克罗米芬柠檬酸钠导致斑马鱼颅面部发育异常研究（可编辑）

克罗米芬柠檬酸钠导致斑马鱼颅面部发育异常研究（可编辑） 克罗米芬柠檬酸钠导致斑马鱼颅面部发育异常研究 华中科技大学 硕士学位 克罗米芬柠檬酸钠导致斑马鱼颅面部发育异常的研究 姓名:陈曦 申请学位级别:硕士 专业:卫生检验与检疫 指导教师:徐顺清 2011-01 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 克罗米芬柠檬酸钠导致斑马鱼颅面部发育异常的研究 硕士研究生:陈曦 指导老师 :徐顺清 教授 中 文 摘 要 出生缺陷被定义为一种先天性的新生儿的形态结构异常、生理功能异常或代 谢缺 陷,形态结构异常现为先天畸形。据估计, 大约有百分之三的美国新生儿 被诊断为 先天畸形。 内科医生使用很多不同种类的药物用于治疗女性不孕,包括芳香酶抑制剂、 二甲 双胍、促性腺激素释放激素受体激动剂或拮抗剂, 雌激素和孕酮,尽可能帮助不孕的 夫妇孕育生命。与此同时,这些药物对新生儿的致畸作用也越来越引起人们的关注。 克罗米芬柠檬酸钠是治疗女性不孕的常用药物。克罗米芬柠檬酸钠是两种异构体 组成的外消旋体混合物。对于克罗米芬柠檬酸钠致畸毒性的研究结论一直存在很大争 议。一些研究显示服用克罗米芬柠檬酸钠可以增加新生儿患神经管缺陷(NTD)的概 率。然而,另一些研究的结论则表明孕妇服用克罗米芬柠檬酸钠和新生儿先天畸形不 存在显著性联系。 以斑马鱼作为模型研究药物发育毒性是一种新型的评价药物发育毒性的。斑 马鱼具有其他体外细胞实验和动物模型所不能比拟的优势。首先,斑马鱼胚胎发育早 期过程对于外界环境物质非常敏感。因此斑马鱼胚胎可以用于评价药物和环境毒物的 发育毒性。并且,斑马鱼胚胎实验被认为是一种无痛的在体实验,不会受到伦理方面 的限制。更重要的是,斑马鱼基因组与人类基因组高度同源,而且斑马鱼有与人类类 似的解剖学和生理学特征,对外源性化学物质的反应也与人类非常相似。斑马鱼的形 态学特征也使得其成为发育毒性研究的首选。斑马鱼胚胎透明,实验中可以直接观察 胚胎发育的各个时期。昀后,斑马鱼实验费用低,样本量大,实验耗时也大大减少。 斑马鱼为模式生物应用于药物毒性试验和前期筛选越来越广泛,本文以斑马鱼为 模式生物,研究克罗米芬柠檬酸钠导致斑马鱼颅面部发育畸形的机制,同时也期望建 1华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 立一种用斑马鱼模型简便预测药物发育毒性的方法。 第一部分 以斑马鱼为模式生物预测克罗米芬对哺乳动物的毒性 目的:研究克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼的半数致死浓度,评价斑马鱼模型对哺乳 动物毒性数据预测的准确性。方法:采用寇氏法计算克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼的 LC50值, 将所得结果与哺乳动物的半数致死量进行线性回归分析。 结果:测定得克罗 米芬柠檬酸钠对斑马鱼的LC50值为364.18 mg/L。且与大鼠的LD50值存在 线性关系。 结论:斑马鱼作为动物模型分析药物毒性,所需药物量少,且对哺乳动物的LD50具有 良好的预测性。 关键词:克罗米芬柠檬酸钠;斑马鱼;寇氏法;LC50 第二部分 克罗米芬柠檬酸钠导致斑马鱼发育毒性的形态学变化 目的: 利用斑马鱼作为模式生物在形态学试验中的优势, 研究克罗米芬柠檬酸钠 对于斑马鱼胚胎发育的致畸毒性, 以期得到较为直观的发育毒性效应。 方法: 斑马鱼 胚胎分为4组, 分别为对照组, 浓度50,100,200 mg/L 克罗米芬柠檬酸钠实验组, 药 物作用至受精后72小时停止。分别计算各组胚胎的孵出率,存活率,畸形率和心率; 体视显微镜观察形态学变化, AO染色和Alcian-Blue染色后观察斑马鱼胚胎及幼鱼颅面 部软骨发育异常和细胞凋亡情况。 结果: 相比于对照组, 实验组的斑马鱼胚胎的孵出 率, 存活率, 畸形率和心率均发生改变,200mg/L 实验组中畸形率高达46?5.4%,而对 照组的畸形率只有4.7?1.8% ; 体视显微镜观察显示实验组斑马鱼胚胎发育形态学都有 所改变,200 mg/L 实验组畸形最为严重;AO 染色显示50 mg/L 和100 mg/L 实验组细胞 调亡现象并不明显;200mg/L 组有细胞凋亡现象发生;Alcian-Blue 染色显示实验组斑 马鱼颅面部软骨发育异常。 结论: 克罗米芬柠檬酸钠可以导致斑马鱼胚胎发育过程中 软骨发育异常, 并在药物浓度较高时有细胞凋亡现象发生。 因此克罗米芬柠檬酸钠可 能与斑马鱼胚胎发育畸形相关。 这一结论与应用其他模式生物进行克罗米芬发育毒性 2华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 研究所得结论相一致。 因此, 斑马鱼作为模式生物研究化合物的发育毒性, 结果直观, 便于观察,并具有良好的预测性。关键词:克罗米芬柠檬酸钠;斑马鱼;发育毒性;AO染色;Alcian-Blue 染色 第三部分 克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼颅面发育相关基因 表达的影响 目的:研究克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼颅面部发育相关基因表达的影响。同时也 希望以斑马鱼为模型,建立一种研究药物发育毒性的便捷方法。方法:斑马鱼胚胎分 为 3组,分别为对照组,克罗米芬柠檬酸钠 50,100mg/L实验组,进行作用至 受精后 48 小时停止。采用荧光定量 PCR 法对 fox1、mmp13、bmp2、msx1 和 p53 等与颅面 部发育密切相关的基因的表达变化进行测定。结果:与对照组相比,克罗米芬柠檬酸 钠作用后,fox1 mRNA的表达下降,并且在不同作用时间点呈现相同趋势;mmp13、 bmp2和 msx1 mRNA 的表达量升高,不同作用时间其变化趋势相同;p53 mRNA的表 达在药物作用 24小时后明显下降,在 48小时点表达有轻微上调,但与对照组相比不 具有显著性差异。结论:克罗米芬柠檬酸钠引起 fox1、mmp13、bmp2、msx1 和 p53 表达水平变化,斑马鱼颅面部发育异常可能与这些基因的表达失调有关。同时,斑马 鱼与哺乳动物的蛋白质结构功能的高度同源性,使得斑马鱼研究所得数据可以有效预 测研究药物对人类的发育毒性和药物安全性。 关键词:克罗米芬柠檬酸钠;斑马鱼;颅面部发育畸形;实时定量 PCR;fox1; mmp13;bmp2;msx1;p53 3华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Craniofacial Abnormalities in Zebrafish induced by Clomiphene Sodium Citrate Master candidate:Chen Xi Supervisor:Xu Shunqing Abstract A birth defect is defined as a major deviation from normal morphology or function that is congenital in origin. It is estimated that 3% of all newborns in the United States have a major structural malformation detectable at birthToday, physicians are using a wider variety of drugs including aromatase-inhibitors, metformin, gonadotropin releasing hormone agonist or antagonist, estrogens, and progesterone. As much as the desire to assist infertile couple to conceive is sincere, there is a concern that these treatments may be teratogenic to the newbornThe oldest compound for the treatment of ovulatory disorder has been Clomiphene Sodium Citrate CCIt is a racemic mixture of two stereoisomers. There is a always a debate on Clomiphene Sodium Citrate induced neural tube defect NTD in the offspringThe results have been mixed, some studies do show that Clomiphene Sodium Citrate is responsible for newborns’ abnormal development while others found no clear cluesUsing zebrafish as a animal model to investigate drug developmental toxicity provides a new way for assessing the developmental toxicity of exposure to toxicants during early-life stages. Zebrafish is considered as an ideal model for many incomparable advantages. First of all, fish embryonic development has been shown to be sensitive to environmental stress. Also, zebrafish embryo assays are also regarded to be pain-free in 4华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 vivo tests and are gradually being accepted as a good replacement for other types of animal experiments. The most important thing is zebrafish genome has the close homology with the human genome as well as physiological and anatomical similarities. When introduced to xeno-substances, zebrafish and mammals demonstrate a similar physiologic responseFurthermore, the biology and optical clarity of zebrafish embryos allows testing at all stages of embryonic development. Finally, zebrafish studies are costless, time saving with guaranteed large sample sizeApplication of zebrafish model in studying drug toxicity and initial screen is more and more popular. In this study, zebrafish was used as animal model to study the mechanism of Clomiphene Sodium Citrate induced abnormal craniofacial development. Also, we expect to establish a simple method for drug developmental toxicity assessment using zebrafish model Part ? Using zebrafish as animal model to predict the toxicity of Clomiphene Sodium Citrate to mammals Objective: To study LC50 value of Clomiphene Sodium Citrate on zebrafish embryo, and to evaluate the potential of zebrafish model to predict chemical toxicity on mammalsMethod: LC50 value was determined by using KARBER Method. Relationship between zebrafish LC50 value and LD50 values of other animal models was studied by using linear regression analysis. Results: LC50 value of Clomiphene Sodium Citrate on zebrafish was 364.18 mg/L. Linear regression analysis suggests there is a good linear relationship on LC50 values between zebrafish and other animal models. Conclusion: Using zebrafish as animal model to analyze the toxicity of compounds, which calls for little amount compounds, could be highly predictive of toxicity on mammalsKeyword: Clomiphene Sodium Citrate; LC50 value; zebrafish; KARBER Method5华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Part Clomiphene ? Sodium Citrate Induced Abnormal Craniofacial Development in Zebrafish Objective: Study the development toxicity of Clomiphene Sodium Citrate by taking advantage of morphological observation convenience of zebrafish model. We aim to get the direct evidence for abnormal development. Method: zebrafish embryos were divided into four groups: control group and three experimental groups with Clomiphene Sodium Citrate concentration of 50, 100 and 200 mg/L separately. Drugs were exposed until 72 hpfHatching rate, survival rate, malformation rate and heart rate of each group were determined; morphological changes were studied with stereomicroscope; abnormal craniofacial development and apoptosis were observed by Alcian-Blue Stain and AO stainResults: For The hatching rate, survival rate and the malformation rate of experimental groups have changed compared with control group. Among those changes, malformation rate was significantly increased. Malformation rate in 200 mg/L group was 46?5.4%, compared with 4.7?1.8% in the control. In AO stain experiment, there is no significant phenomenon of cell apoptosis in experimental groups with lower drug concentrationAlcian-Blue stain showed clear abnormal craniofacial development. Conclusion: Clomiphene Sodium Citrate could induce cell apoptosis in experiment group with high drug concentration. Also, it’s very clear that abnormal craniofacial development was induced by Clomiphene Sodium Citrate treatment. The data we got were highly consistent with those got from other animal models. Zebrafish can be an alterative animal model for rapid, directive and predictive drug toxicity assessmentKeyword: Clomiphene Sodium Citrate; zebrafish; abnormal craniofacial development; AO stain; Alcian-Blue stain6华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Part ? The Effect of Clomiphene Sodium Citrate on Expression of Craniofacial Development RelatedGenes mRNA in Zebrafish Objective: To study the effects of Clomiphene Sodium Citrate on expression of abnormal craniofacial development related genes in zebrafish. Zebrafish was used as model in this study. We expect to establish a simple method for gene expression analysis on chemicals induced developmental toxicity. Method: zebrafish embryos were divided into three groups: control group and two experimental groups with Clomiphene Sodium Citrate concentration of 50 and 100mg/L separately. Chemicals were exposed until 48 hpfReal-time PCR was used to detect the expression of craniofacial development related genes fox1, mmp13, bmp2, msx1 and p53 mRNA. Results: In Clomiphene Sodium Citrate 50 and 100mg/L groups, the mRNA levels of fox1 decreased compared with those of the control at both 24 hpf and 48 hpf time points; mmp13, bmp2 and msx1 mRNA were highly expressed in Clomiphene Sodium Citrate 50 and 100 mg/L groups; among 24 hpf and 48 hpf time points, the tendency of expression change remains the same; expression of p53 mRNA decreased at the 24 hpf time point in the drug treatment group; p53 mRNA expression slightly increased at 48hpf time point, but the change is not significantConclusion: Clomiphene Sodium Citrate changed the normal expression of fox1, mmp13, bmp2, msx1 and p53 and abnormal craniofacial development may be associated with changed gene expression. Because of the similiarity of protein structure and function between zebrafish and mammals, so data we got from zebrafish could provide a reliable way for assessment of drug development toxicity and safety screenKeyword: Clomiphene Sodium Citrate; zebrafish; abnormal craniofacial development; Real-time PCR; fox1; mmp13; bmp2; msx1; p53 7独创性声明 本人郑重声明,本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果的总结。尽我所知,除文中已经标明引用的外,本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切 法律后果。学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅 和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密? ,在_____年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“ ?” ) 学位论文作者签名: 指导教师签名:日期: 年 月 日 日期: 年 月 日华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 第一部分 通过斑马鱼半数致死浓度预测 克罗米芬对哺乳动物毒性 1. 前 言 斑马鱼是一种理想的脊椎动物模型,经常被应用于环境毒理、个体发育和药理学 [1] 研究领域 。斑马鱼的生命周期短,体外受精,生育能力强,胚胎体外发育,而且幼 [2] 鱼发育阶段身体透明,方便观察体内各器官和组织的发育 。因此,斑马鱼是一种快 速、低成本的毒理学研究动物模型,在生物医学研究领域起到了越来越重要的作用。 随着工业的发展和技术的进步,我们面临着数以万计的生物活性化学物质,包括 药物,杀虫剂,工业副产物以及工业垃圾。这些化学物质的低剂量毒性和不同化学物 [3] 质间的协同作用更使得它们的毒性复杂多样 。胚胎发育早期对这些化学物质的毒性 作用非常敏感,但是传统的哺乳动物模型无法研究胚胎在母体内发育阶段的 毒性。因 此,我们急需一种高效,精确和低成本的分析方法评价化学物质对于人类健康和环境 [4] 的潜在毒性作用 。 虽然,细胞实验可以为我们提供一条研究化合物毒性机制的方法,但是鉴于传代 细胞系和原代细胞的种类有限,而且细胞培养条件和体内环境存在差异,体外细胞试 验不能准确的反映化合物在生物体内的毒性机制。以模式生物为模型,研究化合物的 毒性,为我们提供了一种了解化合物在体内复杂毒性机制的方法。由于斑马鱼体型小、 [5] 产卵量大、胚胎透明、整个胚胎发育在母体外完成 ,同时斑马鱼作为脊椎动物,其 [6, 7] 基本的解剖结构和生理功能与小鼠和人类具有可比性 。因此斑马鱼对于研究发育毒 性有着天生的优势。 在这一部分,我们以克罗米芬柠檬酸钠为模式药物,通过对斑马鱼鱼卵染毒研究 克罗米芬柠檬酸钠的半数致死浓度。斑马鱼鱼卵染毒需要的药量少,试验的周期短。 而且相关的研究表明药物对斑马鱼的半数致死浓度和对哺乳动物的半数致死量存在 线性关系,可以通过测定出的药物对斑马鱼的半数致死浓度推知其对哺乳动物的半数 8 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 致死量,从而减少毒性试验中药物的消耗量。 2. 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 实验动物 性成熟成年 AB种斑马鱼共 120条,由中科院水生生物研究所提供。其中雌性 80 条,雄性 40条,体长 3~4 cm,最长体长和最短体长比小于 1.5。 2.1.2 动物饲料 薄片鱼粮(厦门福寿实业有限公司); 丰年虫卵(天津丹阳水产科技有限公司); 2.1.3 仪器 荧光倒置相差显微镜(Olympus BX51, 日本); XTS20型体视显微镜(北京泰科仪器有限公司); 生化培养箱(上海精密仪器仪表有限公司); 恒温水浴锅(常州国华电器有限公司); YX400全自动控制立式电热蒸汽消毒器(上海三申); Barnstead Nanopure DIamond超纯水系统(Thermo Scientific Inc.,美国); 2.1.4 试剂和耗材 克罗米芬柠檬酸钠(Sigma? Aldrich Inc.,美国); DMSO(Amresco Inc.,美国); 7 cm一次性培养皿(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司); 9 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 24孔板(Costar Inc., 美国) NaCl,KCl,CaC1,HEPEs等试剂均为市售分析纯。 2 2.2 方法 [8] 按照 OECD的斑马鱼 LC50测定的规范操作 [2] 2.2.1 斑马鱼饲养条件 饲养用水为暴晒并通气 24小时后除氯的自来水。斑马鱼饲养室控制温度在 28 ?C~29 ?C,斑马鱼饲养水温控制在 28 ?C。产卵前,雌、雄斑马鱼需分缸 饲养,每缸 加入 45 L水,饲养斑马鱼 30条左右。并通过控制饲养室内光照时间,控制 斑马鱼日 夜节律,每天光照时间 14小时。 保持鱼缸中饲养用水的清洁,第二次喂食后,虹吸出鱼缸中水的 1/3,并加入新 的饲养水。每三天清洁一次鱼缸。 2.2.2 斑马鱼饲喂斑马鱼喂食采用一日三次(8时、14时、19时)定时喂食,并交替饲喂薄片鱼粮 和丰年虫卵。饲喂量以鱼缸中的斑马鱼在 3分钟左右吃完饲料为宜。 薄片鱼粮可以直接饲喂斑马鱼,丰年虫卵需要孵化成幼虫后再饲喂。1 L饲养用 水中加入 20 g NaCl,然后加入 2 g丰年虫卵,将孵化器皿置于 28 ?C水浴中,持续通 气 24小时。停止通气 15分钟后,虹吸收集孵化出的丰年虫,待孵化的丰年虫卵将沉 积在容器底部。 2.2.3 鱼卵收集: [9] 用处理过的饲养用水配置斑马鱼林格尔液(38.7 mmol/L NaCl, 1.0 mmol/L KCl, 1.7 mmol/L HEPEs,2.4 mmol/L CaC1,pH 7.2)。斑马鱼林格尔液用于鱼卵和胚胎的 2 培养。 将收集的鱼卵用双蒸水清洗两次,分装在不同的 7 cm一次性培养皿中。在体视 10 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 显微镜下观察鱼卵,弃去未受精卵。 将盛有受精卵的培养皿置于 28.5 ?C生化培养箱中孵化。 2.2.4 测定克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼的半数致死浓度 (1)测定斑马鱼暴露于克罗米芬柠檬酸钠 96小时的最大安全浓度和 24小时的最小 100%致死浓度。 首先从 1 mg/L到 10 g/L以 10倍之差设置 5个不同浓度的试验组,并设置 DMSO 对照组, 6个组的 DMSO浓度均为 0.1%。分别将 40 mL作用溶液加入 7 cm培养皿中。 每个浓度组作用受精后 3小时左右的鱼卵 30枚,48小时更换一次新的作用溶液。每 日观察,并记录。 48小时前,每日记录孵出鱼卵的数量。未孵出的受精卵与正常孵化受精卵相比, 颜色呈乳白色且黯淡无光泽。在体视显微镜下观察,受精卵内细胞溶解并凝结,不存 在完整的细胞结构。 48小时到 96小时,可以通过体视显微镜观察斑马鱼胚胎的心跳,从而确定胚胎 是否存活。每组实验重复 3次。重复上述过程,并不断缩小最大和最小浓度差,从而 最终确定 96小时的最大安全浓度和 24小时 100%致死浓度。 (2)测定克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼的 LC50值 当最大安全浓度和 100%致死浓度确定后,在其之间设定 5个浓度组,5个组的浓 度呈倍数递增。配置各浓度组的克罗米芬柠檬酸钠溶液(其 DMSO浓度为 0.1%)。测 定 LC50时设定 9个组,分别为最大安全浓度组,100%致死浓度组和其浓度之间的另 外 5个浓度组,以及 0.1%DMSO对照组和双蒸水对照组。将各组溶液分别加 2 mL到 24孔板的孔中,每组溶液加 4个孔。每孔中加入受精 3小时以内的鱼卵 5枚。实验重 复三次取平均值。 2.2.5 统计学分析 实验结果用 Excel软件录入整理,采用 SPSS 13.0对数据进行统计分析。 11 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3. 结 果 3.1 克罗米芬柠檬酸钠 96小时的最大安全浓度和 24小时的 100%致死浓 度 (1)经过测定克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼 96小时的最大安全浓度为 10 mg/L。 (2)经过测定克罗米芬柠檬酸钠 24小时的 100%致死浓度为 1000 mg/L。 3.2 克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼的 LC50值 [7] 采用寇氏法计算克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼的 LC50值 。 剂量 mg/Ld LogdX 死亡数 死亡率(P) P^2 P-P^2 1000 3.00 20 1 1 0 450 2.65 7.3 0.36 0.13 0.23 220 2.34 4.7 0.24 0.06 0.18 100 2.00 2.3 0.12 0.013 0.10 45 1.65 0.7 0.04 0.0012 0.03 25 1.40 0.3 0.02 0.00023 0.01 10 1.00 0 0 0 0 LC50lg-1〔Xm-i(SP-(3-Pm-Pn)/4)〕(mg/L) Sx50=i*〔(SP-SP2)/(n-1)〕0.5 式中符号表示如下: Xm: 最大剂量组剂量的对数值 i: 相邻两组剂量(d)对数值之差 P: 各组动物死亡率,用小数表示 Pm: 最高剂量组动物死亡率,用小数表示 Pn: 最小剂量组动物死亡率,用小数表示 SP: 各组动物死亡率之总和 12 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 n: 每组动物数 Sx50: lgLD50的误 X50=lgLC50 经计算得 LC50364.18 mg/L 3.3 分析斑马鱼 LC50值和大鼠 LD50的相关性 通过检索 NIH TOXNET数据库得到克罗米芬柠檬酸钠对大鼠的腹腔注射的 LD50 [10] 为 530 mg/kg 。 [11] Parng 在 2002年发表的文章中给出了 18种化合物对于斑马鱼 LC50和大 鼠的 LD50,剔除其中大鼠非腹腔注射和偏差较大的数据,保留其中 11组数据。将 这 11 组数中斑马鱼 LC50和大鼠的 LD50分别取常用对数后,作回归分析。 图 1-1大鼠 lg LD50对斑马鱼 lg LC50的回归曲线图 (图中*为实验数据在回归曲线上的位置) 将测的斑马鱼 LC50值代入回归方程,可得大鼠 LD50的预测值。检索到的克罗 米芬柠檬酸钠对大鼠的 LD50值在预测值 95%可信区间内,可以认为实验所得的数据 点也满足回归曲线的条件。 13 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4. 讨 论 斑马鱼在发育毒性研究中具有独特的优势,斑马鱼体型小、产卵量大、胚胎透明、 整个胚胎发育在母体外完成,同时斑马鱼作为脊椎动物,其基本的解剖结构和生理功 能与小鼠和人类具有可比性。幼鱼在卵黄囊的营养物质的供应下,不需要喂食可在 96 孔板或 386孔板中存活 7天。斑马鱼幼鱼可以通过皮肤和腮吸收溶解于水中的小分子 物质。斑马鱼受精 72小时后可以吞咽,能够经口给药。此外,斑马鱼鱼卵染毒需要 的药量少,试验的周期短。相比来说,斑马鱼的胚胎和幼鱼提供了一种低成本、高效 的替代哺乳动物试验的方法。 [11] Parng 在 2002年发表的文章指出虽然斑马鱼相对于哺乳动物来说药物毒性更敏 感,但是不同化合物对斑马鱼的半数致死浓度和对哺乳动物半数致死量仍然具有可比 性。他在研究中测定了 18种化合物对斑马鱼的半数致死浓度,同时将半数致死浓度 与从 NIH TOXNET数据库中获得的大鼠腹腔注射半数致死量数据相比较,获得了比 较好的线性关系,说明药物对斑马鱼的半数致死浓度和对哺乳动物的半数致死量具有 [12] 可比性。2007年,Seng 的研究中将化合物的 LC50值和直接观察胚胎发育情况相结 合,通过这种可视化的方法来评估化合物的发育毒性,建立了一种基于斑马鱼的简单、 直观的发育毒性评价方法。 本部分实验测定得出克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼的半数致死浓度为 364.18 mg/L, 从 NIH TOXNET数据库检索得到克罗米芬柠檬酸钠对大鼠的腹腔注射的半数致死量 [11] 为 530 mg/kg。分别对斑马鱼 LC50和大鼠 LD50取常用对数后,发现其符合 Parng 文章中数据拟合的线性关系。因此可以通过斑马鱼的半数致死浓度,早期预 测哺乳动 物毒性试验的药物浓度,从而降低毒理试验的成本,缩短试验周期。 14 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 参考文献[1] Reddy, P. 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