比色法测定南蛇藤中总三萜类成分的含量

比色法测定南蛇藤中总三萜类成分的含量 ====================================================================== 作者:季春 张融 胡晨 游文玮 佟丽 【摘要】 目的建立南蛇藤提取物总三萜类成分的含量测定方法，为南蛇藤药材的质量控制提供依据。方法采用比色法进行测定，以齐墩果酸为对照品，样品经5%香草醛-冰醋酸、高氯酸显色，在560 nm处测定。结果在0.42,16.8 1范围内吸光度与含量成良好的线性关系，r=0.999 3(n=7)，平均μg?ml- 加样回收率为98.22%，RSD=3.77%(n=6)。结论该法操作简便、快速、灵敏，测定结果准确、可靠，可作为南蛇藤药材的一种定量方法。 【关键词】 南蛇藤 总三萜 比色法 南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.系卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属Celastrus藤本植物，又名过山风、黄藤、降龙草等。南蛇藤始载于清代《植物名实图考》,1,，其藤茎、根、叶、果实、种子均可入药，药性辛温、有小毒，功效祛风、除湿、活血、解毒、消肿，主要用于治疗筋骨疼痛、腰腿痛、风湿性关节炎、跌打损伤、痈肿疮疡等病症,2,。前期实验结果表明，南蛇藤提取物具有较好的抗炎镇痛作用，并对大鼠佐剂性关节炎具有较强的抑制作用,3,5,。为进一步控制药材质量，本实验采用香草醛-冰醋酸、高氯酸比色法，对南蛇藤提取物中的总三萜类成分进行含量测定。 1 仪器与材料 1.1 仪器HP8453紫外-可见光分光光度计(惠普公司 美国)，Sartorius CP225D十万分之一天平(赛多利斯有限公司 德国)。 1.2 试剂高氯酸、冰醋酸、醋酸乙酯、甲醇、香草醛均为分析纯，由广州化学试剂公司提供;齐墩果酸对照品购于中国药品生物制品检定所(批号110709-200304);南蛇藤从广东省药材公司购买，经南方医科大学中医药学院中药鉴定教研室马骥教授鉴定为南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.。 2 方法与结果 2.1 对照品溶液的配制精密称取齐墩果酸对照品10.5 mg，置10 ml容量瓶中用甲醇定容。再准确移取2 ml此溶液至10 ml容量瓶中并用甲醇定容，制成0.21 mg?ml-1对照品溶液。 2.2 供试品溶液的制备称取南蛇藤原药材1 000 g，用8倍量75%乙醇回流提取2 h，过滤，滤渣再用5倍量75%乙醇回流提取1 h，过滤，合并滤液并浓缩至每克浸膏相当于原药材2,4 g。浸膏用蒸馏水洗涤，60?恒温箱干燥24 h。精密称取该干燥粉末100 mg，用甲醇超声提取30 min，转移至100 ml容量 瓶中定容。准确移取4 ml至100 ml容量瓶中用甲醇定容，即得浓度为0.04 mg?ml-1的供试品溶液。 2.3 测定波长的选择取齐墩果酸对照品溶液，(空白对照为不加对照品溶液用醋酸乙酯稀释至刻度的混合溶液)加5%香草醛-冰醋酸0.4 ml，高氯酸1.6 ml显色,6,后，进行可见-紫外全波长扫描。结果表明，对照品溶液在560 nm处有最大吸收峰(如图1)，多次重复，峰形一致且空白对照无干扰，故选择560 nm作为样品测定的波长。 图1 齐墩果酸可见-紫外吸收峰图 2.4 标准曲线的制备精密吸取齐墩果酸对照品溶液0.02，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 ml，水浴挥干，分别加5%香草醛-冰醋酸0.4 ml，高氯酸 6,，置70?水浴加热15 min，迅速冰浴冷却后，转移至10 ml的量1.6 ml, 瓶中加醋酸乙酯定容至刻度，摇匀。在560 nm波长处测定吸收值A，空白对照为不加对照品溶液而直接加5%香草醛-冰醋酸0.4 ml，高氯酸1.6 ml，用醋酸乙酯稀释至刻度的混合溶液。 标准曲线:A=59. 983C-0.020 6，其中C为浓度(mg?ml-1)，A为吸收度。 相关系数:r=0.999 3，线性范围为0.42,16.8 μg?ml-1。 2.5 稳定性实验取样品溶液，照“2.4”项下操作，每隔0.5 h测定一次，前5次测定值RSD=5.16%(n=5)，结果表明，本方法在2 h内基本稳定。 2.6 回收率实验精密称取样品4 mg于100 ml容量瓶中用甲醇定容，精密称取齐墩果酸对照品4 mg于10 ml容量瓶中用甲醇定容，准确移取2 ml供试品溶液和75 μl对照品溶液于具塞试管中，共6份，按制备标准曲线项下操作，测得吸收值并计算含量，经计算回收率为98.22%。结果见表1。 2.7 精密度实验精密吸取对照品溶液0.4 ml，照“2.4”项下操作，结果RSD=3.96%(n=10)。 2.8 样品的含量测定精密量取供试品溶液2 ml共6份。按标准曲线制备相同操作，水浴挥干，分别加5%香草醛-冰醋酸0.4 ml，高氯酸1.6 ml，置70?水浴加热15 min，冰浴冷却后,转移至10 ml量瓶中加醋酸乙酯稀释至刻度，摇匀。在560 nm波长处测定吸收值,代入标准曲线方程，计算含量。结果总三萜类成分平均含量为37.93%，RSD=1.6%(n=5)。结果见表2。表1 加样回收率测定结果表2 含量测定结果 2.9 药材含量测定精密称取南蛇藤药材粉末(过40目筛)40 mg，置50 ml量瓶中，加入甲醇20 ml，超声提取90 min，滤过，用适量甲醇洗涤药渣定容至50 ml，摇匀。吸取0.1 ml，置10 ml量瓶中，照“2.8”项下操作，代入标准曲线方程，计算含量。结果总三萜类成分平均含量为12.87%， RSD=3.39%(n=5)。 3 讨论 目前总三萜类成分的含量测定多采用重量法和比色法,7,，考虑到重量法适合对原料药材进行定量鉴别，实验操作复杂，受各种试剂的用量、反应温度、反应时间等诸多因素影响较为显著。本实验直接以甲醇作为溶剂，以醋酸乙酯制备各溶液，采用了香草醛-冰醋酸、高氯酸比色法进行测定，相比其他文献报道的比色法减化了实验步骤，缩短了实验时间，同样达到很好的测定效果。实验结果表明，若反应条件控制得当，测定结果稳定，重复性好，本实验方法可作为本药材质量评估的一种检测手段。 致谢:在本课研究过程中，感谢中药化学教研室朱全红教授给予的悉心指导，感谢课题组贺丰博士、辛增辉硕士给予的帮助! 【参考文献】 , 黄泰康(现代本草纲目,M,.北京:中国医药科技出版社，2001:1859. ,1 ,2, 张 舰，许运明，王维民，等. 南蛇藤提取物体内抗肿瘤作用的实验研究,J,.中国中药杂志，2006，31(18):1514. ,3, Li Tong，Kamal D Moudgil. Celastrus aculeatus Merr. Suppresses the induction and progression of autoimmune arthritis by modulating immune response to heat-shock protein 65,J,.Arthritis research & therapy，2007，9(4):R70. ,4, 杨蒙蒙，佟 丽，陈育尧(南蛇藤不同提取部位的抗炎作用实验研究,J,.中药新药与临床药理，2004，15(4):241. ,5, 杨蒙蒙，佟 丽，陈育尧.南蛇藤乙醇提取物抗炎作用实验研究,J,.中医药学刊，2005，23(1):51. ,6, 舒任庚，刘玉凤，舒积成(比色法测定青钱柳中三萜类成分的含量,J,.中国现代应用药学，2006，23(5):406. ,7, 周俐斐，芦柏震，侯桂兰(中药三萜类化合物的提取分离及测定方法研究进展,J,.海峡药学，2007，19(3):62.