先天性马蹄足后肢芽及脊髓的病理和分子生物学研究

先天性马蹄足后肢芽及脊髓的病理和分子生物学研究 先天性马蹄足后肢芽及脊髓的病理和分子 生物学研究 ? l270?中华实验外科杂志2007年10月第24卷第10期 ChinJExpSurg,October2007.Vol24,No.10 先天性马蹄足后肢芽及脊髓的病理和分子生物学研究 贾艳丽杜世新刘戈飞罗绍伟钟永盛 先天性马蹄内翻足(CCF)病因不 清,晚期出现距骨滑车变低平或消失,最 终导致患肢残疾….利用全反式维甲酸 (atRA)制作的大鼠CCF动物模型与人 类新生儿CCF有较好的一致性,我们从 RA投入第2天起对子鼠的后肢芽进行 组织病理学及分子生物学分析,观察受 RA信号系统调控基因的达,探讨在肢 体发育不同时段综合多基因相互作用条 件下最终导致CCF发生的原因. 一 ,材料与方法 1.动物模型的建立及实验分组:雌 性Wistar大白鼠随机分为对照组和实验 组,平均为(230?11)g;阴道内精子 阳性后以早晨6点为受孕后零13(dpc 0).每5只为1组,共14组,其中实验 组与对照组各7组.在受孕后第1O天 实验组:大鼠经胃灌注120me,/kg体重的 RA(溶于玉米油,6O异/L);对照组:仅将 不含维甲酸等量玉米油经胃管1次 灌注. 2.标本取材及观察方法:分别在大 白鼠受孕后第11,12,13,15,17,19,21天 剖宫取出子鼠取材.将对照组和实验组 子鼠后肢芽(受孕后12d以后的子鼠) 切取及腰骶段脊髓取材(受孕15d后的 子鼠),经过冷冻,组织切片.后肢芽(后 肢)分别在三维平面连续切片,分别行嗜 伊红染色及脊髓尼氏染色,光镜下观察; 另将子鼠后肢及腰骶段脊髓(受孕15d 天后的子鼠)经戊二醛固定,包埋,切片 定位脊髓前角;经双重染色,透视电镜下 观察. 基金项目:广东省卫生厅医学科研基金资 助项目(A2oo5445);广东省自然科学基金资助 (5300584);广东省科技计划项目 (200613359叭0o8) 作者单位:515041广东汕头大学医学院第 一 附属医院烧伤矫形外科 通讯作者:杜世新 3.凋亡测定:应用末端DNA介导的 DIG—dUTP缺口末端(TUNEL)标记法来 测定后肢芽(后肢)及脊髓神经细胞凋 亡.石蜡切片脱腊入水,3%H:0处理, 蒸馏水洗;标本片加TBS1:200稀释蛋 白酶K消化,TBS洗涤;标本片滴加标记 缓冲液,37?标记2h,TBS洗涤;加封闭 液,加人生物素化dUTP及终末脱氧核苷 酰转移酶(TDT)37?反应30min,TBS 洗涤;TBS1:100稀释链酶亲和素一过氧 化物酶(SABC),混匀加片,TBS液浸洗; 二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染, TBS,蒸馏水洗,梯度乙醇脱水,中性树胶 封片.首先镜下计数TUNEL被标记呈 棕蓝色细胞核的阳性细胞,其次结合光 镜下细胞形态来鉴别阳性细胞中凋亡 细胞. 4.统计学方法:采用SPSS10.O进行 统计学分析,结果以均数?标准差(元? s)表示. 二,结果 1.大体形态学观察:实验组:孕17d 以后共剖出子鼠110只,出现CCF为68 只(61.8%),马蹄内翻角度(踝角)则明 显增大;对照组受孕17d以后共剖出子 鼠178只,无畸形出现,踝角逐渐减小. 2.光镜观察结果:(1)对照组:孕17 d组距骨内倾程度较轻,脊髓前角神经元 形态及分布正常,胶质细胞增加.(2)实 验组:孕17d组见距骨发育小,跟骨内翻 较对照组为严重,跗骨发育小,脊髓前角 胶质细胞增加. 3.实验组透射电镜观察结果:孕13 d组:可见实验组肢芽较对照组明显变 小,切片可见后肢芽组织细胞中有变性, 凋亡现象;孕17d组:小腿和足软骨及肌 肉细胞中有变性,凋亡现象,距骨表面软 骨细胞出现变性;腰骶段脊髓前角部分 神经细胞凋亡,线粒体肿胀;内质网肿 胀,染色质边集,浓聚成块等. 4.TUNEL标记结果:孕13d组:可 ? 简于艮? 见后肢芽组织细胞中有一定数量的凋亡 细胞出现;孕17d组见:后肢和足软骨及 肌肉细胞中有变性,凋亡现象,腰骶段脊 髓可见前角神经细胞凋亡. 三,讨论 我们在胚胎早期的后肢芽发育过程 中发现,后肢芽明显发育不良,早期即出 现组织细胞凋亡.在子鼠脊髓中发现: 前角神经元减少,胶质细胞增多,有较多 前角细胞凋亡等病理改变.肢芽的正常 发育应是许多相关基因受到RA精密调 控的结果.在哺乳动物孕期不同发育阶 段投入过量的RA引发不同的畸形,考虑 外源性RA在大鼠胚胎体内的半衰期 (12h)和完全清除期(72h)J,胚胎 1O.5—13.5d间是RA主要作用时期,这 期间正是后肢芽领域刚刚定型并有后肢 芽出现.因此,对这一发育阶段的分析 研究是至关重要的.RA作为内源性形 态原,其主要作用是通过调控Hox基因 家族的表达来实现的J,肢芽中HoxD和 HoxA的时空顺序表达,RA起直接或间 接主导作用.CCF是由遗传因素和环境 中的致畸因素共同导致的,在复杂的胚 胎发育内环境中,过量而且异位的RA对 相关基因的综合调控作用的实况尚不得 而知,若能够利用模型发现某(些)相关 靶基因上下调是CCF表现型的成因,则 对遗传因素的阐明有一定帮助. 参考文献 [1]DeLaurierA,SchweitzerR,LoganM.Pitxl determinesthemorphologyofmuscleten- donandbonesofthehindlimb.DevBiol, 2006,299:22-34. f2]RafaelE.HemandezAaronP,PutzkeJon. athanP,eta1.MoensCyp26enzymesgen— cratetheretinoicacidresponsepattern necessaryforhindbraindevelopmentDe- velopment,2007,134:177—187. [3]杜世新,吉士俊,孙开来.实验性先天性 马蹄内翻足患肢及脊髓病理观察.中华 实验外科杂志,2003,4:493494. (收稿日期:2007-05—15)