呼吸道合胞病毒对致敏小鼠气道炎症和CD8_T细胞功能的影响_cropped

呼吸道合胞病毒对致敏小鼠气道炎症和CD8_T细胞功能的影响_cropped 〃〃感染免疫 呼吸道合胞病毒对致敏小鼠气道炎症和 + CD8 T 细胞功能的影响 蒋雄斌 朱毅 殷凯生 姚周锋 + ( ) 【 摘要 】 目的 观察呼吸道合胞病毒 RSV对致敏小鼠气道炎症和 CD8 T 细胞功能的影响 。 ( ) () 方法 BALBΠc 小鼠 40 只 ,随机分成 4 组 ,分别为磷酸盐缓冲液 PBS对照组 、鸡卵白蛋白 OVA组 、 RSV 组 、OVAΠRSV 组 ;应用 OVA 腹腔注射致敏 、OVA 气道雾化结合 RSV 滴鼻激发哮喘 ; 支气管肺泡灌 () ( ) ( ) 洗液 BALF作细胞分类计数 ;酶联免疫吸附试验 EL ISA测定 BALF 上清中白细胞介素 IL24 、IL25 、干 ( ) ( ) γ 扰素 IFN2含量 ;苏木精2依红 HE染色观察肺病理变化 ; 采用三色光流式细胞分析法测定气管旁+ + ( ) γ淋巴结 PBLN中 CD4 、CD8 T 细胞及细胞内细胞因子 IFN2、IL24 、IL25 表达与 T 2ΠT 1 、Tc2ΠTc1 比值 H H () 变化 。结果 1BALF 中细胞总数及分类 : 与 OVA 组比较 ,OVAΠRSV 组细胞总数 、嗜酸性粒细胞 、淋 (() 巴细胞均明显增加 分别 P < 0. 01;与 RSV 组比较 ,OVAΠRSV 组细胞总数 、嗜酸性粒细胞明显增加 分 () ) γ别 P < 0. 01。2BALF 上清中细胞因子含量 :与 OVA 组比较 ,OVAΠRSV 组 IFN2、IL24 、IL25 含量均明 (() γ显升高 分别 P < 0. 01;与 RSV 组比较 ,OVAΠRSV 组 IFN2无明显变化 ,而 IL24 、IL25 显著上升 分别 P () ) < 0. 01。3肺组织病理 :OVAΠRSV 组与其他各组比较气道黏膜增厚 ,管腔狭窄 、收缩 ,上皮破坏 ,管 + + + + + + + ( ) ( ) ( γγ壁周围炎症细胞浸润明显加重 。4PBLN 中 CD4 IFN2、IL24 、IL25 、CD8 IFN2、IL24 、IL2 + + +) 5 T 细胞各占 CD3 T 细胞百分比及 T 2ΠT 1 、Tc2ΠTc1 比值变化 : 与 OVA 组比较 ,OVAΠRSV 组 CD8 H H + + + ( ) (γ) IFN2、IL24 、IL25 T 细胞百分比 、Tc2ΠTc1 比值增加 分别 P < 0. 01,T 2ΠT 1 比值无明显变化 。与 H H + + + + + + ( ) ( ) RSV 组比较 ,OVAΠRSV 组 CD4 IL24 、IL25 T 细胞 、T 2ΠT 1 比值 、CD8 IL24 、IL25 T 细胞 、Tc2Π H H ( () ) Tc1 比值均明显上升 分别 P < 0. 01。结论 1OVA 致敏小鼠 RSV 感染后可明显加重气道炎症 , + () T2 、T1 型炎症均加强 ,且以 T2 型炎症加重为主 。2OVA 致敏小鼠 RSV 感染后可引起 CD8 T 细 H H H + + + γ胞数量及功能改变 ,即由产生 IFN2为特征的 Tc1 细胞向产生 IL24 、IL25 为特征 Tc2 细胞转化 ,并 可能与气道内 IL24 、IL25 升高及嗜酸性粒细胞的大量募集有关 。 + 【 关键词 】 呼吸道合胞病毒 ; 支气管哮喘 ; CD8 T 细胞 ; BALBΠc 小鼠 ; 流式细胞分析 + Effects of respiratory syncytial virus( RSV) infection on a ir way infla mmation and the f unction of CD8T 3 lymphocytes in ova bumin ( O VA) 2sensitized BAL BΠc mice J IANG Xiong2bin , ZHU Yi , YIN Kai2sheng , 3 YAO Kun , ZHOU Feng . Department of Respiratory Disease , the First Aff iliated Hospital of N anjing Medical Uni2 versity , N anjing 210009 , China Correspondi ng a ut hor : YIN Kai2sheng , Email : yinks @126 . com 【 Abstract 】 Objective To study the effect of RSV infection on the development of airway inflammation + and the function of CD8 T lymphocyte in OVA2sensitized BALBΠc mice . Methods Forty mice were randomly di2vided into four groups : PBS control group , RSV group , OVA group and OVAΠRSV group . Cells in BALF were () counted and classified and the supernatants of the bronchoalvoelar lavage fluidBALFwere used for the detection + ( γof IL24 , Il25 and IFN2. Histopathological changes were checked by HE staining. The percentage of CD4IFN2 + + + + + + + γ) ( γ) , IL24 , IL25 , CD8 IFN2, IL24 , IL25 T lymphocyte and the ratio of T 2ΠT 1 , Tc2ΠTc1 in peri2H H ( ) bronchial lymph nodesPBLNwere analysed by three2color flow cytometry method. Results Total BALF cells , eosinophils and lymphocytes from OVAΠRSV group were significantly higher than those in OVA group respectively ( ) ( ) γP < 0. 01; more eosinophils were founde in OVAΠRSV group than that in RSV group P < 0. 01. IFN2, IL24 ( and IL25 levels in BALF from OVAΠRSV group increased greatly as compared with OVA group P < 0. 01 respec2 ) γ( ) tively; meanwhile there is no marked change in IFN2level P > 0. 05, but IL24 , IL25 levels increased in OVAΠ ( ) RSV group as compared with RSV group respectivelyP < 0. 01. More marked and extensive airway inflammatory ( )基金项目 :江苏省卫生厅科技项目 H200316 ( ) ( )作者单位 :210009 南京医科大学第一附属医院呼吸内科 蒋雄斌 ,朱毅 ,殷凯生;南京医科大学微生物与免疫学系 姚 周锋 , 通讯作者 :殷凯生 , Email :yinks @126 . com ,电话 :02528371883626269 + ( cells infiltration in OVAΠRSV group were observed than that in all the other groups. The percentage of CD8IFN2 + + + γ) , IL24 , IL25 T lymphocyte and the ratio of Tc2ΠTc1 from the OVAΠRSV group were significantly higher ( ) than those in OVA group respectivelyP < 0. 01but there is no marked change in the ratio of T2ΠT1 ; the per2 H H + + + + + + ( ) ( ) centage of CD4 IL24 , IL25 , CD8 IL24 , IL25 T lymphocyte , the ratio of T 2ΠT 1 and Tc2ΠTc1 from H H ( ) OVAΠRSV group were higher than those in RSV group respectivelyP < 0. 01. Conclusion RSV infection in OVA2sensitized BALBΠc mice caused severe airway inflammation which resulted in the increase of T12like and H T22like cytokine response . RSV infection in OVA2sensitized BALBΠc mice also induced the increase of the cell H + + count and function change of CD8 T lymphocyte , namely CD8 T lymphocyte transfer from Tc1 which is charac2 γterized by excreting IFN2to Tc2 excreting IL24 and IL25 , which maybe explain the increase of IL24 , IL25 and the gathering of eosinophils in the airway. + 【 Key words 】 Respiratory syncytial virus ; Atopic asthma ; CD8T lymphocyte ; BALBΠc mouse ; Flow cytometer ) ,呼吸道病毒感染是临床及流行病学研究表明 国。 〔1 ,2〕 支气管哮喘急性加重 、致死的重要原因。O′Sul2病毒和细胞 : RSV Long 株 A 型 , 南京医科大学 〔3〕( ) 微生物与免疫学系提供 ;人喉癌上皮细胞 Hep22由 livan 等在因重度哮喘死亡患者的肺病理标本中检 ( ) 中国预防医学科学院病毒研究所惠赠 。Hep22 细胞 测到呼吸道合胞病毒 RSV、鼻病毒基因组 ,并发现 + + 10 %灭活胎牛血清的 DMEM 中 37 ?,5 % CO在含 气管旁有大量 CD8 T 细胞浸润 ,且 CD8 T 细胞表 2 面分子 CD25 、穿孔素表达增高 ,提示重度哮喘患者 条件 下 培 养 , 细 胞 长 满 单 层 后 , RSV 接 种 Hep22 细 + 气道局部存在 CD8 T 细胞数量和功能的异常 , 并 胞 ,继续在含 2 %灭活胎牛血清的 DMEM 维持液中 可能与 重 度 哮 喘 的 病 理 生 理 过 程 相 关 。Schwarze 培养 ,3,5 d 出现细胞病变 ,待病变达 100 %时收获 〔4〕+ 等将 RSV 感染后小鼠气道 CD8 T 淋巴细胞转移( ) 病毒 ,并冻存于280 ?冰箱中 ,反复冻融 2 次 18 ?, ( ) 到未感染也未致敏的小鼠气道内 ,动物出现 T2 型 5000 g 离心 10 ?,30 min,取上清备用 。参照邹毅H 〔5〕+ () 等的方法采用空斑形成试验测定病毒滴度 ,取滴 气道炎症和气道高反应 AHR,用 CD8 T 细胞单抗 6 + ( ) 度为 10空斑形成单位 PFUΠml RSV 备用 。 可完全阻断该炎症反应 , 但转移 CD4 T 细胞不能 + 使被转移动物产生气道炎症 , 阻断 CD4 T 细胞也实验分组 :BALBΠc 小鼠随机分成 4 组 ,每组 10 + ( ) 只 。磷酸盐缓冲液 PBS对照组 : 以 PBS 代替 OVA仅部分减轻气道炎症 。说明 CD8 T 细胞在呼吸道 ; OVA 组 : 以 OVA 致 敏 、激 发 ; RSV 组 、致 敏 、激 发 病毒诱导的哮喘发作及急性加重中起重要作用 ,但 OVAΠRSV 组 : OVA 致敏 、激发的基础上气道内滴入 其作用机制不清楚 。本研究应用 RSV 诱导的致敏 〔6〕RSV 。OVAΠRSV 组参照 Barends 等的方 法 并 改 良 小鼠哮喘模型 ,观察气道炎症并采用三色光流式细 + + ( ) 诱导哮喘发作 , 于第 1 、14 天小鼠腹 腔 注 射 致 敏 液 胞分析法测定气管旁淋巴结 PBLN中 CD4 、CD8 ) ( 0 . 2 ml 0 . 08 % OVA 0 . 1 ml 和等体积液态铝混合,T 细胞功能变化 。 第 15 天起将小鼠臵于透明密闭容器中以 1 % OVA和方法 溶液 10 ml 雾化吸入 ,每次 20 min ,隔日 1 次 ,连续 5 6 μ周 ,并分别于第 21 、35 、49 天用 RSV 10PFUΠml 50 l :BALBΠc 小鼠 40 只购自中国 动物 、试剂和仪器 ) ( 鼻腔滴入 ,于最后 1 次 RSV 滴入 4 d 后进行肺泡灌 科学 院 上 海 动 物 中 心 , 动 物 证 号 SCXKL 沪 20032 洗并处死小鼠取标本 。PBS 对照组和 OVA 组 小 鼠 0003 ,清洁级 ,6,8 周龄 ,体重 17,20 g ,雌性 。卵白 () γ分别于上述时点用 PBS 、OVA 进行致敏 、激发并在气 蛋白 OVA购 自 美 国 Sigma 公 司 。IFN2、IL24 、IL25 μ( ) PBS 50 道内滴入等体积 酶联免疫 吸 附 试 验 EL ISA试 剂 kit 购 自 美 国 Bio2 l , RSV 组分别于第 21 、35 、 6 μ49 天用 RSV 10PFUΠml 50l 鼻腔滴入 。 source 公司 。流 式 细 胞 检 测 试 剂 盒 包 括 : 刺 激 剂 佛 ( ) ( ) () ( 支气管肺泡灌洗液 BAL F中细胞分类计数 :小 波酯 PMA、离子霉素 ionomycin、阻断剂 brefeldin2 ) 鼠按 30 mgΠkg 戊巴比妥钠腹腔麻醉 ,气管切开 ,用套 A ,BFA;大鼠抗小鼠藻红蛋白2N , N′2对羧苄基吲哚 ( ( ) ) 三菁 PE2Cy5标记 CD3 , 异硫氰酸荧光素 FITC标 管针臵入 、固定 。用 0 . 5 ml PBS 灌洗 ,反复 2 次 ,回 ( ) γ收率在 90 %,100 % ,1200 rΠmin 离心 5 min ,上清保 记 CD8 ,藻红蛋白 PE标记 IFN2、IL24 、IL25 单抗及 存在220 ?冰箱中待测定细胞因子 。离心沉淀细胞 大鼠 LgG1 阴性对照均购自美国 Caltag 公司 。酶标 ( ) ( 仪 Sunrise ,奥地利, FACS Calibur 流式细胞仪 Bec2用 0 . 5 ml Hanks 液重悬 ,取 0 . 1 ml 在血细胞计数器 ) ( ton Dickinson , 美 国 , 真 空 冻 干 机 LABCONCO , 美下计算细胞总数 ,其余沉渣细胞涂片瑞氏2吉姆萨染 ( , OVA 组 细 胞 总 数 、嗜 酸 性 粒 细 胞 增 加 ; OVAΠ 比较 色 ,按细 胞 形 态 进 行 分 类 计 数 至 少 计 数 200 个 细 ) 胞。RSV 组细胞总数 、嗜酸性粒细胞 、淋巴细胞明显升高 () BAL F 上清中细胞因子测定 :将 BALF 放入真空 分别 P < 0 . 01; RSV 组细胞总数 、淋巴细胞也明显 μ() 冻干机内270 ?冻干 ,共 24 h ,200 l 生理盐水重融 。 升高 分别 P < 0 . 01。与 OVA 组比较 ,OVAΠRSV 组 γ( EL ISA 方法测定其中 IFN2、IL24 、IL25 含量 ,按 EL ISA细胞总数 、淋巴细胞 、嗜酸性粒细胞明显升高 分别 ) 说明书检测 。P < 0 . 01; 与 RSV 组比较 ,OVAΠRSV 组仅嗜酸性粒 肺组织病理变化 :动物处死后 ,取右肺中叶臵于( ) 细胞增加 P < 0 . 01。 10 %福尔马林中固定 24 h ,常规制备病理切片苏木 表 1 各组 BAL F 中细胞分类计数( x? ?s) ( ) 精2依红 HE染色观察肺病理变化 。 Table 1. Classify count of BALF cell in different groups( ?x ?s) 三色 光 流 式 细 胞 分 析 法 检 测 气 管 旁 淋 巴 结 Total cellsMouse Group Eosinophil Lymphocytes + + 5number ( )〓10Πml ( PBL N) 中 CD4 、CD8 T 淋巴细胞及其细胞内细 PBS 10 〒1 . 42 0. 04 〒0 . 01 〒0 . 24 4 . 98 0 . 96 γ胞因 子 IFN2、IL24 、IL25 表 达 与 T2ΠT1 、Tc2ΠTc1 HH33 OVA 10 1 . 13 〒0 . 397 . 59 〒3 . 15 0. 58 〒0 . 11 比值变化 :取 PBLN 3,4 枚 , Hanks 液中用眼科剪仔 3#RSV 10 0. 03 〒0 . 01 14 . 35 〒3 . 57 5 . 21 〒1 . 54 #? # OVAΠRSV 10 细剪 碎 , 经 300 目 尼 龙 膜 过 筛 获 单 细 胞 悬 液 , 1200 14 . 91 〒4 . 14 1. 35 〒0 . 39 4 . 54 〒1 . 32 3 P < 0 . 01 , compared with the group PBS ; # P < 0 . 01 , compared rΠmin离心 5 min ,将沉淀细胞臵于 RPMI 1640 培养液5 with the group PBS and OVA ; ?P < 0 . 01 , compared with the group PBS , 中 ,调整细胞浓度为 2 . 0 〓10Πml , 台盼蓝染色排除 OVA and RSV μ( 死亡细胞 ,取 200 l 细胞悬液按终浓度 分别 25 ngΠ μμ) ml 、1gΠml 、10 gΠml加入刺激剂 PMA 、ionomycin 及 γ21 BAL F 上 清 中 IFN2、IL24 、IL25 含 量 :见 表 阻断剂 BFA , 臵 5 % CO的 恒 温 箱 中 孵 育 4 h 。以 2 ( + - + 2 。与 PBS 组比较 ,OVA 组 IL24 、IL25 增加 分别 P 0 . 05; OVAΠRSV 组 IFN2、IL24 、 μ体 ,避光室温孵育 20 min 。加入 100 l Fix &Perm 中 ) (的 reagent A 固定剂,孵育同前 。加 3 ml PBS ,1200 ( ) IL25 均明显增加 分别 P < 0 . 01。与 OVA 组比较 , μrΠmin 离心 5 min ,弃上清 。加入 100 l Fix &Perm 中 ( γ OVAΠRSV 组 IFN2、IL24 、IL25 均明显增加 分别 P <) (的 reagent B 破膜剂,使细胞膜出现微孔以利抗胞 ) γ0 . 01。与 RSV 组比较 ,OVAΠRSV 组 IFN2无明显变 内因 子 抗 体 进 入 细 胞 。洗 涤 、离 心 同 前 。沉 淀 加 ( ( ) 化 P > 0 . 05 , 而 IL24 、IL25 明 显 升 高 分 别 P < μγPBS 150l ,等量分成 3 份 ,各加 PE 标记的 IFN2、IL2 ) 0 . 01。μ 4 和 IL25 抗体 10 l ,孵育 、洗涤 、离心同前 。各管加 γ表 2 各组 BAL F 上清中 IFN2、IL24 、IL25 含量( x ?s) ?PBS 0 . 5 ml 重悬细胞 , 上机检测 。先用 SSCΠFSC 双 γTable 2. Comparison of IFN2, IL24 , IL25 from BALF in 参数区分出淋巴细胞群 ,再用荧光标记 CD3 抗体选 + - each group( x??s) 择出 T 细胞亚群 ,以 CD8 抗体区分出 CD3 CD8 和+ + + + CD3 CD8 细胞群 ,即分别为 CD4 T 细胞和 CD8 T Mouse 24 IL25 γ ILIFN2Group ) () () ( number pgΠmlpgΠmlpgΠml γ细胞 ,最后分别以 IFN2、IL24 和 IL25 抗体区别出 + + + + + + + PBS 10 〒0 . 43 2. 55 〒0 . 32 3 . 45 〒0 . 28 3 . 86 ( ) ( γγCD4 IFN2、IL24 、IL25 、CD8 IFN2、IL24 、 # # OVA 10 4 . 58 〒0 . 54 + + 5. 38 〒0 . 71 12 . 59 〒0 . 96 ) IL25 T 细胞占 CD3 T 细胞百分比 。同时设立对 3? ?RSV 10 31 . 22 〒3 . 67 3. 28 〒0 . 41 4 . 15 〒0 . 36 照管 ,不加刺激剂 PMA 和 ionomycin ,其余处理均相 3 ?? 27 . 67 〒2 . 18 32. 88 〒2 . 83 45 . 67 〒2 . 94 10 OVAΠRSV 同 。 3 P < 0 . 01 , compared with the group PBS and OVA ; # P < 0 . 01 , ( ) compared with the group PBS ; ?P < 0 . 01 , compared with the group OVA ; 统计学方 法 : 数 据 用 均 数 〒标 准 差 x? 〒s 表 ?P < 0 . 01 , compared with the group PBS , OVA and RSV示 ,采用 SPSS11 . 0 统计软件进行完全随机设计资料 () 的单因素方差分析 ONE2WAY AVONA和 LSD2 t 检 31 肺 组 织 病 理 改 变 :OVAΠRSV 组 气 道 上 皮 增 验 , P < 0 . 05 为差异有统计学意义 。 厚 、破坏 ,管腔明显狭窄 ,有支气管收缩征象 ,管壁及 ( ) 其周围 大 量 嗜 酸 性 粒 细 胞 、淋 巴 细 胞 浸 润 图 1。 OVA 组气道上皮增厚 , 管腔狭窄 , 管 壁 及 其 周 围 炎 () 症细胞浸润较 OVAΠRSV 组减轻 图 2。RSV 组肺泡 结果 充血 、增厚 、断裂 ; 细支气管血管周围较多炎症细胞 ( ) ,主 要 是 淋 巴 细 胞 偶 见 嗜 酸 性 粒 细 胞 图 3。 浸润 11 BAL F 中细胞 分 类 计 数 :见 表 1 。与 PBS 组 ( ) PBS 组细支气管 、肺组织结构正常 ,无支气管收缩征Tc2ΠTc1 比值明显升高 分别 P < 0 . 01。与 RSV 组 + + + + (( ) ( ) 象 ,亦未见炎症细胞浸润 图 4。比较 , OVAΠRSV 组 CD4 IL24 、IL25 、CD8 IL2 + + ) 4 、IL25 T 细胞百分比 ,T 2ΠT 1 、Tc2ΠTc1 比值均明 H H () 显升高 分别 P < 0 . 01。 图 1 O VAΠRSV 组 小 鼠 肺 组 织 病 理 变 化 ( HE 染 色 , ×200) Fig 1. Lung histopathologic changes after O VA sensitiza2 图 3 RSV 组小鼠肺组织病理变化( HE 染色 , ×200) tion and RSV2infection in BAL BΠc mice( HE sta ining , ×200)Fig 3. Lung histopathologic changes after RSV infection in BAL BΠc mice( HE sta ining , ×200) 图 2 O VA 组小鼠肺组织病理变化( HE 染色 , ×200) Fig 2. Lung histopathologic changes after O VA sensitiza2 图 4 对 照 组 小 鼠 肺 组 织 病 理 变 化 ( HE 染 PBS tion and challenge in BAL BΠc mice( HE sta ining , ×200)色 , ×200)+ + + + γ41 PBL N 中 CD4 ( IFN2、IL24 、IL25 ) 、 Fig 4. Lung histopathologic changes in PBS control group + + + + + in BAL BΠc mice( HE sta ining , ×200) γCD8 ( IFN2、IL24 、IL25 ) T 细 胞 各 占 CD3 T 细胞百分比及 T2ΠT1 、Tc2ΠTc1 比值变化 :见表 3 。 HH讨论 + + + ( ) 与 PBS 组比较 ,OVA 组 CD4 IL24 、IL25 T 细 胞 ( ) 百分比 、T2ΠT1 比值升高 分别 P < 0 . 01; RSV 组 H H 本研究观察到 RSV 组 BALBΠc 小鼠 BALF 中淋 + + + + + ( ) ( ) γγCD4 IFN2、IL24 、CD8 IFN2T 细胞百分比 巴细胞升高 ,而 OVA 组以嗜酸性粒细胞升高为主 。 (( ) ) 升高 分别 P < 0 . 01,Tc2ΠTc1 比值下降 P < 0 . 01; 与 OVA 组 比 较 , OVAΠRSV 组 BALF 中 嗜 酸 性 粒 细 + + + + + ( ) ( γOVAΠRSV 组 CD4 IFN2、IL24 、IL25 、CD8 IL2 胞 、淋巴细胞均明显增加 ; 与 RSV 组比较 ,仅嗜酸性 粒细胞大量增加 ,提示在 OVA 致敏 、激发 RSV 感染 + + + ) γ4 、IL25 、IFN2T 细 胞 百 分 比 , T 2ΠT 1 、Tc2ΠTc1 H H 后气道炎症类型和炎症程度发生改变 ,即由单纯嗜 () 比值均升高 分别 P < 0 . 01。与 OVA 组比较 ,OVAΠ 酸性粒细胞或淋巴细胞气道炎症转化为嗜酸性粒细 + + + + ( ) γ RSV 组 CD8 IFN2、IL24 、IL25 T 细胞百分比及 + + + 表 3 各组 PBL N 中 CD4 、CD8 T 细胞各占 CD3 T 细胞百分比及 T 2ΠT 1 、Tc2ΠTc1 比值变化( x? ?s) H H + + + Table 3. Changes in percent of CD4, CD8 T lymphocytes in CD3T lymphocytes and the ratio of T 2ΠT 1 , Tc 2ΠTc 1( x??s) H H + + ( )( )CD4 T% CD8 T% T2ΠT1 Group Tc2ΠTc1 n HH++++ ++ IL24 IL25 IL24 IL25 γγIFN2IFN2PBS 10 〒0. 18 1. 74 〒0. 11 0. 86 〒0. 04 0. 64 〒0. 04 2. 57 〒0. 16 1. 32 〒0. 12 1. 68 〒0. 15 0. 68 〒0. 03 2. 85 333OVA 10 3. 34 3. 24 1. 67 1. 98 0. 54 〒0. 41〒0. 21〒0. 17〒0. 21〒0. 024. 35 〒0. 47 2. 86 〒0. 31 1. 24 〒0. 07 33?33RSV 10 1. 08 〒0. 07 1. 48 〒0. 121. 54 〒0. 135. 76 〒0. 67 2. 72 〒0. 23 0. 55 〒0. 02 5. 11 〒0. 53 0. 36 〒0. 01 #??3#??? 10 OVAΠRSV 2. 27 〒0. 25 4. 84 〒0. 56 6. 28 〒0. 81 4. 26 〒0. 49 4. 45 〒0. 56 1. 06 〒0. 08 4. 65 〒0. 52 1. 24 〒0. 08 3 P < 0. 01 , compared with the group PBS ; # P < 0. 01 , compared with the group PBS and RSV ; ?P < 0. 01 , compared with the group OVA ; ?P < 0. 01 , compared with the group PBS and OVA ; ?P < 0. 01 , compared with the group PBS , OVA and RSV + + + + ( ) γ值无明显变化 ,而 CD8 IL24 、IL25 、IFN2T 细 胞 、淋巴细胞混合型且炎症程度明显加重 ,这可能一 ( ) 方面与 RSV 破坏气道上皮引起嗜酸性粒细胞趋化 胞百分比 、Tc2ΠTc1 比值明显升高 分别 P < 0 . 01, 〔7〕 + + + (α) ( ) 因子如 MIP12、RANTES 和 eotaxin等局部释放, 其中 CD8 IL24 、IL25 T 细胞百分比升高更为明 另一方面可 能 与 T2 型 细 胞 因 子 大 量 分 泌 激 活 有 显 ,提示 OVA 致敏激发条件下 RSV 感染可增强 T2 H H + γ关 。检测 BALF 中细胞因子 IFN2、IL24 、IL25 含量发 型反应 ,T2 样细胞因子 IL24 、IL25 主要来源于 CD8 H γ 现 ,与 PBS 组比较 , RSV 组 IFN2升高 ,说明 RSV 感 T 细胞 。与 RSV 组比较 ,OVAΠRSV 组 T2ΠT1 、Tc2Π H H 染主要表现为 T1 型反应 ,与大部分的研究结果相 H + + + + + + ( ) ( ) Tc1 比值 、CD4 IL24 、IL25 、CD8 IL24 、IL25 〔8〕γ 似。与 RSV 组比较 ,OVAΠRSV 组 IFN2无明显变 ( ) T 细胞百分比均明显增加 分别 P < 0 . 01, 尤其是 ( ) 化 ,而 IL24 、IL25 含量大量增加 分别 P < 0 . 01, 提 + + + ( ) CD8 IL24 、IL25 T 细胞增加更加明显 ,约增加了 示 OVA 致敏 、激发 RSV 感染后 T1 型 炎 症 反 应 向 H + 4 倍 ,说明 OVA 致敏激发条件下 RSV 感染 , CD8 T( ) T2 型炎症反应漂移 shift, T2 型细胞因子大量优 H H 细胞功能发生改变 ,由单纯 RSV 感染下的 T1 型炎H γ势表达 。与 OVA 组比较 ,除 IFN2升高外 , IL24 、IL25 () 含量升高更为明显 分别 P < 0 . 01,提示在 OVA 致 γ 症反应向 T2 型炎症反应转化 , 即由产生 IFN2为 H 敏条件下 RSV 感染加强 T1 型反应的同时 ,也加强 H 主的 Tc1 细胞向产生 IL24 、IL25 为主的 Tc2 型细胞转 〔11〕化 。体内外研究表 明 , 在 T 2 局 部 环 境 中 , 产 生 H 〔9〕 + ( T2 型反应 。有研究表明 ,在部分哮喘类型中 如 H γIFN2的 CD8 细胞毒 T 细胞可转化为产生 IL24 、IL2 ) 病毒感染诱发哮喘T1 、T2 类细胞均参与哮喘气 H H + 5 为主的非细胞毒 T 细胞 ,上述 CD8 T 细胞表型的 道炎症 ,两者并非相互抑制 、相互排斥 ,而是相互促 改变可能与此有关 。 进 、相互协同 ,其中 T1 细胞能协助 T2 细胞向气道 H H 我们知道 ,呼吸道病毒感染是支气管哮喘急性募集 ,并在哮喘的不同阶段发挥不同的作用 。因此 , 发作甚至加重 、致死的重要原因 ,由此推测 ,在支气 OVA 致敏激发条件下 RSV 感染后 T1 反应的加强 H 可进一步促进 T2 细胞的募集 ,在呼吸道病毒感染 H 管哮喘急性发作及急性加重中 Tc2 细胞发挥较重要 + 导致的 T2 型气道炎症的发生发展中起重要作用 。 H 的作用 。由于 CD8 T 细胞更倾向于 Tc2 分化 ,分泌三色光流式细胞术检测胞内细胞因子 ,其优点 在于 IL24 、IL25 等 T2 型细胞因子 ,趋化嗜酸性粒细胞 、肥H 能进行单个细胞水平的测定 ,能在同一细胞内 同时大细胞等 。由此进一步推测 ,病毒相关性哮喘与花 检测 2 种或更多的细胞因子 ,并可对不同的细 胞亚 粉 、尘螨等过敏原引起的哮喘急发的发病机制可能 + + 群 进 行 参 数 分 析 。实 验 证 实 , CD8 T 细 胞 与 CD4 存在一定的差异 。由于临床上病毒诱导哮喘发作十 T 细胞一样可分为 Tc1 和 Tc2 两个功能不同 的亚分频繁 ,进一步研究 Tc1ΠTc2 失衡与病毒诱发 、加重 群 ,Tc1 主要分泌 T1 样细胞因子 ,如 IL22 、INF2 H 哮喘的关系 ,可能有助于为哮喘的临床治疗提供一 种新思路 。 〔10〕 γ2 样细胞因子 。为,Tc2 主要分泌 IL24 、IL25 等 T H 参 考 文 献 进一步探讨 OVA 致敏激发条件下 RSV 感染后气道 炎症加重的机制 ,本研究采用三色光流式细胞分析 1 Johnston SL , Pattemore PK , Sanderson G , et al . The relationship be2 + + + ( 法测定肺引流淋巴结 PBLN 中 CD4 IL24 、IL25 、 tween upper respiratory infections and hospital admissions for asthma . Am + + + + + ) ( ) γγIFN2、CD8 IL24 、IL25 、IFN2T 细 胞 各 占 J Respir Crit Care Med , 1996 , 154 : 6542660 . Teichtahl H , Buckmaster N , Pertnikovs E. The incidence of respiratory 2 + CD3 T 细胞百分比及 T 2ΠT 1 、Tc2ΠTc1 比值变化 。 H H tract infection in adults requiring hospitalization for asthma . Chest , 1997 , 研究发现 , 与 OVA 组比较 ,OVAΠRSV 组 T2ΠT1 比 112 : 5912596 . H H + 3 6592 . O′Sullivan S , Cormican L , Faul JL , et al . Activated cytotoxic CD8 T lymphocytes contribute to the pathology of asthma death. Am J Respir Crit Hussell T , Lindsay C , Andrew G , et al . Th1 and Th2 cytokine induction 8 in pulmonary T cells during infection with respiratory syncytial virus. J Care Med , 2001 , 164 : 5602565 . + Gen Virol , 1996 , 77 : 244722455 . 4 Schwarze J , Cieslewicz G , Joetham A , et al . CD8 T cells are essential in the development of respiratory syncytial virus2induced lung eosinophilia 9 Robin S , David A , Guangming H , et al . Antigen2nonspecific recruitment and airway hyperresponsiveness. J Immunol , 1999 , 162 : 420724211 . 邹of Th2 cells to the lung as a mechanism of viral infection2induced allergic 毅 , 黄海鹭 , 徐军 , 等. 小鼠的原发性呼吸道合胞病毒感染. 中asthma . J Immunol , 2002 , 169 : 545825467 . 5 华结核和呼吸杂志 , 2001 , 24 : 4842486 . 10 Halverson DC , Schwartz GN , Carter C , et al . In vitro generation of all + Barends M , van Oosten M , de Rond CGH , et al . Timing of infection and 6 specific human CD8 T cells of Tc1 and Tc2 phenotype . Blood , 1997 , ( ) 90 : 208922096 . prior immunization with respiratory syncytial virus RSV in RSV2en2 Makela MJ , Tripp R , Dakhama A , et al . Prior airway exposure to aller2 hanced allergic inflammation. J Infection Dis , 2004 , 189 : 186621872 . 11 gen increases virus2induced airway hyperresponsiveness. J Allergy Clin Matsuse H , Behera AK , Kumaar M , et al . Recurrent respiratory syncy2 7 Immunol , 2003 , 112 : 8612869 . tial virus infections in allergen2sensitized mice lead to persistent airway in2 flammation and hyperresponsiveness. J Immunol , 2000 , 164 : 65832 ( ) 收稿日期 :2005207220 〃细菌学〃 铜绿假单胞菌检出特殊 1 型整合子结构 宋启发 林辉 郑剑 徐景野 金春光 ) 1 型整合子是造成铜绿假单胞菌广预变性 1 min ,98 ?变性 10 s ,66 ?退火加 为 att I 识 别 位 点. . . 接 sul1 基 因 。P1 延伸 5 min ,共 30 个循环 ,最后 72 ?延伸泛耐药的重要原因 ,其基本结构为 : 5′端 启动 子 为 TGGACAN14TAAGCT , P2 启 动 ( ) 保守 序 列 1 型 整 合 酶2特 异 识 别 位 点 10 min 。产物经纯化后测序分析 。子为 TTGCTGN14TAGACT。其 sul1 基 因 (( ) ( att I 或 attC23′端保守序列 qacE ?1 耐 采 用 long PCR , 铜 绿 假 单 胞 菌部分 与 铜 绿 假 单 胞 菌 GenBank , Access ) ) NB03012 扩增产物测序结果为 982 bp ,通No . AF313471 也 具 有 高 度 同 源 性药基因 盒2sul1 耐 药 基 因 盒 , 在 5′端 与 () 过 NCBI Blast 比对发现 ,包含 intI1 基因 、 99 %。 3′端之间可插 入 其 他 耐 药 基 因 盒 , 并 将 其整合在其中 ,形成各种组合的多重耐 intI1 基因调控系列和 sul1 耐药基因 ,3′NB03012 中发现的这种结构可能是 药整合子 。我院对感染监测中分离的 1 端保 守 序 列 缺 少 1 型 整 合 子 常 见 的一种最基本的 1 型整合子结构 , 由于其 ( 携带有 株铜绿假单胞菌 NB03012 进行了检测 。qacE ?1 基 因 , 与 偶 发 分 支 杆 菌 Gen21 型整合酶 、aat I 特异位点和启动 () ) 长片段 PCR long PCR:根据整合子Bank ,Access No . 536351 型 整 合 子 相 关 子 ,推断该结构应具有从环境中捕获相 系列具有高度同源性 应耐药基因盒的能力 5′端保守区 intI1 基因和 3′端保守区 sul1,达 99 % ,只有 6 个 ,其他结构更复杂 ( ) 基因 GenBank ,Access No . AF133699分别 碱基不同 。其基本结构为 1 型整合酶基的 1 型整合子可能来源于其进化 , 其具合 成 forward 引 物 5′2CACAGCACCTTGC2 因2117 bp 插入序列2sul1 基因 ,将其 1 型 体演变规律还有待进一步研究 。在药敏 整合酶基因和 117 bp 插入序列进行 NC2 实验中 , 对头孢噻肟Π棒酸敏感 , 而对 头 CGTAGAA 和 reverse 引物 5′2CCGAGACC AATAGCGGAAGC ,对整合子基因组进行 BI Blast 比对 ,其 1 型整合酶基因启动子孢他啶 、头孢曲松 、头孢噻肟 、头孢吡肟 、 () 扩增 。煮沸法制备细菌基因组

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。反 Pc和 特 异 识 别 位 点 与 铜 绿 假 单 胞 菌哌拉西林 、亚胺培南 、氨曲南 、庆大霉素 、 μμ( ) 应总体积 50 l ,2 〓GC buffer 25 l ,引物 GenBank , Access no . AF313471相 同 , 基 妥布霉素 、阿米卡星 、环丙沙星 、氧氟沙 μ) (星和复合磺胺等均表现高度耐药 , 纸片 各 20 pmol , dNTP 各 20 mol , long Taq 酶因组 结 构 如 下 : TGGACA 235 区. . . TA2 μ 2. 5 单 位 , 模 板 2 l 。扩 增 条 件 为 98 ?) ( (扩散法抑菌圈直径均 ?6 mm ,虽 然 该 1 AGCT210 区. . . AAGTA 1 型 整 合 酶 起 ) () 始密 码 子 . . . AGTCTA 210 区 . . . CAG2 型整合子没有类似耐药基因 , 但可能该作者单位 :315010 宁波 , 浙江省宁波市疾 ) ( 菌还同时存在更复杂的整合子结构或可 CAA 235 区 . . . GTTATGGAGC AG2 病预防控制中心微生物检验科( 能由其他耐药机制引起 。 CAACGAT GTTACGCA GCAGGG 整 合 子 通讯作者 : 宋启发 , Email : songqf @nbcdc . ( )收稿日期 :2005212226 相关特异识别区 59be ,其中下划线部分 org. cn ,电话 :0574281917018