血清谷丙转氨酶活力测定(改)

血清谷丙转氨酶活力测定(改) 血清谷丙转氨酶活力测定 实验目的 1、学习测定谷丙转氨酶活性的原理。 2、掌握分光光度法定量测定技术。 实验原理 转氨酶又叫氨基转氨酶，它催化转氨基反应。转氨酶在氨基酸的分解、合成及三大物质的相互联系、相互转化上起很重要的作用。转氨酶种类很多，在动物的心、脑、肾、肝细胞中含量很高，在植物和微生物中分布也很广，其中以谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活力最强，GPT在肝细胞中含量最丰富，它催化a-酮戊二酸和L-丙氨酸反应生成L-谷氨酸和丙氨酸。正常人的血清GPT含量很少，活性很低，但当肝细胞受损时(如肝炎等病变)，酶从肝细胞释放到血液中，使血清中的GPT活性显著增高。测定GPT是临床上检查肝功能是否正常的重要指标之一。 GPT作用于L-丙氨酸和a-酮戊二酸后生成的一种产物——丙酮酸可与2，4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙。2,4-二硝基苯腙在碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用分光光度法进行丙酮酸定量测定。因此在一定的条件下，可进行GPT活力的测定并计算出血清中GPT的活力单位数。 实验器材和试剂 1 试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、坐标纸、新鲜人血清。 2 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)、2μmol/L丙酮酸钠液、GPT底物液、2，4–二硝基苯肼液、0.4mol/L NaOH溶液。 实验步骤 1、标准曲线制作 (1).取试管6支，标号，进行操作。 试剂/试管编号 0 1 2 3 4 5 V(0.1mol/L磷酸缓冲液)ml 0.10 0.10 O.10 0.10 0.10 0.10 V(GPT底物液)/ml 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 V(丙酮酸钠标准液)/ml 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 相当于丙酮酸实际含量/μmol 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 (2)混匀后，置37?水浴预温5分钟，再分别加入2，4–二硝基苯肼液0.5ml，混匀，保温20分钟，各加入0.4mol/L NaOH 5ml，混匀继续保温10分钟，取出，冷至室温。 (3)以0号管为对照，在520nm波长下用分光光度计测定各管的吸光度(A520)。 (4)以丙酮酸的实际含量(μmol)为横坐标，各管的吸光度(A520)为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 2.血清GPT活力的测定 (1)取试管两支，标明测定管和空白管，各加入GPT基质液0.5ml，37?水浴保温5分钟。 (2)向测定管中加入血清0.1ml，混匀后立即计时，继续在37?水浴中保温30分钟。 (3)至30分钟后，向测定管和空白管各加入2，4–二硝基苯肼液0.5ml，混匀，向空白 管补加0.1ml的血清。 (4)2支试管各加入0.4mol/L NaOH 5ml，混匀，保温10分钟后，取出，冷至室温 (5)以空白管为对照，读取520nm波长下测定的吸光值A520。 (6)在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数，并换算出丙酮酸的μg数。 (7)血清GPT活力计算:本方法规定在37?，PH为7.4时，血清中的GPT与GPT底物液作用30分钟每生成2.5μg丙酮酸的酶量为1个酶活力单位(U)。据此计算每1ml血清中GPT的活力单位数。