【doc】黄瓜花叶病毒香蕉株系的衣壳蛋白基因克隆和序列分析

【doc】黄瓜花叶病毒香蕉株系的衣壳蛋白基因克隆和序列 黄瓜花叶病毒香蕉株系的衣壳蛋白基因克 隆和序列分析 二3一=1L=r I2卷第!j;u I9969川 l学撤 f[tlNre~EJOURNAL0F?ROLOGY .sq7 Vol12No3 Septf996 黄瓜花叶病毒香蕉株系的衣壳蛋白基因 克隆和序列分析 季华平胡晋生KellyBarry范怀忠 ————— —— ' 摘要对侵染香蕉的黄瓜花叶病毒广东3个株系的丧壳聋白(CP)基因,进行r克隆和序 fI列分析提纯病毒RNA为模板,应用RNA反转录酶【AMV)合戚cP基因cDN再用Taq DNA聚什酶进行PCR扩增通过常规基田克隆法将扩增的CP基因克隆^载体,选取每一株系 的CP基罔载体达方1旬柙同和相反的l符一个克隆.进行插^片段的全序列分析结表明, 姆一重组克降测序长约750个棱苷酸,fE肆系其插^方向相压的两个再组克隆.其测定的序列 完垒瓦朴(基田长657个枝忤酸.可编码218十氨基畦3个株系MMBS和CS问核 酸序 列同源率为%65%一97l1‰其中.BS与关系紧密,而与MM关系稍远3个株系与其之 CMV株系相比较,显月了t~(TvlV砸组I相比与亚兰且?有较紧密的同源关系.序列分析结果表 明:.糸3个分离物可划分为3个同的株系 关键词黄瓜花叶病毒.香蕉株系,克隆…析秭移芳 香蕉花叶病为华南香蕉生产的重要限制因素之一".o特别是随着组培苗应用面积的扩 大,发病越来越为严重,一般地块发病率为20%一40%.个别重病地块高达90%.损失严 重. 此病病原虽在1930年就被鉴定为黄呱花叶病毒(Cucumbermosaicvirus.CM v),但至今对其研究不多从有限的文献看,大多数作者都认为其病原为CMV的一 个株系,即香蕉株系=但也有认为有两个株系或3个株系的".因此有关病原的调查 和鉴定就成为当前迫切需要解决的一个重要问题. 1991—1993年我们在广东省广州市天河和黄埔区,以及顺德番禺,高州东莞新会 等市县的香蕉产区进行病害调查,发现了三种不同类型的花叶症状,即断续条纹类(Broken Streak,BS),连续条纹类(ContinuousStreak,CS)和斑驳类(MottleMosaic,MM).通过 病毒形态学,生物学,血清学和生物化学等方法可将这三类症状的分离物初步划分为3个不 同的株系(另文发表)= 核苷酸序列分析是株系鉴定的最根本方法.香蕉花叶病在CMV的核苷酸序列虽至今还 没有研究报道,但其它植物CMV的核苷酸序列却已报道甚多,其中已对整个基因组序列分 析的有:CMV—Q,CMv—Fry和CMV—Y022t)~.此外还有约25个株系已做过部分RNA 组份和基因的序列分析',这些都是很好的参考资料. 本文通过常规基因克隆方法,将香蕉CMV3个分离物的CP基因进行了分子克隆,并利 高等学枝博上学斟专砸科研基金和广衷省科学基金贷助项目, l华南世北^学檀保系,J州510642:2夏威夷太学植病系.美国,96822 1995fl-月3口收稿,9l1日修 / / 幺 ,,, /=卜./\/ 236病毒12卷 用双脱氧链终I法对所克隆的CP基因进行了核苷酸序列测定 材料和方法 l病毒和试剂3十分离物的病毒经苋色藜(Chenopodium)单斑纯化通过将通烟 (Nicotia~atabacumCV.HV38)作繁殖奇主,参照Lot等.法提纯病毒cDNA合成试剂盒TaqDNA 聚合酶受体菌EscherichiacoliDH,DNA序列分析试剂盒.限制性内切酶等分别购于Promeg',~USB 和Dupont公司 2提纯病毒的RNA抽提各分离物的提纯制剂分别添加 0lmol:%Trls,1%SDS,1mmol:'LEDTA20(ke,g,~al Bentonite,20itg,~l蛋白K酶,用等容积重蒸酚抽提5分钟后加氯仿继续抽提5分钟离心取f:清液继续 酚氯仿抽提2次,乙醇沉淀,悬浮沉淀物于5叫lS11E中 3引物的设计和台成 根据已发表的CMV两亚蛆株系的(基因序列'合成引物.游(5端,引物HPL一93—309为:5 一 CATCGACCATGGACA/La,TCTGAATCAAC一3,与位于CMVRNA3的第 1258—1277(亚组I)或第l221一I248fCMV亚组?)的枝苷酸序列相同;下游引物(3端) HPL-93-359为:5一CTCTCCATGOGTTTAGTGACTTCAGACAG一3,位T CMVRNA3的第1981—2000(亚组J或第1955—1974(亚组?)的棱苷酸序列互补为了克降方便在 两引物的5端,分别加上丁Ncol酶切位点. 为了准确进行序列分析,在初步序列分析的基础上.分别在CP基因的中间序列位置设计了两个方向相 反的引物:HPL一94—128为:5一GCrTGT1GCGCATTCA一3HPL一94—129为,5 - GCG((1ATACTGATAAAoC一3.两引物分别与位于CP基因的第306—323棱苷酸序列相同 或第453-47I的核苷酸序列互补 4PcR扩增及产物纯化 3个分离物首先进行CP基因的eDNA合成,再进行PCR扩增eDNA合成采用Prome~公司Riboctone 试剂盒推荐的方法.纯化的病毒RNA在70?预搏【O分钟后.加4Ofttool皿CP基因下游引物 lttPL-93—35钟,在37?F保温15分钟后,加15cDNA合成缓冲液(250mmol儿1弛一Ha pH83,250mmol:'LKC1,50mmol几M鲫2,25mrnol,%SepermJdine,50mmolmDTT);5mrnol且一四神d cLI1RNA酶抑制剂(25U).25#1~mrnot几Na—Pyrophosphate.1lAMv反转录酶(25U),总容积为25it1 在42?下保温I小时其PCR反应采用常规法进行反应程序为:94?4分钟一94?1分钟,5o?I 舒钟,25个循环一5o?10分钟 PCR扩增后.取出11PCR产物进行I%琼脂糖凝胶电泳检测对PCR中扩增的CP基因DNA片段 用电洗脱法回收,用酚和氯仿分别抽提一次.乙醇沉淀,沉淀物悬浮于50It1TE中备用 5CP基因的克隆和重组子的筛选CP基因克隆按常规法进行.纯化的CP基因片段经Nml酶切后,直接 克隆于载体pB1525(PlantBiotechnologylnstitute&askatoon,Oalmda)的NcoI位点上重组质粒经碱法或煮沸 法"抽提后经酶切和在1%琼脂糖凝胶电泳后筛选重组子 6核苷酸序列分析策略及方法. CP基因加上其3'嵩非翻译区共有约750个枝苷酸.采用位于克隆载体和CP基因不同位置的4个引 物,可准确地将克隆方向相反的同一CP基因进行按苷酸序列分析.4个引物分别为:NOS一可购干Promega, USAgHPL一93—309HPLOA一128和HPL一94—129.共测定3个分离物的CP基因(6个重组克隆)的核 苜酸序列 测序方法采用取脱氰链终止法.除模板制备采用修饰的碱法?外.其它参照Seqt~oaseVersionZ0 DNASequenmgKitfUsB公司.USAJ推荐的方法进行修饰的碱法为:在质粒抽提后,加酚和氯仿各抽 提一次,上清液经100Itg,~lRNase消化.加酚和氯仿各再抽提一次,上清波经乙醇沉淀.沉淀物悬浮f 50ItlTE中.在UV一1200丹光光度计(ShimadzuCorpKyotoJapan)土二测定浓度.每个样本用5一g重组 I 3JtJl事#-卜-篮'7Url病毒胥焦株系的农壳蛋白基『克隆和序列分析237 DNA世,KJ}州分析 l列分析结粜输^PC:Genc0ntelligenetics,Inc)和GCG(Universi~'ofWisconsinGeneti~ComputerGroup cbputcrPro哺mGCGInc,Madison,Wl,USA}电脑[硎终系境进行分析3个CMV番焦分离物(1P基 『的棒畦l刊~giflJ导的簧陵】陈相t-k,鞍外.迁与GcncBank(EMBLRcl~tse37)p的CMV三f1个 体乐f埘绀【的14l,,,i4,iV_ill【I的6个)的相关序列进行E较 结呆 lCP基因的合成及PCR扩增 1,3个分离物的提纯制剂.分别经抽提RNA,eDNA合成后.{进行PCR扩增它 们的扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳中都只呈现一条分子量为750bp的DNA带,没有其 它怍特异DNA带产fll.这一条带的分子量与颟删的CP基蚓分子量相,阮明 这条带H为CP基困的扩增产物. 2重组克隆的筛选及鉴定 磐PCR扩增的cP基因克隆于pBI525后,转化EcellDH5e受体菌,所获得的部分克 隆绎碱法或煮沸法抽提质粒后.进行1%琼脂糖凝胶电泳.含有CP基因的质粒明显较不含 质粒的分子要人纤Ncol酶切结果表明重组克隆质粒都含有一条分量匀750bp的 DNA带(2).f}个分离物选取重组克隆约4—6个37~Jil进行部分核苛酸序列分析 【3个分离物CP基_罔的RTPcR 产物的凝胶电泳 Figtire1CPRTPCRDmductsofThree CMVisolatesseparated dectrophoreti~d]yin1%agarosegel tHealthyCK(健康对照)2BS;3MM;4a 幽2一绀克隆质粒Ncol酶切站束 Figure2NcoIrestrictionmappingof recombinantplasmidDNAsWhich containedthefulllengthcDNAs 0fCMVCPgenes 12BS'3MM4cs 3CP基因的核苷酸序列分析 每个分离物的重组克隆首先利用克隆载体pB1525的引物NOS—T进行桉苷酸序列分 析,从在每个分离物的不同克隆中选出CP基冈插^载体的力向相反的两个重组兜隆,并 利用四种不同f物进行完整CP基困的核苷酸序列分析,共测定3个分离物的6个克隆.每 个克隆测序长约750bp,每一分离物的插入方向相反的哺个重组克隆其序列完全瓦补.将 238病毒'报l2苗 所有范隆序列输入GCG电脑}可络的分析结果表明.任一750bp的序列都只有一个开放ll剜读 框(OpenReadingFrame.ORF),其K度为657bp.可编码218个氢基陵:图3列出了3个 分离物这一开放阅读枉的核甘=酸序列,图4列{}{了dI核苷赜推导的氨基酸序列. 43个分离物CP基因核苷酸及氨基酸序列比较 3个分离物CP基目棱苷酸车"氩基酸序列同源率分别介干96.6%一971%和954%一98.2% 之lnI.其+】BS与CS关系较紧密,MM与(s关系稍远. 5与其它CMV株系CP基因的核苷酸及氨基酸序列比较 对3个分离物的CP桉苷酸和氨基酸序列进行PC/Gette和GCG电脑网络分析.结果揭 小3个分离物与CMV亚组I具有比与亚组?较紧密的同源关系(5).它们与CMV亚 组I的株系CMV—AS,CMV—NT9和CMV—CHlNA显l『9O7%一942%的核苷酸同源 率和922%一968%的氨基酸同源率ifri与CMV亚组兀的株系CMV—WL和CMV一0显 示了76.1%一77%的桩苷酸和76.5%一81_3%的氨基酸同源率.其中,BS与亚组I的株系 CMV—AS和CMV—NT9显不了942%棱皆酸和968%的氨基酸同源率,而与亚组?的株 系CMV—WL的核苷酸同源率和氨基酸同源率则分别只有77O%和813%(表1) 讨论 核苷酸序列分析是区分和鉴定病毒抹系的最根本和最可靠的方法.我们首次对广东香蕉 3个分离物的CP基因的核苷酸序列分析表明.它们的核苷酸和氨基酸序列同源率分别为 96.6%一97.1%和95.4%一98.2%,没有任何两个分离物所测定的序列完全相同这从分子水 I证实了广东香蕉3个分离物的确可划分为3个不同的株系. 核苷酸序列分析的结果也表明.姒cP为研究对象的ELIsA法,肽链图谱以及肽链图谱 的Westernblot技术,能够反映株系间的CP桉苷酸的氨基酸序列的差异上述三种方法的 测定结果'显示,BS与CS,比与MM的血清学关系较密切;BS与CS,比与MM问具有更 多相似的肽链;在肽链图谱的Westernblot中,BS与CS的肽链抗原决定簇几乎相同,与 MM问存在较大的差异在CP核苷酸序列分析中.其核苷酸和氨基酸序列同源率:BS与CS 分别为97l1%和9816%:而BS与MM的则分别为96.8O%和96.79%.这又从分子水平上 证实了ELISA法,肽链图谱和肽链图谱的Westernblot对3个分离物的分析结果是可靠的. 至令CMV已有约25个株系的CP基因进行了序列分析0,其结果示,CMV可分 为两个亚组,其核苷酸和氨基酸同源率在亚组问的株系中为76%一84%,而在亚组内株系间 却达9O%=本文的香蕉CMV3个株系的CP基因的核苷酸序列分析结果表明,这些来 源于广东的株系都属CMV亚组I.这一结果与Papuu等对波多黎各的香蕉CMV株系 序列分析的结果一致,所测的株系也都属CMV亚组I我们曾对夏威夷两个香焦CMV株 系的CP基因也进行了序列分析.结果表明也属于CMV亚组I.但Thomas在澳大 利亚却发现了一个属丁亚组?组的香焦株系,但其核苷酸序列未见报道.因此可以认为, 香蕉cMv株系绝大多数都属CMV亚组I= 迄今国外报道了众多的CMV株系.而国内却鲜见报道,进行了核苷酸序列分析的株 系更少c.因此我们很难探时国外香蕉CMV与国内的株系的同源关系.至丁I东3个 3弛李卜等:黄嘎拢n1病毒香燕株乐的壳蚩白_^{罔兜隆啊l序列分析239 BSCA^^1C'I'GMTCMCcfI6cGcT6矾CffI'~TCGAE~CGTCCG,CGTCGTGGT60 一 cS — T—_c—— —— _c—— BSTCCG~sc'rC~CTTCCTCCTCCGCGGATC-CTA,qC'ITTAGAGTCC'I'G'TC~AAc II6咖嘶t20 一6-———一 6-———一 BsCGACTrMTAAGA~TTAGCAGCTC-GTCGTLX;MCCATTA^cc^cccflCCcTTT 研G哪l蛐 一 cS ————— 艋T ———— 时C————T^一C一脏——一 BSAEI'GAAC~TGTAAACCTGGGTACAI~ITCACATCTATCAcc强^^CCACI~qAATA240 一 CS BsGACCGGCGGTcTT^订^T66TAAAA~T'rGCTACTTCCTGATTCGGTCACT鼬盯r咖IT300 cS—T—C—— BsMGAAGC1~TTTIZ-CGCATTCAAATTCGAGTLqATCCTTTGc哝mTGATTCTACC360 一 略 GTGTC.-6G']"GACAGTTCG'rAAAGTrCC'I'GCCTCCTCCGACTTATCCGTT~GC, C~tCTCT420 一——-6一—_c————A一一——c.一 —— _T一一—_T————_^—— BSGC'I'ATffrT~csr_,~qCGG.J,C-CCTCACCC-~ACTGGTCTATCAGTACGC~ATC CGG~C4It'0 -一————C——A—— 一——— _G——— Bs~CC,AACA^~TTG.TTGTA嘲rm~TC-C瞄删TGGCGACATG540 一 cS _T—AC——一T _1—^C一一一T Bs国W岍^嘶C唧哪GTAT1T,AM~~AIT.-c'rCTa训l硒^m蚓:IG6】『^6帅 -一—B——一 — A—— BSCT~CATGTCGACAT]'GAC-CACC~ATTCCCACATC~G~rGCTCCCAGTTTGA 657 一一C——一——【'广一 cS一1————A_一 样I3香CMV3个分离物CP照田的板抒酸序列 CPnuclco6desequencesofthreeCMVisolatesinfectingbanana !巷 ItSMDl(sESrS^G刚豫非PRRGs^S^n^RvLSLS嗍LA^PTI哪r1w60 嘲 腰 ———— _qS———— ——— RP——TPv— BSS疆cKP6YIF'ISITLKPPKI豫RSW秘毗LLPDSVTI~DKKLV~IQIRW'LPD'I~120 潮 cs BS'/~VRKVPA~DLSg/AMS删腿陆^SLW^^8哺-LYDLs^眠jIDIG180 ?——一一 CS——C一一 —— P—E—— 一 A_G— BSRKy^vLvYSKIIOAL耵DELVLHVDIE~IIPTVLPv210 ?一一一一 4香焦CMV3个分骂鞠摊导仳CP甄基啭序列 Figure4DeducedCPaminoacidsequencesol,threeCMVisolatesinfectingbanans 堇吾.器量吾星菖委重量暮.重量n92w?.Ln 幽5香蕉3个分离物与其已CMV20个株系CP基冈的核营酸序列同源圈 l~':Gene电脑程序对CMV23个林系CP基因的枉苷酸序列同源率进行多重比较 而产生的亲缘关系村状圈垂直距离 足随意的.水r_距离远或近代表株系间棱许酷序列同源率低城高不同株系序州米 源于GenBa~k,CMV亚组J和l_ Figure5Sequencerelationshipdendrogram(phylogetictree)producedusingClustal fPC/Gcno1fromalignmentsortheto【a】CP11uclcotidesequencesof13CMVstra】ns VerticaldistancesinthetreeaarbitraryhorizontaldistancesRreproportional1opercentnucle otidct【1vgr— gen'=erheGellBankSOUrcesofdataseqilenceswefromthefoIIowlngnumbers:Subgroup1 (业射fJstralnqD00462}, 0f01103851YID『2499ICEIINA(X650I7},FC(D10544)P6fD105451. 『I7F(x16386).M(D『0539)FYfD10538} N1"9ID28780}JAPAfM227101PR,AfM98499)PR—BfM98500J.PR一"m98501】 Stlbgmup?f』lrain0 fJ02059IwLfD00463l,KIN(7128『81TRK7(L15336}.M2t464S70t05, ?'l'l 亘 n 3乍#r:嚣瓜桤IIl瘸商1辱熊株系的壳蛋n堆N兜降午fI序列分析 表1香蕉3个分离物与其它CMVCP基因的核苷酸和氨基酸序列同源率 TableICPnucleotideandaminoacidsequencesidentifiedamongBS MMsubgroup【andsubgroup1Istrainsc.fCMV 对m,l^钮基陵l列卜司源,!l对Il,打为棱睦t剐同率 ('omparlsonsabove1hediagonalrefertoCPaminoacidsequences;2l('*5mparl~xlnsbelowt hediagonalfcr t.CPii/1cleotidesequeD~2s 株系是否}_]]f它CMV株系变异m来,或从罔外J通香蕉材料输A.有待今后进一步研究解 决 参考文献 I岛乔观范J{破有蕉花叶齄.忙叶牾点株乐市农业凡学撤.1983.4:43一,16 2豫努香蕉花叶心腰痛盐防杆云南农业科技I9j{43t23 3欧…砧香壤北时'牌躺盛其防杆r西农科孕,I删^It4I一42 4钟辅商香攘化l_..磨病筮,皿J物佴护.I鹇t4:26 谢耻枰,刷仲-蜘,林夺薹,哥燕北?辐进的发厦』蜘进肯植物柙芋金f学水LJl亡盆)蹙奠 桷剩I12一 War"Ia(WMslclnfectlnLISch10nl,n'lL)thelviFibdiseasesIn:BananDiseases?nd IIOll,19"12ll6—14}c KarJerJMandWt~rworthHEucumberm0clTU5In:Handbook0rPlanlVlFtlSJnfectionsan d CoparatlveDiagnt)sisEdKaratakEElsevit2rNorth1IO【landBiomedicalPressl981257—33: HLI,l1l1l1rZHUL(elal}lI)strcuc~ionsr0Io2vandRNAPatternolcmbe…aivl_Ils ls~IatesPlantProffl1lllfTllml989l5l一59 9PortCDc~clgl1J('('ardl13let-llScrotypcpecilloilv0rmonoclonal}LntlbodieslocLlBin},i nlolc viruArchVlroll989lH47l一:#5 l_】ffwln2SLSf1tp.ofbanLnld】scclsejlnTallnlBananaD/seasesinAsialndPaclnckds VLll?yoRVet.tlllnAPNf0Iklor.ASiandthePacificl99l7—R3 llPatc1KVMa?VR(paratitudlon1lIrlsoIatesojcucumbermosaic?rllsfromb?nRIn dianPh1~toputh0l198336.443—447 l2Rc】lMAWllliamR1IV(1(1rdoiiKHJetalN/112lc('_ldeseqlcuCU~lbcralclru R^2Icvcallt川nsialIf/nPmducti 【,i1s0gnlficantl,hom0logouslocorrespondlngProleIrlsorolhelvicsFttT 1n】OChemI984143::7一84 l1ReZRian?AWI1l…RHVSvmonsR1Iucleotideseqlll1兀 cc0ft~ucklmbeImosaicvii'usRA1 lIi'c~cn…,I'一 qucc,IiiPlelnentl|_,tt70tlrf(1lfhevlllIItel1ilcR^dndhom0lt>gicswiholhe…ITcll RASFuIJ日10chn]l985l5n.3119 病毒!巷 14Davies(,S~monsR?F'urthcrimplicationsfortheevoJutJonaryrc]aliomhiops virusesbasedoncucumbermosaicvirusRNA3Virology,I998l65:216,224 15NinaNTakanamiYKuwataSeta】C州n口 aratlvestudlesOllthenucleotidesequci1ceoltlGllmbcr mosaicvlrusRNA3betwc,enYstrainandqstraln+AnnalsofPht.Pathol(SocietyofJapan1】 988,54:516522 16RizzoTMPalukaitisPNucleotideseq11enGeandevolutlonaryrelatloilshipsocucumber wiosalGv1rus strainsC?VRNA2JGVrolL988.69.17771787 l7RirMPalukal1isPNuclcotidesequenceandcvolutionaryrelationshipsofcucumbermosai clrus straLns:CMVRNAlJGenVlro1.1989701ll 18KataokaJMasutaCTakanamLYCompletenucleotLdeseque~ceofRNAlofcuc~mbeTmllsalcvirlls YslrainandevolutionaDrelationshipsamonggenomeRNASofthevirusstrainsAnnalsofthePh~topatho] fSociety0rJapan1{990a.56:鲫l507 19KatapkaJMasulaCTakanamiYCompletenucleotideseq11e13ceofRNA2ofc11cumbelmllsaicVlrus Ystrain^nhalsofthePhytopahol(Societv.fJapan).1990b,56:495500 20Ov*enJShintakuMAeschlem;tnP.etalNuclcolidesequenc~andevolu1ionaryrelatlofishlpsO{cu— cumbermosaicvic~s(CMVf"rains:CMVRNA3JGeFViro1.J990,7l224349 21PalukaltisPRoossinckMJDiet~genRGc1alCucumbermosaicvirllsAdvancesinVirllsResearch. 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