重组水蛭素抗大鼠冠状动脉和大脑中动脉血栓形成的实验研究（可编辑）

重组水蛭素抗大鼠冠状动脉和大脑中动脉血栓形成的实验研究（可编辑） 重组水蛙素抗大鼠冠状动脉和大脑中动脉血栓形成的实验研究 硕士研究生 任开环 指导教 师 伟国柱 教授 专业名称 药理学 摘 要 背景与目的 近年,国内外对重组水蛙素 ? 一 种由 个氨基酸组成的高效、特异的凝血酶抑制剂的研发取得了令人瞩目的进展。 本研究组曾对国产的药效学和药代动力学进行了较深入 的研究,证明该药具有强大的抗凝、抗 以及抗动静脉血栓形成作用。本文研 究了此种 的抗大鼠冠状动脉和大脑中动脉血栓形成作用,旨在为 作为新药 开发扩大其适应症提供实验资料。 模型制备 仿 及徐理纳等人的方法,采用化学物质 损伤血管内膜从而制备大鼠冠状动脉或大脑中动脉血栓。动物麻醉后,手术暴露 冠状动脉前降支及大脑中动脉,将吸有 ,的定量滤纸片贴于所要形成血栓的血 管面,持续一定时间,以诱发血栓形成。 指标测定及药理活性评价 大鼠 冠状动脉血栓形成实验中,分时效关系研究及量效关系研究两部分进行, 持 续贴于血管表面 小时,后静脉注射 伊文思蓝溶液 ,根据 方法对 心肌缺血面积进行评分、测定左室伊文思蓝含量、变化及心肌超氧化物歧化 酶 活力和丙二醛 含量,依左室伊文思蓝含量计算给药后心肌缺 血抑制百分率 大鼠大脑中动脉血栓形成实验中,进行量效关系研究, 。持续 贴于血管表面 分钟,术后 小时检查不同剂量给药组大鼠行为学改变, 小时 测定脑梗塞面积,并计算脑梗塞面积抑制百分率。以上两种血栓形成模型均于模 型制备后进行光镜病理检查 结果 冠状动脉血栓形成实验 时效关系研究中,大鼠 预处理的三个 不同时间组造模前 和心肌缺血面积评分、 伊文思蓝含量及 点和 波抬高变化等指标表明, 后随时间推 移,作用逐渐减弱,所测试时间组中,以药后的抗冠状动脉血栓作用最 强,作用维持约 小时 量效关系研究中,大鼠不同剂量组 和于造模前 给药,通过心肌伊文思蓝含量测定表明,其心肌缺血 抑制百分率分别为 和 ,计算得 抑制剂量为 ,模型组和上述给药组心肌缺血范围评分分别为和 点平均抬高分别为 和。 波平均抬高 分别为和 活性依次为和 含量分别为、和 。心室经病理切片及光镜检查可见模型组血管内血栓形成,心肌缺血性损伤及 变性坏死等,而给药组上述病理改变则随剂量变化发生不同程度减弱或消失。 大脑中动脉血栓形成实验 大鼠不同剂量组于造模前 给药,脑梗塞面积测定表明,其脑梗塞抑制百分率分别为和 ,其 抑制剂量为 ,模型组和上述剂量组行为学改 变评分分别为 和,病理切片和光镜检查可见给药组血栓形成和脑 组织缺血性损伤或坏死较模型组有不同程度减轻。以上两项实验中,均以肝素作 为阳性对照药进行实验,并且冠状动脉血栓形成实验中还以作为强度对 比药,结果显示受试国产 与的药理作用强度相同结论 受试国产 具有明显的抗冠状动脉血栓形成和抗大脑中动脉血栓形成 作用,且呈时间和剂量依赖性。持续时间较短,有效剂量范围为高剂量 时两项实验中抑制百分率均在 左右,其 抑制剂量 分别为 和 ,在抗冠状动脉血栓形成实验 中其作用强度与己被欧共体批准上市的权威重组水蜓素产品相同。 关键词 重组水蛙素,抗血栓作用,冠状动脉血栓模型,大脑中动脉血栓模型 咧比 运如 ’喊山琢重组水蛙素抗大鼠冠状动脉和大脑中动脉血栓形成的实验研究 硕士研究生 任开环 指导教 师 韩国柱教授 专业名称 药理学 前 言 随着人们生活水平的提高,心脑血管疾病已成为现今威胁人类健康的最主要 杀手之一,其发病率随年龄的增长而增高,并已有年轻化的趋势,这类疾病与血 栓形成密切相关,因而对防治心脑血管血栓形成的药物的研发一直受到人们的关 注。 水蛙素,为中药活血化淤水蛙的主要有效成分,系由 个氨基酸残基组成的 单链多肤,分子量约 ,能与凝血酶以等摩尔比结合成难解离的非共价复合物, 是迄今为止作用最强的特异性凝血酶抑制剂。水蛙素对多种血栓性疾病如深部静 脉血栓、弥漫性血管内凝血〔 、血栓性静脉炎、脑栓塞及冠状动脉血 栓有效。目前国内外采用基因重组技术研制水蛙素取得了令人瞩目的进展,国内 有关单位采用甲基营养型汉逊醉母真核表达系统研制出的重组水蛙素 与天然水蛙素型不同之处除 位酪氨酸脱硫 酸基外, 末端为 型 。为检侧国内重组水蚝素的 抗凝抗栓活性,本研究组已经从药效学如血凝时间、抗体外血栓形成、抗颈动脉 血栓形成、抗静脉血栓形成、抗 、抗肺栓塞等以及药代动力学方面进行了研 究,证实了其强大的抗凝抗栓活性。本文利用化学损伤法建立血栓模型,评价 了此种 的抗大鼠冠状动脉和大脑中动脉血栓形成作用,旨在进一步为水蛙 素的 新药开发以及临床应用的合理化提供实验资料。材 料药物 重组水蛙素阅,大连高新生物制药公司研制,批号 ,纯 度抗凝效价 肝素北京奥博星生物技术责任有限公司 产品,批号 注别用,即型 德国 公司重组水蜓素产品,批号 试剂 三氮化铁,北京市朝阳区通惠化 厂,纯,批号伊文思蓝, 上海化学试剂采购供应站,批号 氨甲苯酸注射液, 留 扬州 中宝制药有限公司,批号乌拉坦,中国医药集团 上海化学试剂公 司,化学纯,批号 无水硫酸钠‘沈阳化学试剂厂,分析纯‘批号丙酮,大连辽南化学试剂厂,分析纯,批号 考马斯亮蓝 ,上海化 试采购站批号 试剂盒,南京建成生物工程研究所批号 试剂盒,南京建成生物工程研究所 批号 红四氮吟北京化工厂,批号 动物 大鼠,雄性, ,大连医科大学动物中心提供,合格证号仪器 江湾一型微型人工呼吸器,上海籍鹏科技有限公司 分光光度计,上海第 三分析仪器厂产品离心机,北京医用离心机厂产品 心电图机,北京福田电子医疗仪器有限公司产品 控时调速式高速 分散器,江苏麒麟医用仪器厂产品 全自动高速冷冻离心机,湘西仪器表总 厂机械仪器厂产品 电热恒温水浴,北京西城区医疗器械厂产品一 电子秤, 武汉自动化仪器厂方 法大鼠冠状动脉及大脑中动脉血栓模型的建立 仿 制备冠状动脉血栓模型及徐理纳制备大脑中动脉血栓模型方法 利用三氛化铁损伤血管内膜,以诱发血栓形成。 冠状动脉血栓形成 大鼠腹腔注射币 乌拉坦麻醉,按 常规进行气管插管,人工呼吸,然后开胸断肋,暴露心脏,打开心包膜,将 吸有 三氯化铁溶液的定量滤纸片 贴于冠状动脉前降支根部, 分钟后 氨甲苯酸 后取下滤纸片,取出心脏,进行各项指标测 定。 大脑中动脉血栓形成 大鼠 水合氛醛 麻醉,按 等的方法暴露右侧位于嗅束及大脑下静脉之间的一段大脑中动脉,亦将吸有 三氯化铁溶液的定量滤纸片 贴在该段大脑中动脉上,持续 后去掉滤纸片,生理盐水冲洗局部组织,逐层缝合,回笼饲养。检查指标及测定冠状动脉血栓形成 心肌缺血面积评分 三氯化铁滤纸片取下后舌静脉注射 伊文思蓝后取出心脏,可见左心室心肌缺血区蓝染,按 的评分标准肉 眼宏观进行评分,按蓝染面积大小设 个打分点,即 无蓝染区、 蓝染区约占左心室面积的 左右 分,评分点越高说明心肌缺血越严重。采 用盲法进行评分。 左室伊文思蓝含量测定 心脏取出后,剪除右心室和左、右心房,称 重左心室,按 心肌以 溶液制成匀浆,再按 心肌 丙酮于匀浆液中加入丙酮,以沉淀蛋白质并萃取伊文思蓝,摇匀,匀浆液离心 。取上清液于 分光光度计 波长处比色,蒸馏水调 零,按下式计算每克心肌的伊文思蓝含量 ?伊文思蓝含量 心肌。为伊文思蓝标准液浓度, 为稀释倍 、 ‘分别是测定管和标准管光密度 数。 测定 造模前及造模后 分钟 ,监测心肌缺血程度,并测量造模后 分钟 点及 波抬高的变化 记录 导 值。 心肌组织 活力及含量测定 三氛化铁滤纸片取下后,取出心脏,立即冰冷生理盐水冲净余血,滤纸拭干, 置于一?冰箱内保存待测。测定时,取左心室,称重,加入预冷的生理盐水,冰 水浴中用高速分散器制成 匀浆液,匀浆液 离心 分钟,取上 清液进行蛋白含童测定以及 活力和含量测定。心肌蛋白含量采用考马 斯亮蓝法进行测定 活力按试剂盒采用黄嗦吟氧化酶法进行测定,活力单位 为含量按试剂盒采用硫代巴比妥酸反应比色法进行测定,单位 为病理形态学检查 造模后心脏置 福尔马林溶液中固定, 染色后, 光镜检查血栓形成情况以及缺血区心肌组织的病理改变。 大脑中动脉血栓形成 行为学评分 于术后 小时对动物行为进行评分,评分标准参考徐理 纳等的方法提鼠尾离开地面约一尺,观察前肢屈曲情况,如前肢对称伸向地面,计 为 分 如手术对侧前肢出现腕屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有腕、肘的屈曲又有 肩内旋者,分别计为 和 分将动物置于平地上,分别推双肩向对侧移动,检查阻力。如双侧阻力对 等且有力,计为 分 如向手术对侧推动时阻力下降,根据下降程度不同分为轻、 中、重 度,分别计为 分将动物两前肢置一金属网上,观察两前肢的肌张力。 双侧肌力对等且有 力者为。分,同样根据手术对侧前肢肌张力下降程度不同计为 分。动物有不停向一侧转圈者 计为 分。 根据以上标准评分,满分为 分,分数越高,动物的行为学障碍越严重。动 物评分时采用盲法。 梗塞面积测定 术后 小时,将大鼠断头取脑,去掉嗅球、小脑和低 位脑干,用生理盐水冲洗后做冠状切片 片,置 溶液中, 孵育 分钟。未缺血脑组织被染成红色,梗塞组织呈苍白色。将脑平片照相后,采用 软件分析系统,测定 个脑平面梗塞区及全脑区面积,计算梗塞面 积百分比。 病理学观察 术后立即取脑,置 福尔马林中固定, 染色,光镜 检查血栓形成情况以及梗塞区脑组织的病理改变。动物实验及分组对冠状动脉血栓形成的影响大鼠体重抗冠状动脉血栓形成的时效关系 大鼠 只,随机均分为 组,即假手术组除不贴三氯化铁纸片外,其余手术同其他组、病理模型组 以 三氛化铁造模,并静脉注射等容量 药后 分钟组 井于其后 分钟造模、药后 分钟组 并于其后 分钟造模 和药后 分钟组 并于其后 分钟造模。 按经舌静脉注射, 药后一定时间和造模,然后根据以下指标评价药物的时效关系 心肌缺血面积评分。左室心肌伊文思蓝含量,并以各组之平均值减去假手术组平均值得伊文 思蓝含量变化值,按下述公式计算给药后心肌缺血抑制百分率 病理模型组伊文思蓝含量变化值一药后伊文思蓝含量变化值 一 一 一 一抑制百分率 病理模型组伊文思蓝含量变化值改变 点抬高、 波抬高的 抗冠状动脉血栓形成的量效关系 大鼠。只,均分为 组,即假手术组、病理模型组、 高剂量 次高剂量中剂量低剂量 吵组、以及 组 、肝素组 假手术组和 病理模型组操作与时效关系相同,给药组分别自舌静脉注射给药,并于其后 分 钟造模卜其余操作与病理模型组相同。考察内容包括 心肌缺血面积评分。伊文思蓝含量测定和抑制百分率计算。 改变, 活力及含量测定病理形态学检查。对大脑中动脉血栓形成的影响大鼠体重大鼠 只,随机分为 组,即假手术组、病理模型组、 高荆量 砂 中剂量 尹低剂量 及肝素组除手术过程之差异外,各组给药及实验操作同冠脉血栓形成实验之量效关系 研究。考察术后 小时行为学评分。术后 小时脑梗死面积测定和抑制百分率计算。病理形态学检查统计学处理 利用 软件进行检验。除心肌缺血面积评分采用秩和检验外,其余指标均采用组间方差分析 程序。 结 果对冠状动脉血栓形成的影响抗冠状动脉血栓形成的时效关系研究 心肌缺血面积评分 除假手术组 伊文思蓝后肉眼宏观打分均为 分,即未见蓝染外,余均有不 同程度蓝染,模型组总分及高分动物数均高于假手术组,总计得分为 后 分钟组分别得总分为 、和 药后 分钟组 总分远小于模型组 ,其他时间组亦小于模型组,但大于 分钟组见表。 表 冠状动脉血栓形成模型大鼠 后不同时间心肌伊文思蓝蓝染面积宏观评分得分鼠数 一组别 分 分 分 分 分 分 总分 假手术组 病理模型组后 一 一 一与假手术组比较 秩和检验 与病理模型比较, 秩和检验左室心肌伊文思蓝含量 假手术组伊文思蓝含量为士 创 心肌,病理模型组为 士 心肌,后者远大于前者后 分钟伊文思蓝含量分别为 士 士 及 士 心肌,均小于模型组,抑制 百分率分别为 和 见表 及图 讨 论 本研究所用之药品基因重组水蛙素能与凝血酶产生特异性结合从而使后者失 去裂解纤维蛋白原为纤维蛋白的能力,进而阻止纤维蛋白凝固及形成血栓。本文 通过建立大鼠冠状动脉血栓模型和大脑中动脉血栓模型研究了国产 对心脑血管 血栓形成的对抗作用。研究表明 具有明显的抗冠状动脉和大脑中动脉血栓形成 作用,且呈剂量依赖性。 本研究采用化学损伤法制备血栓模型,血管内膜被化学物质损伤后,暴露 出内皮下胶原纤维,诱发血小板的乳附、聚集,形成血栓,是当前较常用的血栓 模型制备方法。如等采用 硝酸银溶液造成血管内皮损伤致冠状动脉血栓 形成 刘小光、徐理纳将吸有 三氯化铁溶液闪的小片定量滤纸敷于大脑 中动脉 致脑血栓形成。由于 不仅价廉易得,且对血管的损伤作用可 靠,已为不少学者采用。本研究中仿 及刘小光等描述的方法并加以改进, 采用 作为化学因子,同样制备了冠状动脉及大脑中动脉的血栓模型,所形成 血栓在病理光镜检查下表现为混和血栓特征,主要成分是血小板、红细胞及纤维 蛋白等,与文献报道一致。其血栓形成部位固定,成功率高,不失为一种较好的 血栓模型制备方法。 在冠状动脉血栓形成实验中,当血栓形成时,由于血流量的减少,冠脉血 流会出现反应性的增加,影响血栓的形成,并发生继发性溶栓。氨甲苯酸为纤溶 酶抑制剂,可抑制血栓的溶解,故当冠状动脉给予三氯化铁处理后动物币 氨甲苯酸,其目的在于预防血栓形成后的继发性溶栓。本研究将吸有 三氯化铁溶液的滤纸片贴于冠状动脉之前降支根部,成 功的造成了大鼠冠状动脉血栓模型。大鼠经 伊文思蓝染料后,可见病理模型组 及不同给药组缺血心肌出现不同范围的蓝染,该病理变化是由于冠状动脉经三氯 化铁化学刺激,其内皮受损,继而引起血栓形成后,受前降支供血区心肌陷于缺 氧状态而使其所属微血管通透性增高,缺血区边缘侧支血管内染料即可通过该通 透性增高的微血管壁逸出血管外,而出现蓝染。心肌缺血范围越大或程度越严重, 则蓝染面积及程度越大,故可通过蓝染面积评分表征心肌缺血程度。 本实验在进行心肌缺血面积评分的基础上进一步将左心室匀浆,从比色测定 得到的吸光度计算心肌伊文思蓝含量,对心肌缺血进行量化,后种方法我们称 之为伊文思蓝比色法 较评分法能够更精确的定量反映心肌缺血程度,并可准确 计算抗栓药物对心肌缺血的抑制百分率,从而使得这一模型更能够用于抗栓药物 作用强度的比较和量效关系及时效关系的研究。 此两项指标表明了 具有明显的对抗冠状动脉血栓形成及其所致心肌缺血作用 并呈剂量依赖关系,高剂量组 心肌缺血抑制百分率可达 临床上评价心肌缺血最主要的辅助诊断指标为的异常,即肢体导联 及相应的胸部导联 段人类 或 点大鼠 及 波随梗死时间推移而发生 的一系列动态改变。本研究在血栓模型制备过程中,对不同时间点的肢体 导联 点和 波的变化进行了测定,但由于大鼠个体差异较大,在进行模型制备 之前心电图即有异常的大鼠占受试动物相当比例未进行筛选,故测定结果的标 准差相对较高,不足以作为评价心肌缺血程度的主要量化指标。本研究中仅作为 辅助指标监测冠状动脉血拴模型制备的成功与否以及不同给药组大鼠心肌缺血的 改善程度。结果表明给予 及肝素后,大鼠 点的上移以及丁波的高尖有不 同程度的改善,提示了药物对抗冠状动脉血栓所致的心肌缺血的预防及保护作用二 近年来研究发现,大量氧自由基生成及脂质过氧化物反应增强是心肌缺血 损伤的主要机制之一作为反映氧自由基清除能力的指标,它是机体清除 氧自由基的重要酶类,对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。而脂质 过氧化反应的终末产物常被作为观察氧自由基生成和造成细胞膜损伤的指 标,间接反映机体内细胞损伤的轻重和脂质过氧化的程度。当心肌受损时,可 导致活性的降低,活性下降则无法清除过多的氧自由基,从而引发强烈 的脂质过氧化反应,破坏脂质细胞膜,导致组织细胞的损伤。故我们采用 活 力和含量作为指标从自由基清除能力和脂质过氧化产物角度反映药物的抗 心肌缺血作用,该指标能够迅速灵敏的反映心肌组织的受损程度。 研究结果表明, 能使三氯化铁诱发的冠状动脉血栓形成大鼠心肌活力 明显增强,含量显著下降,并呈剂量依赖性。 对 本无直接增强作用,推测 由于其抗凝抗栓作用能对抗冠状动脉 血栓形成,故能解除冠状动脉血栓形成后引起的心肌缺血及由此而产生的氧自由 基形成增加及清除降低,故而使用 后可使冠状动脉血栓形成模型大鼠心肌活力增强。同理, 可使冠状动脉血栓形成模型大鼠心肌缺血所产生的脂质过氧 化产物减少。本研究结果间接佐证了 的抗栓作用据文献报道,大鼠大脑中动脉血栓形成术后 时,行为学改变维持在 高峰阶段, 后逐渐恢复,而病理学检查表明随时间延长缺血软化灶范围和深度 有所增加,出现行为变化与病理改变不相平行的现象,可能是由于脑血供侧支循 环丰富建立代偿功能所致 故本研究中以大脑中动脉血栓形成后 的行为学评 分作为衡量血栓形成的指标,结果表明,病理模型组在血栓形成后 出现了显著 的神经行为学的改变,而给药组均有不同程度的减轻。脑梗塞急性期局部血小板聚集的同时血液凝固系统被活化,与此相应,大 量凝血酶产生并在脑血管内形成纤维蛋白血栓,同时,血小板猫附、聚集引起血管收缩从而导致脑微循环的障碍等给大脑中动脉闭塞大鼠模型应用新 型选择性凝血酶抑制剂 发现用药 天后 微血栓数目减少、脑血流 改善、梗死灶缩小, 天后神经症状改善 是否可能通过此机制改善脑缺血 程度,进而发挥脑保护作用,尚需进一步证实。 是迄今为止作用最强的特异 性凝血酶抑制剂,与肝素不同, 为直接 作用的凝血酶抑制剂,能与凝血酶以等摩尔比结合发挥其抗凝抗栓活性。两项实 验中,病理光镜检查均可见肝素组与 给药组相比,组织中有广泛的出血性改变, 而 组仅有轻度出血发生。本研究还表明受试 与国外同类权威产品具有相同的抗冠状动 脉血栓形成作用强度。心肌缺血面积评分、伊文思蓝比色法计算得到的 心肌缺血抑制百分率、改变、活力和含量测定以及病理检查两者 均接近。结 论 受试国产 具有强大的抗大鼠冠状动脉血栓形成作用,且具明显时效和 量效关系,单次后,作用随时间延长而减弱。 有效剂量为,其效应一对数剂量具有良好的线性关系,高剂量时抑制百分率达 以上,其 抑制剂量 为 。同剂量 与德 国 重组水蛙素具有相同的作用强度。国产 具有明显的抗大鼠大脑中动脉血栓形成作用,亦呈剂量依赖性, 其效应一对数剂量具有良好的线性关系,高剂量时抑制百分率接近 ,其 抑 制剂量 为 参 考 文献丁 吕莉,李欣燕,韩国柱,江和睦等 重组水蛙素体内抗凝活性的实验研究 中草药 吕莉,韩国柱等 重组水蜓素抗栓及抗弥漫性血管内凝血作用的实验研究 中国药学佘志,‘刘小光 徐理纳 一种能评价溶栓和抗栓药的大鼠中动脉血栓模型,药学学报,潘洪平 复方丹参滴丸治疗心血管的研究进展 广西医学, 周苏宁 邵伟 张文高等 黄茂注射液抗心肌缺血再灌注损伤的临床研究【 中国中西 医结合急救杂志,,于发,董国淑 白细胞、血小板和凝血酶与脑微循环障碍 国外医学脑血管疾病分册,综述 实验动物血栓形成模型的研究概况 任开环综述 韩国柱审校 在活体的心脏或血管腔内,血液发生凝固或血液中的某些有形成分互相粘集, 形成固体质块的过程,称为血栓形成 在这个过程所形成的固体质块称为血栓。 在生理状态下,血液中存在的凝血系统和纤维蛋白溶解系统呈动态平衡,既 保证了血液有潜在的可凝固性又始终保证了血液的流体状态。然而,有时在某些 能促进凝血过程的因素作用下,如物理、化学创伤、感染、免疫和代谢等因素, 打破了上述动态平衡,触发了凝血过程,血液便可以在心血管腔内凝固形成血栓。 凝血系统在流动的血液中被激活,进而形成血栓,是一个多因素参与的病理 过程,这一过程必需具备一定的条件 首先,血管内膜的损伤 内皮细胞损伤暴 露出内皮下的胶原,胶原激活血小板,继后凝血链锁反应被启动而产生了凝血酶。 血栓形成即是以在胶原暴露的局部形成持久性血小板粘集堆开始的。其次,血流 状态的改变。正常流速和正常流向的血液内,红细胞和白细胞在血流的中轴,外 层是血小板,最外层是一层血浆带,阻止了血小板和内膜的接触。当血流缓慢或 血流产生漩涡时,血小板得以进入边流,增加了和血管内膜接触的机会,同时凝 血因子也容易在局部堆积和活化而启动凝血过程。而且在电镜下可见血流缓慢时, 内皮细胞严重缺氧,变性坏死,丧失了抗凝因子合成和分泌,而且内皮下胶原也 得以暴露于血流,这样即可能触发凝血过程,导致血栓形成。另外,血液的高凝 状态如弥漫性血管内凝血综合征、妊娠、手术、高脂饮食、吸 烟和冠状动脉粥样硬化时,也可增加血栓形成的可能性。 由于血栓性疾病的研究是十分必要的,本文对近年来较为常用的一些血栓动 物模型加以介绍。 体外血栓形成法 原理体外血栓形成法是在体外旋转圆环内模拟体内的血流状态, 当转环以。的角速度在铅垂直平面上顺时针方向旋转时,在上下弯月面形成一个既 有回流又有二次流的复杂流动区,而且回流的中心主流冲击着弯月面,为血小板 颗粒的聚集,形成血栓提供了有利条件。 步骤 取静脉血,注如塑料环内,在血栓仪上以 转分转动,当血小板聚 集“雪暴”现象出现,则纤维蛋白原变纤维蛋白,纤维蛋白血栓形成开始,之后 血栓增长。转动 分钟后停止旋转,取下塑料环,将血栓倒在滤纸上吸干水分 测量血栓长度,称血栓湿重及干重。评价 体外形成的人工血栓经组织学研究证明,同体内形成的血栓有类似的 组织结构,头部为大量血小板及白细胞的聚集体,间有纤维蛋白与红细胞组成的 “白血栓”及部分“馄合血栓”。体部主要为纤维蛋白与红细胞的聚集体组成的“红 血栓”及少部分“混合血栓”,尾部为红血栓。该方法操作简便,设备不复杂,且 血液在体外转环内模拟人体血流状态形成血栓,可直接观察血栓形成过程,为血 栓及抗栓研究带来极大便利,适用于抗栓抗凝药物的药理研究,亦可做药物溶栓 作用的研究。半体内血栓形成法 半体内血栓形成法最常见的动物模型为动静脉旁路血栓形成模型 原理 血流中的血小板接触旁路循环中的丝线粗糙面时,发生翁附、聚集, 血小板聚集物环绕丝线表面形成血栓。 步骤 大鼠麻醉后,,分离出左颈动脉及右颈外静脉。取一内径为 ,长的聚乙烯管内套同一长度的 号丝线,并充满肝素生理盐水 以供 血栓形成的套管之用。另取一聚乙烯管插入左颈动脉,一聚乙烯管插入右颈外静 脉,并注入肝素 作为全身抗凝,然后套上内有丝线并充满生理盐水的聚乙 烯套管,以形成大鼠颈动静脉回路,术毕,放开颈动脉血流 ,中断血流拔下 套管,立即取出丝线用滤纸吸千残血,精密称重。 评价 该法形成的血栓结构类似动脉中的白色血栓,药物抑制此类血栓形成 除血流速度和血液豁度因素外,主要与药物抑制血小板翁附的聚集功能有关山。该 法简单、经济,是目前国内常用的血栓动物模型。 体内血栓形成法 , 物理损伤法 机械性损伤 原理 机械损伤血管内膜后,使内皮下细胞外基质裸露,促使血小板与胶原 接触而被激活和豺附,启动凝血过程,导致血栓形成。搔刮损伤血管内膜法 步骤 家兔麻醉后分离出股动脉,用 号针头从血管上端沿血管向下刺入血 管段内,并顺势注入生理盐水冲净血管内的血液,后抽出针头,在用 号微型刮 匙沿刺破孔送入血管内,反复搔刮血管内膜,以刮出少量血管内膜为宜。然后逐 层缝合,关闭皮肤切口。 评价 该方法简单易行,成功率 ,也可用于制备静脉血栓模型。手术剥离血管内膜法 步骤 家兔麻醉后分离股动脉,用直持针器钳夹股动脉至第二档,持续 分 钟,松开后分别在远近端各上一个血管夹,在损伤血管的远侧边缘,用显微剪刀横形剪开股动脉管径的 ,用镊子轻柔的将损伤的血管内膜取出,生理盐水冲洗 管腔后,缝合皮肤。 评价 在施行肢体再植再造及游离皮瓣手术的急性外伤病人中,常存在不同 程度的血管壁的挤压伤,内膜的撕裂、剥脱以及血流淤滞等现象。本实验采用的 血栓模型较好的模拟了上述情况,具有较好的临床参考价值。 球囊内皮剥脱术 步骤 家兔麻醉后,分离股动脉,经右股动脉远端置 球囊至股 动脉近端加压致 个大气压,然后拉动球囊由近端向远端剥脱血管内皮,最后 抽出球囊,同时监测股动脉压力。 评价 球囊损伤后血管结构被破坏,内膜弹力板及中膜正常结构消失,管腔 内有血栓形成,整个管腔完全闭塞,能成功的形成兔股动脉血栓。木模型成功率,且血栓形成后均导致血管腔完全闭塞。其次模型操作简便,易于掌握,球 囊大小压力均易于控制,使不同血管损伤程度趋于一致,因而是研究溶栓药物疗 效稳定且可靠的动物模型。电流损伤法 原理 利用电刺激,破坏局部的血管,使血管内膜损伤,血小板钻附聚集于 刺激电极下形成血栓。 电刺激颈总动脉血栓形成法 步骤 大鼠麻醉后,分离颈总动脉,分离大鼠左颈总动脉,置两根银制电极,超 声探针置远心端。用电刺激器以的直流连续刺激大鼠颈动脉 。用超声 血流量仪记录血栓形成时间从刺激开始至颈动脉血流量为“零”的时间, ,即为血栓形成时间‘ 评价 此实验中,形成的血栓成分在电刺激区以血小板及纤维蛋白及红细胞 为主,在电刺激远端以纤维蛋白及红细胞为主。在形态结构上与人类血栓相似, 适用于抗血栓形成药物的筛选 电刺激冠状动脉血栓形成法 冠脉内直流电刺激法 家犬麻醉后,气管插管下人工呼吸,开胸暴露心脏分 离冠状动脉左旋支,放入电磁流量仪探头记录血流量。于电磁流量仪探头远端将 正电极穿过左旋支管壁做刺激电极。为保证电极与血管内膜接触并防止刺激电极 滑脱,可将电极弯成 ,呈“ ”形与血管内膜相贴 负电极缝在胸部皮下,以 形成回路。用畔直流电刺激 分钟,乃形成血栓。另外,血栓形成时, 由于血流量的减少,冠脉血流会出现反应性的增加,而影响血栓的形成,为避免 这种情况的发生,可在电极刺激部位放置一缩窄器 ’一, 缩窄器的规 格以减少冠脉血流 为宜,此时刺激时间可大大缩短, 直流电刺激分钟’,血栓即可形成,或当电磁流量计显示流量下降为 时即可停止刺激,血 栓形成时间多为 分钟左右 评价 此种方法形成的血栓与人类动脉血栓形态结构类似,其主要成分为血 小板、白细胞等。是国内外常用的冠脉血栓形成方法。 冠脉外直流电刺激法 家犬麻醉后,暴露心脏,分离左冠前降支,剪一塑 料片置于游离的冠脉下方,将双 型刺激电极置于塑料片上,直流电 范围 内可调,当刺檄部位冠脉外膜呈黄褐色并失去弹性及远端冠脉充盈状态消失后既 停止刺激。 评价 此法形成的血栓组成近似人冠状动脉血栓、比之冠脉内刺激法血栓形 成耗时短,并保持了动脉管壁的完整。此法成功的关键是刺激电量的选择,适当 的电量最大限度的减少外膜损伤,在最短时间内造成内膜损伤。 电刺激骼动脉血栓形成法 等用电刺激法制造兔股动脉血栓模型,手术暴露颈动脉系统,切开颈 动脉植入动脉套管,将连接有刺激正电极的导线延套管插入一侧骼动脉,负电极 置于皮下,正负电极相连于 电池,刺激 分,血栓形成。当以另一侧骼动 脉作为溶栓对照组时,可将导线退至腹主动脉,再插入另一侧铭动脉,行电刺激。 评价 该方法对动物损伤小,可造成双侧骼动脉血栓,所形成血栓为富含血 小板血栓,与人急性血栓形成过程相似,可用于溶栓药物的评价,但技术要求相 对较高。动脉异物法 股动脉异物法 将股动脉内放置螺旋钢丝线圈,造成动脉内膜损伤,局部血流动力学改变 激活凝血系统,促进血小板凝集,释放一系列活性物质,致血拴形成。 步骤 家犬麻醉后,分离股动脉,从股动脉远心端向近心端方向安插自制单 股螺旋钢丝,进入血管内腔后行血管缝合术,逐层缝合,术毕。 评价 此法可靠易行重复性好,血栓由血小板、白细胞及纤维蛋白构成,目 前多用于血栓放射免疫显像方面的研究‘ 冠状动脉异物法 原理 冠状动脉内膜受损,冠脉腔狭窄形成湍流以及异物的诱导,均可激活 血小板,使其乱附性和聚集性增加,血小板猫附于受损内膜下的胶原和异物, 激 活凝血途径形成血栓。 步骤 杂种犬麻醉后,气管插管下人工呼吸,开胸暴露心脏,分离前降支, 远心尖端置电磁流量仪探头,近心尖端用一 细钢丝插入冠脉腔内,进入深 度 左右,将钢丝失贴于冠脉内壁,反复推拉 次损伤冠脉内皮,取出钢丝,经 此孔再插入一直径细铜丝于冠脉内,深度 ,用一细小止血钳夹住 铜丝进入孔,并使冠脉狭窄 ,术毕。 评价 本法除直接影响血小板功能外,铜丝的植入也可能诱发冠脉痉挛加速 血栓形成,对研究冠脉血栓形成。抗血小板聚集和抗血栓素合成药对血栓性 心肌 梗塞疗效和药效学和药理学的研究及溶栓治疗是一种有价值的模型。 另外,还可以利用心导管技术将铜网圈置入犬冠状动脉内,使之在局部形成 血栓,该方法操作简单,重复性好,动物所受创伤小,血栓形成耗时短,血栓 形成血管及部位可自由选择,但需同时行冠状动脉造影术。 结扎法 原理 手术线结扎静脉后,引起局部血流淤滞。缺氧,导致血管内皮损伤 启动凝血系统,而致血栓形成。 步骤 制备下腔静脉血栓模型时,大鼠麻醉后,开腹,分离下腔静脉,于 左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉,缝合腹壁,结扎 小时重新开腹,于结扎 线下方 出夹闭血管,剖开管腔,取出血栓,以血栓重量或形成百分比为指标 该法尚可用于急性犬股静脉血栓形成模型的制备四,手术切开显露双侧股静脉,游 离长度约 无损伤线在其近、远端分别结扎,持续 小时,人为造成犬后肢股静 脉血栓。 评价 所形成血栓为红色血栓,是简单易行的静脉血栓模型。 光化学法 自从八十年代中后期,国外学者根据光化学反应的原理研制出一种新的脑缺 血动物模型后,此方法在实际应用中得到了发展,近几年的应用报道日益增多。 原理 将光敏物质引入机体后在特定波长光线的照射下,发生光化学反应而 产生单线态氧等活性氧,继而损伤血管内皮细胞,激发血小板聚集而形成血栓 光化学诱导大脑中动脉血栓形成 步骤 大鼠麻醉后选择的近端和从嗅束至大脑下静脉间的一端为 光照部位。光照分两步,第一首先将绿光冷光源光纤移至起始部,经股静脉 注入光敏剂四碘四氯荧光素钠,持续照射,再将光纤移至嗅束至大脑下静脉 段的 血管表面,再次注入光敏剂,再持续照射,光照结束后,依次缝合肌肉及皮 肤,模型制作完毕。 光化学诱导微血管血栓形成 步骤 从大鼠尾静脉注入光敏剂血叶琳,后进行肠系膜微循环照射。选 择直径 的细静脉作为血栓形成的靶血管,用落射荧光显微镜的 汞灯 作光源,经紫外滤光片波长 照射在靶血管上,光斑直径为 ,光照,用落射荧 光显微镜连续观察类似的方法也可用于脑微血栓模型的建立 光化学法诱导血栓形成常用的光敏物质有荧光素钠、血叶琳、二碘曙 红,伊文思蓝等,用于照射的光源为单色绿光 滤去紫外光的汞灯激光等。 评价 光化学法诱导的及微血管内的血栓为富血小板的白血栓,微血栓 形成的全过程可直接通过显微镜进行观察,并可通过计算机图象采集系统读 入, 用计算机图象处理技术进行分析,定量计算血栓大小 ,对研究血栓形成过程 及定量评价抗血小板聚集药物的效果是十分有用的。 化学药物致血栓形成法 原理 利用化学物质损伤血管内膜,促进血小板猫附,聚集和促进血管活性 物质的释放,形成闭塞性血栓。 角叉菜胶至大鼠尾动脉血栓形成 角叉菜胶是一种大分子的多糖,常被用于作为致炎因子,它所诱发的大鼠 尾动脉血栓形成与血管内炎症密切相关,已知局部炎症时释放的大量炎性物质 如白介素一 ,肿瘤坏死因子等可破坏正常血管内皮细胞维持血凝和纤溶之间的平衡 作用从而促发血栓形成 此外角叉菜胶在体外能引起人血小板聚集’ 步骤 昆明种小鼠,角叉菜胶用生理盐水配成 和 等浓度皮下注射,每 日 次,连续三天。检测尾部形成血栓的指标有 个 一为血栓形成出现率,二 为血栓形成区平均长度。注射角叉菜胶后多数动物尾尖部在 小时出现暗红色 血栓形成区,并逐渐向尾根部扩大。 小时经紫纷变为黑色,随后干细脱落。 评价 该方法病理学检查可见病变区较大血管呈炎性改变伴有混合性血栓形 成,血栓形成发生在尾部,界限明显,可从体表测量血栓形成的范围和程度,可 利用该模型检测多种药物的抗栓效应。但需注意保证温度等实验条件的一致性。 至颈总动脉和大脑中动脉血栓形成 步骤 大鼠麻醉后,暴露颈总动脉,将吸有 溶液的棉布条包裹动脉或暴露右侧位于嗅束及大脑下静脉之间的一段大脑中动脉,将吸有 的 溶液川的小片定量滤纸敷在该段中动脉上,持续 分钟以损伤局部血 管壁形成血栓 评价 该模型血栓的形成为混合性血栓,主要成分为血小板、红细胞和纤维 蛋白。并且血栓形成部位固定,既可评价溶栓因子又可检验抗栓因子,为研究抗 栓药物提供了较好的途径。 月桂酸所至大脑微动脉血栓形成 步骤 鼠麻醉后,分离一侧颈动脉系统, 月硅酸盐分两次分别经颈外动 脉及颈总动脉插管缓慢注入颈内动脉,注入时间需大于 秒,两次间隔 小时,造成大脑微动脉血管内皮损伤而致血栓形成。 评价 该模型无须开颅,对创伤小 操作简便,因手术操作而导致的死亡率 几乎为零,血管内皮的损害及紧接着血栓的梗阻都是有选择性的发生在大脑中动 脉的一些小分支,大脑中动脉内皮无损伤或血栓形成,特异性较高,且大脑梗死 范围及行为学改变较恒定,所形成血栓主要成分为纤维蛋白。 胰蛋白酶至颈动脉总血栓形成 步骤 家兔麻醉后分离一侧颈总动脉,以两个动脉夹夹闭一段颈总动脉,用 显微外科动脉夹夹住近心端和远心端,两端分别插入 号针头。经近心端针头用输 液泵匀速灌注。 胰蛋白酶随后以相同速度灌注生理盐水冲洗,灌注液 经远心端排出拔出针头并用无创伤性针线缝合针孔,打开动脉夹使血流复通。 评价 该模型所至血栓富含血小板和纤维蛋白,类似于临床上血栓形成的情 况。硝酸银致冠状动脉血栓形成 步骤 大鼠麻醉后,开胸暴露心脏,用微量玻璃导管将 硝酸银加至左冠状 动脉前降支表面, 分钟后腹腔注射氨甲苯酸以预防血栓形成后的继发性纤 溶。持 续 分钟 血栓乃形成,以心肌梗死面积评价血栓的形成。血栓诱导剂致动脉血栓形成 是利用一些促进血栓形成的药物,注射于体内或某一血管中,造成血栓形成。 可造成肺血栓、脑血栓及 模型等以观察药物的作用。 用于动物模型的血栓诱导剂有 肾上腺素、胶原、前列腺素内过氧物及 凝血酶。这些诱导剂通过三条途径诱导血小板的聚集 一直接作用于血小板二 促进血小板释放内源性 轻色胺 三促使血小板合成内过氧物血栓素 ,进而导致血栓形成。 脑动脉血栓模型 步骤 大鼠麻醉后分离右侧颈总动脉并结扎颈外动脉分支和颈总动脉向心端, 于右颈总动脉远心端插入三通管,向右颈总动脉注入复合诱导剂凝血酶 、肾上腺素 ,比例 后,再 由三通管注入 伊文氏蓝 ,断头取脑,组织匀浆后通过比色法测定脑组 织中伊文氏蓝含量,从而检测血栓的形成。 评价 所形成血栓为血小板血栓,血栓主要位于小动脉和毛细血管,在同侧 大脑半球形成的血栓弥散,不固定。肺血栓模型的建立 步骤 小鼠以 复合诱导剂 胶原 肾上腺素 注入尾静 脉,观察记录 内小鼠死亡数,计算死亡率,或从小鼠尾静脉注射一定剂量的凝血酶进行攻击,并观察记录 内小鼠是否死亡,统计死亡率,从而确 定凝血酶合适的攻击剂量,文献报道采用 凝血酶作为攻击剂量,可使小 死亡率达评价 上述方法所形成血栓均为富血小板的白色血栓,精确性较好,有利于 评价药物疗效。 急性弥漫性血管内凝血模型的建立 步骤 家兔称重后,按体重计算出凝血酶 和氨基己酸 的量, 一并以生理盐水稀释至混匀,以 的速度自兔股静脉恒速滴注测定及 试验以检测 的形成程度 评价 病理检查可见肺毛细血管及肾小球内均有弥漫性微血栓形成,成分为 血小板。可计数 个肾小球中肾小球微血栓的形成率,定量检测 的形成程 度。该法成功率很高,为研究抗 药理学提供了一种实用的方法。 血栓栓塞性疾病的发病率甚高,对于血栓性疾病的诊断和防治己受到国内外 普遍的重视。上述血栓实验方法、指标及原理各异,各有其优越性和所适用的研 究类型,在应用时应根据不同的目的而选择合理的研究方法。参考 文献 徐红,吕莉,韩国柱,王春富 重组水蛙素抗家兔体外血栓形成作用的实验研究 大连医 科大学学报, 陈奇 中药药理研究方法学 人民卫生出版社,陈铁军,陈瑞芳,杨果杰 一种家兔股动脉血管内制作血栓模型的简便方法 实验动物科 学与管理, ,盛加根,曾炳芳低分子量肝素对损伤后小动脉血栓形成的防治作用 中华显微外科杂志, ,李春坚,黄竣,杨国平 球囊损伤家兔股动脉血栓形成模型 南京医科大学学 报, 川 张丽萍,牟善初,余霞君 州激酶对实验性血栓的预防作用 中国循环杂志, 谷宏越,李艳波,黄永鳞,邹玉臣 犬冠状动脉血栓形成模型的实验研究 哈尔滨医科 大学学报,,万卫星 血栓动物模型的重组水蛙素显像研究 中华核医学杂志, 方唯一,赵华月,张扬刚 实验性冠状动脉血栓形成致急性心肌梗塞动物模型的研究 中 国循环杂志, 潘伟民,叶红华,蒋建设,冠状动脉血栓形成动物模型的建立 临床心血管杂志, 一 马怡,徐秋萍 血栓形成的实验动物模型研究概况 中药药理与临床 赵秀梅,刘育英,尹玲 微管内血栓形成实验模型的建立与应用 微循环学杂志,郑宏宇,李媛媛,赵汉青 新型溶栓药一葡激酶对实验性脑微血栓溶栓效果的观察 微 循环学杂志, 朱晰,吴嘉 赵虎成 血拴的三维重建与动静脉血栓形成过程在体研究 中国血液流变 学杂志 山 胡三觉,田巧莲 一种新的体内血栓形成动物模型 中华血液学杂志,王莉莉。裴其应,梅其炳抗角又菜胶引起的大鼠血栓形成作用及其对血液流变学的影响 中国药理学通报, 砰 今任开环,周琴。李卫平,韩国柱 重组水侄素对大鼠大脑中动脉血栓形成的抑制作用 中 国药理通讯 一 卜吕莉 王绝春,韩国柱,李欣燕 重组水蛙素抗栓及抗弥漫性血管内凝血作 用的实验研 究 中国药学杂志,