左归丸加减方对谷氨酸诱导的体外培养大鼠小脑颗粒神经元凋亡影响

左归丸加减方对谷氨酸诱导的体外培养大鼠小脑颗粒神经元凋亡影响 左归丸加减方对谷氨酸诱导的体外培养大 鼠小脑颗粒神经元凋亡影响 第9卷第5期 2003年1O月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.9.No.5 Oct.,2003 ? 药效? 左归丸加减方对谷氨酸诱导的体外 培养大鼠小脑颗粒神经元凋亡影响 张涛涛,苏兴文,江伟健,黄奕俊,邱鹏新,颜光美 (中山大学医学院药理教研室,广东广州510080) 摘要:目的:研究左归丸加减方对谷氨酸引起的体外培养的小脑颗粒神经元(CGNs)兴奋毒性死亡是否有抑制作用及其可 能的分子机制.:采用二乙酸荧光素(PDA)和Hoechst33258DNA 染色法,观察神经元存活率及形态学特征,用琼脂糖凝脉 电泳分析神经元死亡的生化特征.结果:300panol?LI1谷氨酸可引起体外培养的CGNs调亡,左归丸加减方水提物(ZGP)可以剂 量依赖地阻断谷氨酸所致的CGNs调亡.PD98059可以阻断谷氨酸 的诱导CGNs调亡作用,协同ZGP的抗谷氨酸诱导CGNs调 亡作用.LY294002可以阻断ZGP的抗谷氨酸诱导CGNs调亡作用. 结论:ZGP对谷氨酸诱导的体外培养的大鼠CGNs调亡有保 护作用,PD.K/Akt信号传导通路可能参与其作用. 关键词:左归丸;小脑颗粒神经元;凋亡;分子机制 中圈分类号:R285.5文献标识码:B文章编 号:1005.990312003)05.0015.04 ZuoguiPillProtectsRatCerebellarGranuleNeuronsFromApoptosisInducedbyGlutamate ZHANGTao-tao,SUXing-wen,JiangWei-jian,HUANGl,QIUPeng-xin,YANGuang-mei (DepartmentofPharmacologyMedicalSchoolofSunYat-senUniversity,Guangzhou510089,China) Abstract:OBJECT? ETostudywhetherZGPcanpreventcerebellargranuleneuronsfromapoptosisinducedbyglu— t~nmteanditspossiblemolecularmechanisms.METHODSnleneuronswerestainedwithfluoresceindiacetatetoobserve theirsurvivalrateorstainedwithHoechst33258toanalyzetheirnuclearmorphology.IntemucleosomalDNAfragmentation ofneuron8wasanalyzedwithagarosegelelectrophoresis.RESULTSZGPco uldincreasethesurvivalrateofcultured CGNSsinthemediumcontaining300ttmol?L, dependendy,andcouldpreventtheneuronalnu— glutamateconcentration— cleifromshrinkage,condensationandcleavageandnuclearDNAfragmentationinducedbyglutamate.LY294002sup- pressedtheprotectiveeffectofZGP,PD98059wasabletoblocktheexcitotoxinofglutamate.CONCLUTIONZGPprotect- edratCGNsfromappoptosisinducedbyglutamateandthiseffectwaspostulatedtodependentPI3?-K/Aktsignalingpath?- way? Keywords:ZuoguiPill;cerebellargranuleneurons;apoptosis;molecularmechanisms 谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质 之一,在维持神经系统的正常生理功能中起着重要 作用,越来越多的实验证据明谷氨酸兴奋毒性作 用与神经退行性病变和急性神经系统损伤等神经系 统疾病有关.谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元 (CGNs)凋亡与神经元的密度,状态密切相关?.】.我 们的实验发现,300ptmol?L的谷氨酸能诱导大鼠小 脑颗粒神经元(体外培养8天,密度为3×l0s个细胞 ?cm)凋亡.本研究应用原代培养的小脑颗粒神经 元,观察左归丸加减方水提液对谷氨酸引起的小脑 收稿日期:2003-01-07 基金项目:国家杰出青年基金资助项目(39625022) 颗粒神经元兴奋毒性死亡的影响,并探讨其可能的 分子机制. 1材料 1.1有效成分提取左归丸加减方由熟地(Radix Rehmanniae),山药(RhizomaDioscoreae),三七(Panax nowginseng(Burk.).F.H.Chen),枸杞(FructusLycii), 山茱萸(Comus砑删Sieb.etZucc.),菟丝子 (Cuscutachinensisl_am.),鹿角胶(CollaComusCer. vi),龟板胶(CollaPlastriTestudinis)组成,比例2:1: 2:1:1:1:1:1,药材来源市售,经广东省药材公 司鉴定,本室自制水提液.药材经高速粉碎机粉碎, 按一定比例加入适量蒸馏水,浸泡搅抖过夜,4OO0转 ? 15? 第9卷第5期 2003年l0月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedic8lFormulae Vo1.9.No.5 Oct..2003 ?min(rpm)离心30rain,取其上清液减压浓缩至原 体积的1/10,16000rpm离心40min,将上清液冰冻干 燥得黄褐色提取物,左归丸水提取物(LWE)纯度为 187.2mg?g千重.用时以25mlKCIBME培养基溶 解,0.2ttm微孔滤器过滤除菌,分别以250mg?L,, 500mg?L一,750mg?L,,1000mg?L浓度行实验. pH值范围7.25—7.32,渗透压范围300,308m0sm? (KS?H20)一. 1.2主要试剂Glutamate购于RBI(USA),二乙酸 荧光素(r~OA),Hoechst33258,胰蛋白酶,胰酶抑制剂, 阿糖胞苷,多聚赖氨酸,庆大毒素,溴化乙啶购自美 国Sigma公司;胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公 司;BME培养基购自Gibco公司;脱氧核糖核酸酶I (DnaseI)琼脂糖购自德国BoeuringerMannheim公 司;PD98059,LY294002购自美国NEB公司;DNA分 子量DI2000购自日本YakaraBiotech公司;其余 试剂为国产分析纯. 1.3动物新生7,8天的清洁级SD大鼠,雌雄不 分,体重15,20g,由中山医科大学实验动物中心提 供. 1.4主要仪器瑞士LKB公司产Bromma水平电泳 仪;日本Olympus公司荧光倒置显微镜;英国Uvitec 公司凝胶图象分析仪 2方法 2.1原代大鼠CGNs培养及凋亡模型的建立按 yan等的方法],取出生后8d的SD乳鼠制备小脑颗 粒神经元,解剖并分离小脑,在胰酶和DnaseI的作 用下分散细胞,铺板于多聚赖氨酸预处理的塑料培 养板,细胞密度为3×105个细胞?em,,培养液为 BME(Gibco),其中含10%热灭活胎牛血清,0.1mg? L庆大霉素,2mM谷氨酸和25mMKCI.接种24小 时(h)后,加入阿糖胞苷至10ttM抑制非神经元细胞 的生长和增殖,使CGNs的纯化率在95%以上.培 养第6天加入葡萄糖至5mM补充细胞代谢所需能 量,此后每隔4天加1次. 2.2FDA染色神经元存活率测各因素处理后, 将培养基移去,用含ca2,MS的4~CPBS洗1次,迅 即加入10mg?L-1二乙酸荧光素避光孵育5min,再用 含Ca2,Mg2的4~CPBS洗1次,吸干,在荧光显微镜 下观察,每孔随机选3个视野拍照.FDA是脂酶的 底物,被活神经元摄取并代谢后,受到波长450, 490rim的蓝光激发,可释放波长520nm的绿色荧光, 而死亡细胞失去代谢活性,在视野中黯淡无光.存 ? 16? 活率的计算按以下:存活率(%)=(实验组活细 胞数,对照组活细胞数)×100%. 2.3DNA凝胶电泳带型分析各因素处理后,将 培养基移去,用元Caz,MS的4cI=作用15min,收集 裂解液,以15000g4~C下离心15min上清依次用等体 积的酚,酚,氯仿抽提,再加入0.3M醋酸钠及等体积 异丙醇,充分混匀,于一20?下过夜后以150o%4? 离心20rain,移去上清,沉淀自然风干后用30含 50rnl?LRNASEa的TE溶解,置37?作用30rain,样 品在含0.5mg?L溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶中 以100V电泳后于凝胶成像仪中观察拍照.正常神 经元DNA链完整,不能通过TritonX一100的打孔被抽 提出来,而凋亡中的神经元DNA链以核小体为单位 被切割降解,通过膜上穿孔被抽提出来以后在凝胶 泳道上呈现180bp为间隔的梯状DNA电脉带型. 2.4Hoechst33258核染色形态学观察各因素处 理后,将培养基移去,用含Ca2,Mg的4~CPBS洗1 次,迅即加入4%多聚甲醛在4?下固定20min,移去 固定液,再用双蒸水洗1次,置4~C下自然晾干后加 入5mg?LHoechst33258染色10min,再用双蒸水洗2 次,晾干后于荧光显微镜下以察并拍照.Ho. eehst33258是一种DNA荧光染料,可以插入并结合 于DNA链的A.T区,受到波长200,300nm的紫光 激发,可释放波长420nm的蓝色荧光,正常神经元核 内DNA分布相对均匀,核无固缩,故在神野中呈现 体积较大的浅染核形态,而凋亡中的神经元其核内 DNA浓聚,核出现不同程度的固缩,故呈现体积明显 缩小的深染核形态. 2.5统计学方法:数据以土s表示,比较用t检 验. 3结果 3.1ZGP对谷氨酸作用的CGNs存活率的影响 DIV8的CGNs在去极化条件下(25mMKCI)生长良 好,相差显微镜下见神经元胞体饱满透亮,突起之间 形成的网络清晰而完整.给予300t~mol?L谷氨酸, 24h后用相差显微镜观察,发现大部分神经元胞体 明显缩小,细胞核固缩,轴突及树突断裂或消失.如 给予谷氨酸同时还给予ZGP,24h后,相差显微镜观 察显示ZGP可浓度依赖性地抑制谷氨酸引起的神经 元胞体缩小,神经元生长良好.FDA染色神经元存 活率测定示DIV8的原代培养大鼠CGNs经300t~mol ? L谷氨酸作用24h,神经元存活率降至22.1%? 3.3%,以其为对照,给予谷氨酸同时再加入ZGP,神 第9卷第5期 2003年l0月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.9.No.5 0ct..2003 经元存活率随ZGP浓度的增加而逐渐增高.自 500mg?L组开始差异有统计学意义(P<0.01). 250rag?LI1组为27.1?7.5%,500mg?L..组为49.4? 6.8%,750rng?L组为59.6-I-3.2%,1000rng?L组 为75.9?5.9%. 3.2神经元凋亡的细胞核形态学检测Hoechst 33258荧光染色结果显示,300ptmol?L谷氨酸可使 CGNs细胞核明显固缩,凝聚和断裂说明发生凋亡, 如谷氨酸作用同时应用ZGP,可见随着用药浓度的 加大,具有凋亡核典型特征的细胞明显减少.说明 ZGP对谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡有剂量依 赖的保护作用. 3.3ZGP对谷氨酸作用24h的CGNsDNA核小体间 降解的影响(图1)DNA在特定的位点被切割成大 小不同的片断,在凝胶电脉图上呈现”阶梯状”条带 是细胞凋亡最主要的标志.收集给药后24h的细 胞,按前文方法提取DNA,进行琼脂糖凝胶电泳.结 果显示,正常神经元的凝胶泳道上未见小分子量条 带,而大分子量条带的信号也很微弱,说明其DNA 链完整,其细胞没有发生凋亡;谷氨酸300~mol?L 作用24h,凝胶泳道上出现了约180bp为间隔的小分 子量条带,形成连续的梯状带型,其信号也急剧增 强.如果在谷氨酸作用的同时给予ZGP,自500mg? L开始,随ZGP浓度的增加,DNA连续梯状带逐渐 减弱,大分子量条带的信号也逐渐减弱,ZGP浓度为 盈1zGP对答氨叠诱导的DNA核小体问降解的影响 M:以bp为单位的DNA分子量标准;A:300V.raol?L谷氨酸;B: 25m咖l?LK;C:300vaml?L谷氨酸+250rag?L,ZGP;D: 300t,,,,ol?L谷氨酸+.500rag?L,ZGP;E:300ttmol?L谷氨酸+ 75Omg?L_.ZGP;F:300tanol?L谷氨酸+l(1(IOmg?LzGP;G: 5Ottmol?L一PD+25mmol?L一K;H:5Ottmol?L一PD+300ttmol?L一 谷氨酸+1000mg?LI1zGP;I:20tanol?LI1LY+25retoo1.L-1K’;J: 20ttmol?LLY+300tnnol?L谷氨酸+1000rag?LZGP 1000rag?L时,凝胶泳道的条带来正常神经元的条 带十分相似.说明300t~mol?L谷氨酸作用24h诱 导小脑颗粒神经元发生凋亡,ZGP对谷氨酸诱导的 小脑颗粒神经凋亡有剂量依赖保护作用. 3.4PD98059对ZGP作用的影响PD98059为胞 外信号调节激酶(EaK)1/2上游激酶丝裂原激活的 蛋白激酶(MAPK)/ERK激酶1的特异抑制剂.使用 PD9805950#M预孵30rain,可阻断谷氨酸的兴奋性 毒性,抑制谷氨酸诱导的神经凋亡和协同ZGP (1000rag?L)的抗凋亡作用.表现为存活率明显升 高(分别为80.0?9.7%,83.6?9.4%,P均<0.01), Hoechst33258染色具有典型凋亡核特征的细胞减 少,DNA凝胶电脉未见明显梯状带. 3.5LY294002对ZGP作用的影响LY294002为 Akt上游激酶磷脂酰肌醇3.激酶(PI3.K)的特异抑制 剂.LY29400220/~M预孵30rain,不影响谷氨酸的兴 奋性毒性(存活率21.3?3.2%),但可阻断 ZGP10OOmg?L保护谷氨酸诱导的CGNs凋亡,存活 率明显降低(52.7?8.9%,与ZGP10Omg?L组比,P <0.01),Hoechst33258染色也可见具有凋亡典型核 特征的细胞,DNA凝胶电泳有明显梯状带. 4讨论 谷氨酸是脊椎动物中枢神经系统的主要兴奋性 递质,参与许多重要的生理功能.然而其浓度的异 常增高则会产生兴奋毒作用,最终导致神经元的死 亡,谷氨酸诱导的神经元兴雷性毒性死亡与众多中 枢神经系统疾病的发生,发展有密切关系,如中风, 癫痫,阿尔茨海默氏病及帕金森氏病?]. 在本实验中,DIV8的原代大鼠CGNs在含 300/~mol?L谷氨酸的25mmol?LK培养基中培养 24h,Hoechst33258染色显示染色体固缩,DNA凝胶 电泳显示明显的DNA”梯形”条带,提示在含300ptmol ? LGlutamate的高K培养基培养下主要引起小脑 颗粒神经元凋亡.我们的实验结果表明,ZGP对 300p~mol?L谷氨酸诱导的CGNs有浓度依赖的保护 作用. 研究表明Apaf-1(apototicproteaseactivatingfactor 1),PI3.K/Akt,Bcl,2家族和Caspase家族等信号分 子参与早期神经元凋亡的调控.另外,凋亡信号分 子的作用亦具有相对性.不同细胞类型受到同种刺 激诱导的凋亡,可能由不同胞内信号传导;不同刺激 在同一细胞诱导的凋亡,其胞内信号传导也差异甚 大;同一种信号分子可能在某种情况下传递存活信 号,在另一些场合又传递凋亡信号].ERK1/2的 激活可介导脑源性神经生长因子(Brain—derivedneu. mtmphicfactor,BDNF)和PACAP-38(pituitaryadenylate cyclaseactivatingpeptide.38)抗低钾诱导的CGNs凋 亡,另一方面,ERK又介导谷氨酸的兴奋性毒性诱导 的细胞凋亡.尚未发现Akt介导凋亡信号的传 ? 】7? 第9卷第5期 2003年lO月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.9.No.5 Oct.,2003 导n.’”.引.在本文的研究中,我们也发现了上述类 似的现象,以谷氨酸诱导的CGNs凋亡是经过MEIO ERK传递的信号,所以50tsmol?LPD98059可阻断 谷氨酸的兴奋性毒性,协同ZGP的神经元保护作用. 20ttmol?LLY294002抑制ZGP抗谷氨酸诱导的 CGNs凋亡,提示ZGP对谷氨酸诱导的CGNs凋亡的 保护作用可能是通过PI3.K/Akt信号转导通路起作 用. 参考文献: ChoiDW.Glutamateneurotoxieityanddiseasesofthener- VOU8system[J].Neuron,1989,1:623—634. ~rOltlaM,DypbuktJM.Glutamate-inducedneuronal death:asuccessionofnecrosisorapoptosisdependingonmi— 973. tochondrialfunetion[J].Neruom,1995,15:961— YanGM,LinSZ,Irwinlip,eta1.ActivationofGproteins bidirectionallyaffectsapoptosisofculturedeerebellargranule neurons[J].JNeurochem,1995,65(6):2425—31. 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