测昆明小鼠早期胚胎的细胞 表面的雄性特异性.抗原,以此来进行小鼠早期性别鉴定。他们将.细胞期 的胚胎在’培养液中培养,再加入.抗血清和正常小鼠血清。在培养 之后,镜检胚胎细胞,胚胎中有一个或多个卵裂球发生溶解的胚胎为雄性胚 胎, 无反应的即为雌性胚胎。结果表明共枚胚胎,经处理后有.%为阳性,有 .%为阴性。等【用.单克隆抗体对.细胞期小鼠胚胎进行细胞毒性 试验,鉴定的.阴性胚胎移植后所生仔鼠.%/为雌鼠。由于该方法 两南大学硕十学位论文 以破坏雄性胚胎为代价,不但准确度不高,而且还降低了胚胎的存活率,因此 该 方法目前已很少使用。 ..囊胚形成抑制法 雄性胚胎在桑椹胚往囊胚发育过程中,.抗体对其具有可逆性抑制的作用, 利用这一原理形成了囊胚形成抑制法这种早期的胚胎性别鉴定的方法。试验 中, 将.抗血清与桑椹胚共培养,具有.抗原的雄性胚胎会被.抗体抑制,不 能形成囊胚,而没有.抗原的雌性胚胎不会被.抗体抑制,可以继续发育成 囊胚。因此可将雌性胚胎和雄性胚胎分开。等】运用奶牛的胚胎与? 抗体共同培养后,根据胚胎发育的情况将其分类,处于囊胚期的胚胎为雌性, 处于晚期桑椹胚的为雄性。结果发现枚胚胎中有枚.%处于晚期桑 椹胚,枚处于囊胚.%,然后将枚胚胎全部移植于母牛,得到其妊娠 率分别为.%/和.%/,后代出生后表现雄性鉴定准确率为 %/,雌性胚胎的准确率为.%/。等用该方法鉴别胚 胎性别,获得雌性胚胎鉴别准确率达%以上,雄性胚胎准确率达%以上。该 方法的优点在于鉴定后的胚胎存活率较高,缺点是雄性胚胎受到损害,而且在实 际生产中,很难准确获得处于桑葚胚时期的胚胎,从而易将一部分发育迟缓的雄 . 性胚胎错误的判断为雌性胚胎。 .生物化学方法 在哺乳动物胚胎发育早期,其中一条染色体失活,从而保持两性染色体等量, 此时雌性胚胎染色体连锁酶的浓度及活性是雄性胚胎的两倍,能够以底物、辅 酶及指示剂与早期胚胎一起孵育,根据胚胎着色情况判断胚胎性别。此类方法由 于各哺乳动物早期胚胎染色体失活时期不确定,容易引起误判田。 .分子生物学方法 分子生物学方法是在世纪年代中期发展起来的一种体外扩增技术, 从其诞生以来发展迅速,被广泛认为在性别鉴定方面具有很好的灵敏度、高效性 以及准确率。据美国格林纳达遗传公司的报道,用三头牛的雄性特异性探针对牛 胚胎性别进行鉴定,其准确率高达%.%。年等人最早采用 技术用于扩增染色体特异性重复序列,鉴定了羊,牛等家畜的胚胎性别,其准 确率高达.%和.%。年在内从在牛桑椹胚或者囊胚的滋养层 中采集个细胞,经过扩增后,其性别鉴定的准确率高达%以上。 年,宫云浩运用技术对绵羊胚胎进行性别鉴定并完成移植实验,鉴定准确率 达到%。在年,实验室根据猪、羊以及牛的基因同源性来设 第一部分文献综述 计引物,用扩增基因上的区域,该技术能够用于牛、羊等家畜以 及人的性别鉴定【。分子生物学方法是目前最理想的性别鉴定方法,它主要 是运 用雄性特异性基因探针和扩增技术来鉴别胚胎性别的一种方法,即检测染 色体上有无基因来判定胚胎的性别,有则为雄性,无则为雌性。其主要方法 包括:雄性特异性探针检测法、荧光原位杂交法、扩增片段检测 法以及法等。 .. 聚合酶链式反应法 ,,根据/ 此方法利用聚合酶链式反应 基因的核心序列设计特异性引物,对胚胎来源的/基因进行扩增,染色后电 泳检测,出现特异性条带的判断为雄性,反之则为雌性。法特异性强、灵敏 度高、检测快速便利,是目前最为常用的胚胎性别鉴定方法。 .. 法 等】发明了快速环式恒温基因扩增技术 ,,法使用种不同引物,能够识别对雄性特异性 序列以及雌性与雄性共有的序列上的个位点,在?左右的恒温条件下进 行扩增反应,反应副产物焦磷酸镁形成浑浊的白色沉淀,能以肉眼观察进行性别 鉴定。该法具有简单快速、准确性好、经济实用等特点【引。 .. 探针法该方法包括雄性特异性探针法及荧光原位杂交技术 ,等,前者使用染色体上分离筛选出雄性的特异性片 段来作为探针,以放射性同位素或者生物素标记,再与胚胎细胞进行 杂交或斑点杂交,结果显示阳性者判断为雄性,阴性者判断为雌性,该方法的准 确率高。年,等报道了运用牛染色体的特异性探针法来鉴定 牛胚胎性别,其准确率高达%,但该法所需胚胎细胞较多,操作繁复,且必 须针对不同种属家畜采用特异性探针,用同位素来进行标记需要较多的胚胎 细胞并花费大量的时间,如果用生物素来进行标记虽然需要的设备简单,且所耗 时间较短,但是技术要求高,可用于鉴定的胚胎也较少;后者使用荧光素探针在 细胞内与靶杂交,高效快速,错误率较低,步骤主要包括荧光素探针的制备、 探针和靶的变性与杂交以及观察鉴定结果。荧光原位杂交法可以使用体细胞 杂交探针和、探针相结合来检测不同胚胎性别的非整倍体的变异,因此具有 等运用该技术以染色体探针和切割 了效率高和错误率低的特点。两南大学硕士学位论文 胚来进行杂交,用于检测猪胚胎性别,其鉴定准确率可达到%,而%的切割 胚在体外发育后具有明显的囊胚腔和内细胞团,并且在接受移植的头受体 中产下头与鉴定结果相同的后代‘们。由于原位杂交技术有时候会使用到放 射性 物质,这也导致了该技术没有得到推广。 .小鼠附植前胚胎及成纤维细胞的双重性别鉴定法 .小鼠附植前胚胎取样技术 冷冻胚胎、新鲜胚胎或体外受精胚胎都可以用于性别鉴定。常见的胚胎分割 方法包括以下几种【: ..毛细管吹吸法 此方法适用于.细胞卵裂球的分离,使用.%链霉蛋白酶溶解透明带,透 明带分层膨胀后即以内径略小于透明带的口吸管轻轻吹打至透明带脱落,继 续用 毛细管吹吸胚胎即可得到单个卵裂球。 ..显微手术法 此方法主要适用于分割桑椹胚及囊胚。在显微操作仪下,以固定针固定桑椹 , 胚,以玻璃针对称切割胚胎,尤其是囊胚,需要注意将内细胞团 对称地一分为二。 ..徒手分割法 此方法适用于分割体积较大的胚胎,在体视显微镜下,以刀片切开透明带, 再用直径略小于胚胎的毛细管吹吸几次,使胚胎从透明带中脱出,也可直接 使用 玻璃针将透明带连同细胞一起切开。 ..免疫手术法 此方法将胚胎置于抗血清,使其滋养层细胞与抗体分子充分结合,在补体的 作用下,利用抗原抗体特异性结合反应,溶解外层滋养层细胞,未与抗体结合的 则保持相对完整。 ..酸性溶液溶解透明带法 李小红等【在将禾细胞胚胎转送恒温的显微操作仪平台后,将胚胎固 定,使用酸性液在透明带上反应形成裂孔,以内径约的微小穿刺针 插入吸出单个卵裂球,这种方法可以保留比较完整的透明带。 第一部分文献综述 . ?曼曼曼量曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼寡 .成纤维细胞的形态特点 成纤维细胞指成熟的分化纤维细胞的增殖前体细胞,由未分化的中胚层衍生 而来,能够分泌大量的细胞外基质【】,并普遍存在于结缔组织,类型不同的结缔 组织所含成纤维细胞的数量存在差别,相同体积的致密结缔组织中成纤维细胞数 量多于疏松结缔组织含量,因此多以真皮等致密结缔组织作为分离培养成纤维细 胞的取材材料。成纤维细胞形态多样,多呈梭形、多角形或扁平星形等,胞体较 大,胞质呈弱嗜碱性,中央有明显的椭圆形核,细胞质向外伸出个突起,其形 态可以随着细胞的功能及生存环境的不同而发生改变。成纤维细胞是贴壁细胞的 典型代表,其功能活动旺盛,电镜下可观察到其胞质中游离核糖体和粗面内质网 含量丰富,高尔基复合体十分发达,具有明显的合成和分泌蛋白质的功能“硎。 .小鼠成纤维细胞的研究及其应用在胚胎移植的应用进展 成纤维细胞具有数目多、胞体大、来源广、易培养和增殖快等优势,被广泛 应用于试验研究及医学治疗,由于取材方便,并且能够分泌碱性成纤维细胞 , 生长因子,常用于实验室制备饲养层【,在胚胎干细胞 细胞的分离克隆研究中起着重要作用。年和利用小鼠胎儿 成纤维细胞 ,从小鼠囊胚中成功分离出 小鼠【,此后,该方法在建立大鼠、兔、猪、羊和牛的类细胞系都得到了成 功应用。细胞在生长状态良好的饲养层上集落形成率较高且不易分化引, 同时也可以作为其他细胞培养的饲养层,其分泌的多种细胞生长所必需的 因子能够满足细胞健康生长的条件,尤其有利于低密度细胞的生长【。成纤维细 胞生长因子 ,是一类活性肽物质,具有广泛的生物 学特性,根据其等电点的不同可以分为酸性成纤维细胞生长因子 , ,及碱性成纤维细胞生长因子。两种成纤维生长因子的结构相关性为%,生物 学活性范围基本相同, 对酸和热均不稳定【柏.】。不仅能够有效地促进来源于神经外胚层与中胚层 的 细胞的有丝分裂活性,而且能够促进其它外胚层细胞及内胚层衍生物的有丝 分裂 活性【.,有研究表明质量浓度达/以上时能够独立促进人胚胎干细 胞在体外稳定增殖,且细胞全能性及分化状态不受任何影响?,其中是细 胞化学限定性培养体系中最常添加的一种细胞因子【孓矧。此外,能够迅速 反应基因功能的失调,常常被用于分析基因突变对机体的影响。例如切除 基因的小鼠周后的死亡率高达%,在此存活率下很难分析其生长活力,而来 源于小鼠.胎龄的具有增殖迟缓的优点,能够应用于长时间分析表型形 成的控制机制刀。在近年的研究中,也常用于重编程为多功能干细胞, 两南大学硕十学位论文 年,日本的两位科学家 【,】通过逆转 和 种与多能性相关的 录病毒载体向导入、一、以及. 转录因子得到了诱导多功能干细胞 , 。 . 性别鉴定法的类型 技术鉴定小鼠胚胎性别的原理是根据雄性特异性基因序列设计一对引 物,引物寡核苷酸片段与靶双链两端邻近序列互补,在酶存在的条件下 对胚胎细胞进行高温变性、低温退火及适温衍生的周期循环,经过.个 循环后将此基因序列片段扩增至上百万倍,然后经染色后进行电泳,在紫外光下 只设置一对染色体特异性序列引 检查扩增目标条带。单重 物或性别决定基因引物,其缺点是容易产生假阴性,如果样品丢失或没有出现扩 设计一对染色体特异序列引物或性别决定 增结果;多重 基因引物,同时设计另一对染色体或常染色体基因引物作为内标引物,进行多 重扩增。如果样品为雌性胚胎,则只能扩增出染色体或者常染色体基因片 段;如果样品为雄性胚胎,则能够扩增染色体特异基因片段及染色体或常染 色体基因片段:如果样品丢失,则不出现任何扩增产物。采用多重进行性别 鉴定时应当检测引物的合理性,以免出现由于基因拷贝数不同而导致扩增效率上 的差异。巢式 又称嵌套式,在反应中亦使用两套引 物进行扩增,首先使用第一套引物扩增.个循环,再使用所得片段内所 设第套引物扩增.个循环,由于第二套引物在第一套引物扩增片段内,则称 第一套引物为外引物,称第二套引物为内引物,两套引物同时使用能够扩增 的特异性【。 .法胚胎性别鉴定技术的应用前景 通过人为控制家畜性别,能够最大程度的利用家畜性别特异性经济性状,建 立优化商品畜群,提高畜产品生产经济效益;这一技术亦可应用于胚胎生物学、 分子生物学等学科基础研究;附植前胚胎性别鉴定应用于临床可诊断性连锁遗传 性疾病、单基因病及染色体病,如甲型血友病及杜氏肌营养不良症的产前诊断, 也可应用于性别发育异常、性别反转等疾病的诊断。而在体外培养条件下 能够迅速生长繁殖并支持长期传代,能够作为核移植供体细胞及细胞饲养层, 广泛应用于胚胎干细胞培养、体细胞重编程、成骨诱导生成等方面的研究,还可 用于新药试验及细胞治疗研究,在医学上的研究及应用也越来越广泛,因此其性 别鉴定对体细胞克隆及胚胎移植具有重要的参考意义。 第二部分试验部分 第二部分试验部分 试验一引物设计及其合理性检测 ..一 月舌 哺乳动物早期性别鉴定技术是实现哺乳动物性别控制途径之一,其中双重 方法通过扩增染色体上的特异片段,根据雄性特异性基因的核心序列, 设计一对染色体特异序列引物为判断,同时设计另一对染色体或常染色 体基因引物作为参照,使用两对引物对样本进行扩增并电泳检测特异性扩增 结果。该方法的关键点是引物设计及其合理性的检测,要求两对引物之间具 有良 好的相关性及有效性。本试验通过自主设计了基因及基因的引物,并通 过已知性别小鼠肝脏基因组对引物合理性及有效性进行检测。 .实验材料 .实验动物 .周龄性成熟昆明系小鼠,体重约,购自重庆市中药研究所,雌鼠群养, 雄鼠单独饲养,光照时间.,定时饲喂普通饲料,自由饮水。 .实验仪器与设备 .高速台式冷冻离心机:德国公司; 电热恒温水浴锅:.型,上海精宏实验设备有限公司; 微量加样器:北京青云航空仪表有限公司; 仪:德国公司; 型电泳仪:北京六一仪器厂: 生物电泳凝胶分析系统:上海复日科技有限公司; 层流洁净室:级.级,绿叶空调净化有限公司; 无菌工作台:.标准型,绿叶空调净化有限公司。 .主要药品、试剂和溶液的配置 ..主要药品与试剂 离心柱型动物基因组提取试剂盒:北京天根生物有限公司, : 两南大学硕学位论文 、、等:北京鼎国生物技术有限公司; 基因序歹物:北京鼎国生物技术有限公司,; 基因序列引物:北京鼎国生物技术有限公司,; :北京鼎国生物技术有限公司,.; 酶 :北京 .,,; 电泳级琼脂糖:,; ,; :, 溴酚蓝 蛋白酶:,; 甘油:,。 ..主要溶液配制 ?溶液 ?充分溶解于约 使. 中,加浓盐酸调值至.后定 容至,高压灭菌后室温保存。 . 溶液 在中加入. ,用调值至.后定容至,高压 灭菌后室温保存。 缓冲液 在 ?中加入 配置溶液,高压灭菌后室温保存。 电泳缓冲液: 在烧杯中加入碱.,再称取 .或?固体 .,加入适量后搅拌至完全溶解,加入冰乙酸并充分混匀,定容 至后调节值至.,室温保存。 上样缓冲液 在 ,.中加入约超纯水,加入%溴酚蓝 及丙三醇,调节至.,定容至,保存。 第二部分试验部分 蛋白酶溶液 将蛋白酶溶于超纯水配制至/浓度,以离心管分装后 保存于.?。 .试验方法 .引物设计与合成 小鼠基因序列中含有开放阅读框,能够编码.个氨基酸,这一 序列的蛋白高度保守,其顺式作用元件成为基序,在小鼠基 因的所在外显子能够编码的个氨基酸,这段蛋白质的中间区域就是 基序,其对应模板即为基因的核心序列;而基因为染色体 耦联锌指蛋白,位于哺乳动物染色体上,含有个锌指结构,其中包含 一个结合位点及一个核定位序列,其表达亦具有高度保守性。 . 本试验从中检索不同品种小鼠的、基因序列,应用 及.进行引物设计与分析,自主设计用于胚胎性别鉴定两个基因的引物: 引物:基因,产物长度,为雄鼠特有。 ’.几’ ’..’ 引物:锌指结构基因,产物长度,为雌鼠与雄鼠所共有。.’ ’.?.’ .小鼠基因组的制备 将已知性别的昆白小鼠颈椎脱臼处死,常规外科手术方法剪取肝脏组织块, 剪碎研磨后放入离心管,离心后倒弃上清液,使用离心柱型动物基 因组提取试剂盒进行如下操作步骤提取小鼠肝脏组织 ?在离心管中加入.缓冲液,震荡至彻底悬浮; ?加入.蛋白酶溶液,混匀后水浴.至组织裂解,每小时颠倒 混匀.次,水浴后高速简短离心: ?加入缓冲液,混匀后水浴至溶液清亮,取出水浴锅 后高速简短离心: 两南大学硕士学何论文 ?加入无水乙醇,震荡混匀后简短离心; ?将所得溶液及白色絮状沉淀加入套有收集管的吸附柱,离心, 弃去收集管中废液; ?向吸附柱中滴加缓冲液, 离心,弃去收集管中废 液; ?向吸附柱中滴加漂洗液, 离心,弃去收集管中废 液;重复此步骤一次; ?将吸附柱连同收集管离心,弃去收集管中废液;将吸附柱 置于室温; ?向上述吸附柱中央悬空加入 ,室温放置,离心, 使用离心管收集溶液,保存于.?备用。 . 引物合理性检测 采用自主设计的基因及基因引物,以上述步骤所得已知性别雄性及 雌性小鼠肝脏组织细胞总为模板进行体外扩增,反应体系及反应条件如下: 扩增体系: ; :引物 :山; 山:引物 ;模板:酶.:加 .补足 扩增条件:预变性?,变性?,:退火?,;延伸?, ,共个循环;?,,保存。 扩增产物以%琼脂糖凝胶电泳进行结果检测,观察第一对引物是否能够对雄 鼠肝脏组织基因组扩增出大小为的目标基因片段,对雌鼠肝脏基因组 织无特异性条带出现:同样,观察第二对引物是否能够对雌鼠及雄鼠肝脏组 织基 因组同时扩增出大小为的基因片段,并以此作为检测引物设计合理性 的标准。 .结果与分析 .小鼠基因引物设计合理性检测 采用自主设计基因引物对雄性小鼠及雌性小鼠肝脏细胞总模板进 行体外扩增,以%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果表明以雄性小鼠肝脏细胞 为模板可成功扩增出基因片段,,泳道,基因引物扩增产物长度 为处,与设想相符:以雌性小鼠为模板未见基因扩增产物, ,泳道,说明基因为雄鼠特有基因,引物特异性高、设计合理。 图 基凼引物对小鼠’细胞体外扩增结果.; 、、泳道为雄鼠基因扩增产物:: 铲,尹。: . 小鼠基因引物设计合理性检测 采用自主设计基因引物对雄性小鼠及雌性小鼠肝脏细胞总模板进行 体外扩增,%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果表明以雄性小鼠样本、、 、泳道及雌性小鼠样本、、泳道均能够扩增出基因片段, 基因引物扩增产物长度接近,与设想的大小相符,说明基 因为雌、雄小鼠所共有,引物特异性高、设计合理。 的。 图 摹凶引物对小鼠鲺胞体外扩增结果. 泳道为雄鼠摹闪扩增产物:.泳道为雌鼠摹冈扩增产物: 。 : “ : 两南大学硕十学位论文 . 双重鉴定小鼠肝脏细胞性别的研究 采用基因引物及基因引物对己知性别小鼠肝脏基因组进行体 外扩增,所得结果以%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果表明引物组对雄鼠基因 组扩增出约为的条带,即判断条带,雌鼠基因组扩增结果为空白,,, 泳道;引物组雄鼠雌鼠均扩增出约的条带,即内标条带,,, 泳道,说明成功建立了双重性别鉴定体系。 图双重对小鼠细胞体外扩增结果 . .泳道为雄鼠基因和基因扩增产物;.泳道为雌鼠基因扩增产物; ‘”; ””; : .讨论 .引物设计合理性对双重性别鉴定效果的影响 首先应当以具有性别特异性的基因序列作为模板设计引物,如本试验所用 基因具有雄性特异性,仅存在于染色体;其次为有效避免假阴性结果的产 生,提高反应灵敏度,设置了两套引物,而双重要求在同一反应体系 中对两个基因位点进行特异性扩增,因此应当充分考虑引物之间相关性及合理性, 引物间长度的差异、引物间退火温度的差异以及引物间的配对、竞争性扩增等因 素均有可能影响双重的扩增效果。本试验采用北京天根生物有限公司的商品 化离心柱型动物基因组提取试剂盒 提取小鼠肝脏组织基因组作 为模板。对已知性别小鼠肝脏组织基因组进行基因体外扩增后进行琼脂 糖凝胶电泳检测,能够成功地得到雄鼠的基因组相应条带,而雌鼠组织基因组没 有出现此扩增产物片段,从而证明引物的特异性很好。相应的,对已知性别小 第二部分试验部分 ?舅鼻曼?皇?皇皇量罾曼蔓?皇舅舅寡曼曼量寰曼曼皇皇曼曼量曼曼量曼量曼曼量曼曼曼舅鼍皇曼皇皇曼曼舅曼曼曼皇曼曼量皇曼曼曼曼舞 鼠肝脏组织基因组进行基因体外扩增,得出雄鼠和雌鼠都能够成功扩增得到 相应片段。从而证明基因为公母小鼠共有,说明引物同样具有良好的有效 性及合理性。 . 以小鼠肝脏组织基因组为模板的双重性别鉴定 目前小鼠早期性别鉴定的研究主要使用血液、组织基因组来进行引物合理性 的测定,其中肝脏组织基因组具有容易获取、提取方法成熟且模板量较大的 优点, 适于实验室操作;常规使用单一基因片段进行体外扩增,虽然可以减少体系 反应所需时间,但是其扩增灵敏度较低,模板量较少,在紫外灯下容易看不到扩 增带或扩增带太暗致使产生误判,而双重对小鼠早期胚胎性别鉴定的灵敏度 要高个数量级】,并且能够有效避免因为单一扩增基因丢失导致无法判断的现 象。 .小结 本试验根据性别鉴定法原理自主设计了的雄性特异性基因引物对 及雌雄性共有的基因引物对,并以已知性别小鼠肝脏组织基因组为模板进行 体外扩增,结果表明基因引物能够对雄性小鼠基因组扩增出大小为的 特异性条带,而基因引物对雄性及雌性小鼠总都能够扩增出大小为 的目标条带,说明两个引物对具备有效性及合理性。 西南大学硕士学位论文 试验二小鼠一细胞胚胎卯裂球的双重性别鉴定方法的研究 ..?一 日舌 ~ 技术应用于小鼠早期胚胎性别鉴定是由小鼠附植前胚胎中取出一定数量 的卵裂球进行鉴定,剩余卵裂球仍然能够经过胚胎移植得到后代,在所有的胚胎 性别鉴定的方法中,都对胚胎有或多或少的损害,如何降低对胚胎的损伤是每种 方法首要考虑的问题。因此,选择处于适宜发育阶段的早期胚胎及适宜的卵裂球 数量对于提高性别鉴定的准确性和维持剩余卵裂球组成胚胎的发育成个体的能力 具有关键性作用。本试验根据自主设计的两对特异性引物,以小鼠.细胞胚胎 作为模板进行体外扩增,并以电泳检查扩增结果,旨在探寻一种简便和可靠的双 重性别鉴定方法。 .实验材料 .实验动物 同试验一。 .实验仪器与设备 层流洁净室:级.级,绿叶空调净化有限公司; 无菌工作台:.标准型,绿叶空调净化有限公司; 电子分析天平:上海精天电子仪器厂; 调节计:梅特勒.托利多仪器上海有限公司; 超纯水纯化系统:超纯水纯化系统,,: 微孔过滤器: ., .美国公司; 拉针仪、煅针仪、磨针仪:,: .,: 体视显微镜:,倒置显微镜:重光,重庆光电仪器有限公司; .: 显微操作仪:, , 培养箱: .; 培养皿:塑料培养皿 ,: 玻璃培养皿,; 第二部分试验部分 净化立式自动电热压力蒸汽灭菌器:一,上海申安医疗器械厂; 电热恒温干燥箱:重庆银河实验仪器有限公司; 电热恒温水浴锅:.型,上海精宏实验设备有限公司; .主要药品、试剂和溶液配置 ..主要药品与试剂 孕马血清促性腺激素粉剂宁波激素制品厂: 人绒毛膜促性腺激素粉剂:宁波激素制品厂; 透明质酸酶:,: 链霉蛋白酶:,; 石蜡油 :,; 乳酸钠 :,: 氯化钾:,: 氯化钠:,: 氯化钙:,: 丙酮酸钠 :,: ’ 七水合硫酸镁?:,: 亚磷酸:,: 六水合氯化镁?:,: 碳酸氢钠:,; :,; . 二甲基亚砜:,; : .:, : 硫酸链霉素 ,: 青霉素钾盐 :,: 谷氨酰胺:,: ; :, 葡萄糖:,。 ..主要溶液配制 操作液 西南大学硕士学位论文 表 操作液的配方 将以上配方按顺序加入定量超纯水并搅拌至充分溶解,调节至...之间, 以微孔滤器过滤分装,保存备用。 培养液 粉末一袋加 .,以超纯水溶解后定容至,调 至...,使用.微孔滤器过滤除菌分装,。冰箱保存。 .试验方法 .小鼠.细胞胚胎的获取 将.周龄处于发情前期的健康雌性昆明小鼠经腹腔注射 /只, 后同样方式注射 /只,注射后与单独饲养的雄鼠进行合笼,次日早 晨检查雌鼠阴道栓,按照见栓时间计算为.胚龄,当胚龄达到.时将小鼠进 行颈椎脱臼处死。常规外科方法无菌摘取小鼠子宫,置于.中清洗数遍后放 入培养液进行显微操作。在体视显微镜下使用眼科剪去置于附着脂肪及韧带 后 摘取一段子宫,插入针头冲出受精卵,将所得小鼠早期胚胎细胞以操作液漂 洗 数遍后放入、%的饱和湿度培养箱中备用。 第二部分试验部分 .小鼠.细胞胚胎卵裂球的获取 将上述.细胞胚胎置于.%链霉蛋白酶微滴中于?处理,待观察到透 明带分层膨胀后即以内径略小于透明带的口吸管轻轻吹打至透明带脱落,将 所得 胚胎细胞移入操作液,小心清洗后轻轻吹打松散的卵裂球,每个.细胞胚胎吸 取个卵裂球作为一组,漂洗后移入培养液编号待用;剩余卵裂球相应编 号,放入培养液并覆盖石蜡油,于‘、%的饱和湿度培养箱中培 养并观察其发育情况。 .小鼠早期胚胎的提取 将上述步骤得到的样本卵裂球移入管中,加入 后以此石蜡 油覆盖。盖紧管并做好记号,放入恒温水浴锅煮沸后,放入冰水,.? 冰箱冰浴,取出管擦干附着水滴,高速离心,上清液直 接用于扩增或.?保存备用。 .小鼠.细胞胚胎卵裂球的双重性别鉴定 将.所提取小鼠附植前.细胞胚胎卵裂球样本用于扩增。 反应体系为:’ .; ; .; ;引物 :引物 .;胚胎样本;酶.。 反应条件为:预变性?,;变性?,;退火?,;延伸?, ,共个循环;延伸?,,保存。扩增结束后取产物在.% 琼脂糖电泳上电泳检查结果。 .结果与分析 .小鼠.细胞胚胎卵裂球的体外培养 由早期胚胎取出一定数目的卵裂球不会影响移植胚胎发育至个体的能力,取 出的卵裂球亦具有发育全能性,并与供体胚胎具有基因型的一致性,因此对 细 胞系的建立具有重要意义,有研究报道,以小鼠.细胞胚胎分离的卵裂球用于 细胞系的建立获得了.%的成功率。本试验对小鼠.细胞吸取个卵裂球后剩 余的个胚胎做了相应编号,单独放入培养液并覆盖石蜡油,于?、% 的饱和湿度培养箱中培养,结果有组卵裂球继续发育至桑葚胚,其发育率为 .%。 .小鼠.细胞胚胎卵裂球的性别鉴定 两南大学硕士学佗论文 试验对枚小鼠附植前胚胎进行了性别鉴定,双重扩增结果表明枚 为雄性胚胎,枚为雌性胚胎,枚因条带缺失无法进行性别判断,性别检出率 为.%。结果如图所示,、、泳道为雄性胚胎,、、、泳道为雌性 胚胎,泳道未扩增出片段。 图舣鱼对小鼠细胞胚胎体外扩增结果.; 、、泳道为雄鼠基因和基因扩增产物;、、、泳道为雌鼠基因扩增产物; 嘶, ; ,, ; 泳道未扩增出片段: :.讨忿 . 反应体系及反应条件对性别鉴定效果的影响 双重性别鉴定过程中孑浓度、量、反应体系等因素都是体外扩增 反应中影响较大的因素。在反应体系中孑浓度过高或是过低,都不能得到目 的片段,或是得到大量非特异性片段【】;引物浓度过高,容易产生非特异性扩增 产物,且可能形成引物二聚体,引物浓度过低则会降低的反应效率;两对引物 之间要有较好的协调性,退火温度应尽量接近,其扩增产物大小应当有一定差别, 以便进行电泳时检测扩增结果时能够产生清晰的,有一定距离的条带,以便于判 聚合酶在热稳定性、扩增 断。在标准化相同的条件下,不同来源 效率、扩增片段的长度和保真度上都存在差异,对双重套式灵敏度影响很大 瞰。因此在使用双重进行微量扩增时, 需要选用质量好、热稳定性高的酶, 酶。 并避免使用不同来源的 . 胚胎因素对双重性别鉴定效果的影响 胚胎的发育阶段、用于扩增的模板量等因素都影响着双重性别鉴定效果。第一部分试验部分 有研究表明雄性胚胎扩张囊胚检出率最小,与紧缩桑椹胚到早囊胚阶段以及囊胚阶 段相差显著,雌性胚胎扩张囊胚阶段检出率稍多,与囊胚阶段相差显著,与紧缩桑 椹胚到早囊阶段差异极显著,但紧缩桑椹胚到早囊阶段与囊胚阶段不存在明显差异。 在胚胎进一步发育以后,无反应的比例相对下降,紧缩桑椹胚到早囊阶段的无 反应率呈最大,与囊胚阶段有显著差异,但与扩张囊胚阶段不存在明显差异,扩张 囊胚阶段与囊胚阶段无显著差异汹。在对早期胚胎取样胚胎过程中应当选择胞质均 匀、轮廓清晰的胚胎。此外,用于体外扩增的模板量会影响体外扩增准确率, 许多相关实验都对此进行了探讨。使用单个卵裂球进行扩增极易出现污染,卵裂球 转移过程中容易丢失,有可能所取细胞不代表最终发育的细胞核型嘞,甚至有可能 是极体哺力,因此模板量过少漏检率会偏高,在一定范围内,作为模板的卵裂球个数 越多,有效检出率就越高,污染和漏检越少,当卵裂球个数为个以上时,有效检 出率能够达到%】。另有研究表明单卵裂球的检出率比双卵裂球检出率低啷。 但是由于卵裂球的提取过程会在一定程度上对胚胎产生影响踟,并且在同一反应体 系中可能产生竞争性反应,活检胚胎细胞取样个数大于个时会对胚胎造成较大伤 害,导致一直妊娠率低【】,因此希望利用尽可能少的模板来进行性别鉴定。即使在 最适模板量下进行处理,抽提不干净或发生降解都会导致扩增部分条带不清 晰,对性别鉴定产生影响【.。本试验从.细胞中选取个卵裂球作为模板 对小鼠早期胚胎进行性别鉴定,得到了.%成功率。 .其他 胚胎的吸取可通过机械、化学和激光方法实现,其中化学法经济适用,对胚 胎伤害较小。在胚胎切割过程中应当特别注意无菌操作,不但应当保证工作环境、 胚胎培养液、操作液的清洁程度,在卵裂球取样过程中也应当严格防止样品间交 叉污染。本试验采用小鼠早期胚胎进行细胞鉴定,在卵裂球吸取过程中需要尤其 注意不能丢失或吹散卵裂球,有研究发现吸取卵裂透明带过程中透明带粘附或是 残迹混入样品会导致反应率显著