【doc】网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与鉴定

【doc】网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与鉴定 网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与 鉴定 第29卷 2OO8 第1期 年2月 海洋水产研究 MARINEFISHERIESRESEARCH Vo1.29,N0.1 Feb.,2008 网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与鉴定 沈锦玉余旭平潘晓艺许文军.尹文林 (浙江省淡水水产研究所,湖州313001) (浙江大学动物科学学院,杭州310029) (.浙江省海洋水产研究所,舟山316000) 曹铮 摘要浙江宁波,台州等地相继发生网箱养殖大黄鱼的大量死亡,主要症状为脾脏,肾脏有许多白 色结节,大小为0.1,1ITIITI.从病鱼体内分离出致病力极强的菌株GYCwS,人工感染试验证实为大 黄鱼的病原茵,其半数致死量(ID.)为8.5×10CFU/ml.对该细菌进行了形态,生理生化特性的测 定,并进行了全自动微生物系统(ID32GN)及16SrRNA分子鉴定.经PCR扩增获得了大小约 1.5Kb的16SrRNA部分基因片段,产物经回收纯化,克隆到pMD18一T载体,转化大肠杆菌TG1, 对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定确认阳性重组质粒,将测定的序列递交NCBI 进行BLAST同源 序列比对,与恶臭假单胞茵的16SrRNA基因(DQ2o14o3,AY785244)具有较高的同 源性(99),该 序列在Genbank上的登录号为DQ648602.结合细菌的生理生化特性,GYCWS菌 株属于恶臭假单 胞茵(Pseudomonasputida).药敏试验结果表明,病原茵GYCWS对卡那霉素,庆大霉 素,丁胺卡 那,氟派酸,四环素,链霉素药物敏感. 关键词大黄鱼病原恶臭假单胞茵16SrRNA 中图分类号$941.42文献识别码A文章编号1000—7075(2008)01—0001—06 Isolationandidentificationofpseudomonassispathogenfrom culturedPDcfn,zncrocea SHENJin—yuYUXu—pingPANXiao—yi XUWen—jun.YINWen-linCAOZheng ('ZhejiangInstituteofFreshwaterFisheries,Huzhou313001) (CollegeofAnimalScienceandTechnology,Zhe)iangUniversity.Hangzhou310029) (.ZhejiangInstituteofMarineFisheries,Zhoushan316000) ABSTRACTSeriousepidemicofgreatyellowcroaker(Pseudosciaenacrocea)culturedin net—cageinNingboandTaizhou,ZhejiangProvince,brokeoutinspring2004and2005.The mainsymptomofdiseasedfishwastheappearanceofmany0.1—— lmmsizewhitespotsinthe spleenandkidney.StrainGYCWSisolatedfromthediseasedfishwasconfirmedtObethe pathogenoftheepidemicbychallengetest,anditsLD5owas8.5×10CFU/mL.Themorpho — logical,physiologicalandbiochemicalcharactersoftheGYCWScolonyisolatewasthendet er一 浙江省科技厅重点项目(2005F12005)和浙江省海洋与渔业局项目(2004一S-02) 共同资助 收稿日期:2006—1卜07;接受日期:2006—12—20 作者简介:沈锦玉(1963一),女,研究员,主要从事水生动物病害防治研究.E— mail:sjinyu@126.corn,Tel:(0572)2041403 海洋水产研究第29卷 mined.About1.5KbfragmentsoftheisolatewasamplifiedbyPCRusinggeneralprimersof 16sribosomalDNA.ThePCRproductwasextractedandclonedintopMD18一Tvector. After thetransformationintoE.coliTG1,therecombinationplasmidwasidentifiedbyrestrictionen— zymedigestionandbyPCR.0neselectedclonewasthensequenced.TheBLASTresultsofthe sequenceshowedthatithashighhomology(99)withrespectivesequencesofPseudomonas putida.Theaccessionnumberof16SrRNAgenesequencewasDQ648602onGenbank.The resultsindicatedthatGYCWSisolatebelongedtoPseudomonasputida.Thetestofsensitivities ofstrainGYCWSto14kindsofantibioticsrevealedthatthepathogenwassensitivetokanamy— cin,gentamicin,amikacin,norfloxacin,tetracyclineandstreptomycin. KEYWORDSGreatyellowcroaker(Pseudosciaenacrocea)Pathogen Pseudomonasputida16SrRNA 近年来,浙江省大黄鱼PsPoszencrocea(Richardson)养殖发展迅猛,特别是沿海的宁 波象山湾,台州 大陈岛等海域,网箱养殖大黄鱼已成为该地区的主要产业之一.但随着养殖业的发 展,病害日趋严重(徐建峰 2001;王昌各等2002;林克冰等1999a,b),病害问已成为该养殖业持续发展重要的 制约因素之一. 2004年春,浙江宁波象山湾海区网箱养殖大黄鱼发生大量死亡,死亡鱼的体表正 常,解剖发现其脾脏和肾脏都 有许多白点状结节.2005年4月,在浙江台州深水网箱养殖大黄鱼中也发生同样症 状的病例,经调查此病传 染性强,在自然状态下的发病死亡率可达7O,8O.为了摸清引起大黄鱼内脏白点病的主要原因,进行了 病原分离,鉴定,感染试验及药敏试验等,以期提高对该病的认识,并为疾病的防治提供参考依据. 1材料与方法 1.1试验用鱼 患病大黄鱼来源于宁波市奉化海区养殖网箱及台州深水网箱(体重150~200g/尾);健康大黄鱼(颜色鲜 艳,摄食正常,集群环游)来源于舟山试验场养殖网箱(体重200~250g/尾).饲养于2m.大小水泥池中,水温 26"---28.C,每一池中饲养5尾. 1.2细菌的分离及寄生虫观察 将病鱼体表用清水清洗和75酒精消毒后,用无菌操作方法从脾脏,肝脏和肾脏部位取材.在普通营养 培养基,脑心浸液培养基(BHI)和TCBS琼脂平板上划线分离,在28?下培养24h后,挑取优势菌落再在普 通营养培养基平板上划线分离培养数次,获得纯培养物后,用含15甘油的培养液保存于一8O?低温冰箱备 用.同时取病鱼鳃,体表及鳍条等组织在显微镜下进行寄生虫检查. 1.3感染试验 1.3.1病鱼组织除菌上清液感染试验 将病鱼的肾,肝,脾和肠组织加lO倍体积的无菌生理盐水在组织匀浆器中匀浆,一18?冰箱过夜,融化后 经高速台式离心机以6000r/rain,5min及10000r/min,离心10min,再经0.22m微孑L滤膜过滤,保存过滤 液.将除菌滤液分别注射鱼的腹腔,注射量0.2ml/只,每组6尾,对照组注射无菌生理盐水,剂量同试验组. 1.3.2细菌感染试验 试验用的细菌浓度分别为2.7×1OCFu/ml,2.7×1OCFu/ml,2.7×10CFU/ml,2.7×10.CFU/ml. 每组1O尾鱼,腹腔注射菌液0.2ml/尾,对照组注射无菌生理盐水,剂量同试验组.按Reed和Muench氏法计 算LD5o. 第1期沈锦玉等:网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与鉴定 1.4细菌分类鉴定 1.4.1常规生化鉴定 纯培养的细菌经28?,18~20h平皿培养进行个体形态,菌落形态和培养特征的观察及主要生理生化试 验.生理生化特性测定参照ID32GNV法国,生物梅里埃公司(BioMerieux)生化鉴定条进行. 1.4.2荧光素试验 将细菌在金氏B琼脂斜面培养基上端连续划线后穿刺管底,于25?孵育24h,用紫外线灯照射(波长 360rim)出现黄绿色荧光,为阳性. 1.4.3细菌的分子生物学方法鉴定 1.4.3.1细菌总DNA制备细菌基因组DNA的提取参照李德葆等(1996)进行.抽提细菌的基因组DNA 在0.8agarose电泳观察检验,并作为PCR扩增的模板. 1.4.3.216SrDNA的PCR扩增和产物纯化用于16SrDNA的PCR反应的引物为1对通用引物,正向引 物P1:5'一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3';反向引物P2:5'一AAGGAGGTGATCCAGCCGCA一3'. PCR反应体系(50/21)为:10×Taqbuffer5/21,模板DNA1/21,引物浓度为10/2mol/L各1肛l,10/2mol/L dNTP1/21,5u//21TaqDNA聚合酶0.5/21,超纯水40.5/21,混匀.反应条件:94?预变性5min;94?44S, 52?6Os,72?2min,进行30个循环;最后72?延伸5min.取PCR产物7l,1琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物.PCR产物割胶回收纯化采用DNA快速纯化/回收试剂盒(北京鼎国生物技术有限责任公司). 1.4.3.3PCR产物的克隆与测序PCR产物经纯化后,克隆到pMD18一T载体,转化E.coliTG1,挑取菌 落,碱法提取质粒DNA,用PstI和EcoRI双酶切及PCR鉴定确认阳性重组质粒.应用ABIPRISMTM377 DNASequencer自动测序仪(上海博亚生物公司)对阳性重组质粒进行测序,将所得序列运用NCBI的BALST 程序进行同源序列比对. 1.5药敏试验 将菌悬液均匀涂布于普通营养培养基平板上,然后贴上不同药物的药敏纸片(购自杭州天和微生物试剂有 限公司),30?恒温培养24h后检测抑菌效果. 2结果 2.1病鱼症状 2004年4月初至5月中旬,在浙江宁波市奉化海区网箱养殖的大黄鱼发生死亡,死亡数量逐渐增加,现场 观察其症状为:病鱼活动力下降,离群缓慢游动,摄食减少甚至不摄食,鱼体外表及鳃部无寄生物或溃疡.解剖 发现病鱼脾脏暗红色有许多白点状结节,大小在1mm以下,肾脏也有许多白色结节,肝脏及其他部位没有白 色结节,也没有其他明显的症状.2005年4月在浙江台州深水网箱养殖大黄鱼中也发生同样的病例,死亡率 较高. 2.2病原菌的分离和感染试验 从宁波奉化病鱼的脾,肝和肾中分离出大量细菌,细菌在普通营养培养基及BHI平板上形成的菌落一致 的优势菌群,从中挑选1株细菌,编号为GYCWS.该菌在TCBS上生长缓慢.台州病鱼的分离情况与此相 似. 用腹腔注射菌悬液的人工感染方法能使健康的大黄鱼发病,且人工感染症状与自然发病症状相同,即脾和 肾内都出现明显的白点.人工感染的结果见表1,观察7d.从感染试验的结果看,细菌对鱼的毒力很强.组 织滤液注射大黄鱼后,饲养30d没有出现发病症状或死亡. 海洋水产研究第29卷 表1细菌GYCWS对健康大黄鱼的感染试验 Table1ChallengetestofPseudosciaenacroceawithbacteriaGYCWS 2.3菌株的生理生化特征 GYCWS生理生化的实验结果为:革兰氏染色阴性,好运动,0/129(150g)无抑菌作用,15,30.C生长 快,4?和42?不生长,TCBS上生长缓慢至48h时出现肉眼可见菌落.用全自动微生物分析系统(ID32 GN)对菌株GYCWS进行了生化特性的测定,测定结果见表2. 表2GYCWS菌株的生理生化性状 Table2PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofGYCWS 生性状GYCWS BiochemicacharacteristicsPse 恶 ud 臭 om 假 on 单 as 胞 p 菌 utida 生性状GYCws恶臭假单胞菌 lBiochemicalcharacteristics''Pseudomonas12utida 革兰氏染色GramstainG—G一醋酸钠Sodiumacetate++ 氧化酶Oxidase++乳酸Lacticacid++ O/F00丙氨酸Alanine++ 3一羟苯酸葡萄糖产气G asproduction一一3- hydroOxyBEnzoicacid 运动性Mobility++丝氨酸Serine一一 鼠李糖Rhamnose一一水杨苷Salicin,一 葡萄糖Glucose++密二糖Melibiose++ 核糖D-ribose一一海藻糖Fucose++ 肌醇lnositol一一山梨醇Sorbitol++ 蔗糖Sucrose一+阿拉伯糖Arabinose++ 麦芽糖Maltose一一丙炔酸Propionicacid,一 甲叉丁二酸ltaconicacid++发酸Capricacid,一 木栓酸Subericacid一一戊酸Valericacid,一 丙二酸钠SodiummaloNaTe++柠檬酸盐Citrate++ 肝糖Glycogen++卜组氨酸L—histidine,一 甘露醇Mannitol—脯氨酸Proline++ N一乙酰葡萄糖胺3一羟丁酸J_J_ (N—acetyl—glucosamine)3一hydro0xyButyricacid. 5一酮戊二酸钾一酮戊二++ Potassium5-ketobluconatePotassium2一KetoBluconate 6NaCI生长Growth++80ANaCI生长Growth,一 4一羟苯酸.TCBS上菌落颜色绿色绿色 4-hydroOxyBEnzoicacid.ColorofcolonyonTCBSgreengreen 精氨酸双水解酶.42?生长Growth一一 Argininedihydrolase. 鸟氨酸脱羧酶尿素Urea一一 0rnitinedecarb0xylase 赖氨酸脱羧酶七叶苷E sculin一一L ysinedecarboxylase 木糖Xylose+硫化氢HzS一一 硝酸盐还原Nitrate+一明胶液化Gelatine一一 注:+:阳性;一:阴性;O:氧化型 第1期沈锦玉等:网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与鉴定 2.4细菌的16SrDNA序列鉴定 GYCWS的基因组经PCR扩增获得了预期的1.5Kb的特异条带,PCR产物经回收,并克隆到pMD18一T 载体.阳性重组质粒经PstI和EcoRI双酶切得到两条相应的条带,小片段约1.5Kb,大片段约2.6Kb(为 pMD18一T载体);对阳性克隆进行PCR扩增,仍能获得预期大小约1.5Kb的片段,表明1.5KbPCR扩增片 段已克隆入pMD18一T载体. 挑选其中一个阳性克隆进行测序,获得了细菌16SrRNA基因的部分序列,将测定的序列递交NCBI进行 BLAST同源序列比对,与恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的16SrRNA基因(DQ201403,AY785244)具 有较高同源性(99),该序列在Genbank上的登录号为DQ648602.结合上述生理生化特性,GYCWS菌株属 于恶臭假单胞菌. 2.5药敏试验 用药敏纸片法测定了病原菌对14种抗菌药物的敏感性,结果见表3.由表3可知, 病原菌对卡那霉素,庆 大霉素,丁胺卡那,氟派酸,四环素,链霉素6种药物敏感,对青霉素,先锋V,新霉素,痢特灵4种药物不敏感, 对强力霉素,复方新诺明,氯霉素,红霉素4种药物中等敏感.对弧菌抑制剂0/129不敏感. 表3GYCWS菌株的药物敏感试验结果 Table3ThesensitivityofstrainGYCWStOantibiotics An , tibioti.(gg/dis 量 c) }日:罩s(纸片f/d含量isc)gg/disc押菌Di瞄ameteof…,敏Lontent1nialb1torYzone AntiLOntentb1.ntent1一n111bitorYZOnesensitiVity r 霉素 ';; 32敏感s特灵 l, 3oo一耐药R Urazotloone 力霉煮3o25中敏I氟哌酸1O31敏感sNIJOXyCYCI1neorfloxacin…' 复方诺明23 . 7515中敏I霉素3o12耐药R SMZJ.TMP…'1"4eornYCln 大霉誊.1028敏感S素3028敏感SliTetracvcne 取? i30一耐药R霉素1516中敏I Ervthromycin. 青霉素G10一 耐药R 氯霉素 Chloramphen一3017中敏IP enicillin'.… icol 曼卡3033敏感s譬霉素1026敏感sbtreptomycm 0/12910一耐药R0/129150一耐药R 注:R:耐药S:敏感I:中敏 3讨论 随着大黄鱼养殖业的迅速发展,病害的发生日益频繁,各种新的致病菌不断地被发现.目前已有许多学者 对引起大黄鱼哈维氏弧菌(林克冰等1999),腐败假单胞菌,副溶血弧菌,溶藻弧菌(许斌福等2002;毛芝娟 等2002;金珊等2002;鄢庆枇等2001),门多萨假单胞菌(刘家富等2004;刘振勇等2002)等细菌性 疾病及病毒性疾病(Cheneta1.2003)先后进行了报道.假单胞菌引起的疾病在世界各地的温水性或冷水 性的海,淡水鱼中都可能发生,是海水中的正常菌群,为条件致病菌,其致病性主要取决于鱼体的生理状态及水 环境的理化条件.在日本养殖的鱼从小到大都可发生(孟庆显1996).可引起欧洲鳗鲡烂鳃病,中华绒螯 蟹爪无力,鲤,鲫的竖鳞病,中华鳖甲溃疡和穿孔病等(樊海平2001;余为一等1999;黄琪炎1995;李庆乐 等1998).本实验室分离到的GYCWS菌株毒力较强,并引起典型的与自然发病相同症状,确证是大黄鱼白 6海洋水产研究第29卷 点状结节病的病原. 刘家富等(2004)认为在我国福建省宁德地区大黄鱼的内脏白点病是由门多萨假单胞菌和铜绿假单胞菌引 起的,该文中门多萨假单胞菌和铜绿假单胞菌仅一个生化性状之差,即前者乙酸钠为阴性,后者为阳性,这样的 鉴定结果可能会引起误差.而刘振勇等(2002)认为该白点病仅由门多萨假单胞菌引起的,但该菌不能在 TCBS上生长,40?生长慢.作者在浙江地区分离到的菌很纯,仅有1种细菌,且能在TCBS上生长(48h),菌 落形态一致,但该菌于4?和42?不生长.据东秀珠等(2001)对假单胞菌属的生物学特征及鉴别描述中恶臭 假单胞菌与门多萨假单胞菌的生化性状特征很相似,认为门多萨假单胞菌在42?生长,而恶臭假单胞菌不生 长.同一种属的细菌在不同菌株之间的生理生化试验结果往往存在一定的差异.因此,鉴定时仅测定生理生 化性状往往会造成错误,且目前假单胞菌属分类比较混乱(郭亚辉等2004).另外,自动微生物鉴定条由于是 针对人的细菌的,对鱼类的细菌而言缺乏良好的针对性,因而对研究相对较少的水生微生物不易得到准确 的鉴定结果.而分子生物学方法主要还是通过比较细菌核糖体RNA基因片段的同源性进行细菌鉴定,已得 到大家的认可,并广泛应用(Otseneta1.1991;Salleneta1.1996;Delongeta1.1989;屈良鹄1993). 本实验室从宁波,台州的发病大黄鱼中均分离到菌落形态一致的细菌,台州分离株也进行了16SrRNA鉴定 (数据未列出),将测定的序列递交NCBI进行BLAST同源序列比对,与恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida) 的16SrRNA基因也具有99同源性.因此,作者认为引起大黄鱼内脏自点病的病原菌为恶臭假单胞菌.笔 者的体会是在进行微生物种类鉴定时应采用多元方法(生理生化特性测 定,16srRNA分子鉴定或结合特异性 PCR鉴定等),综合分析各实验结果,才能保证鉴定结果的客观性和科学性.而以序列分析为基础,结合表现 型分析的鉴定方法,是细菌学检测和鉴定的发展方向. 参考文献 王昌各,王月香.2002.大黄鱼刺激隐核虫病的防治.中国水产,7:48~49 毛芝娟,刘国勇,陈昌福.2002.大黄鱼溃疡病致病菌的初步分离与鉴定.安微农业大学,29(2):178,181 42 东秀珠,蔡妙英.2001.常见细菌系统鉴定.北京:科学出版社,9,李德葆,周雪平,许建平.1996.基因操作技术.上海:上海科学技术出版社 李庆乐,施军,何为.1998.鳖甲溃疡和穿孔病的病原及其防治.湛江海洋大学,18(2):1O,14 许斌福,林能锋,杨金先,俞伏松,董传甫,林天龙.2002.大黄鱼副溶血弧菌的分离,鉴定及致病力分析.福建农业,17(3):174,177 刘家富,余柞溅,林永添,陈洪清,谢文秋.2004.大黄鱼假单胞菌病的初步研究.海洋科学,28(2).5,7 刘振勇,王兴春,杨毓环.2002.网箱养殖大黄鱼门多萨假单胞菌病的研究.水产(增刊),77,81 余为一,李槿年,祖国掌.1999.一株中华绒螯蟹病原菌的研究初报.安徽农业大学,26(2):174,177 孟庆显.1996.海水养殖动物病害学.北京:中国农业出版社,63,76 林克冰,周宸,刘家富,周胜利,曾志南,陈木.1999a.海水网箱养殖大黄鱼病原菌研究.海洋科学,4:58,62 林克冰,周宸,刘家富,周胜利,何丽斌,曾志南,陈木.1999b.海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的病原菌.台湾海峡,3:342,345 金珊,蔡完其,王国良,赵青松,郑天伦.2002.养殖大黄鱼细菌性疾病的病原研究.浙江海洋学院(自然科学版),3:225,23O 屈良鹄.1993.微生物系统发育的分子遗传学研究概述.微生物遗传学研究综述集.上海:复旦大学出版社 郭亚辉,郭坚华,李斌.2004.根据16SrRNA序列对假单胞菌屑分类学的研究进展. 微生物学杂志,24(2):38~41 徐建峰.2001.大黄鱼本尼登虫病的诊治.科学养鱼,11:41 鄢庆枇,王军,苏永全,张蕉南.2001.网箱养殖大黄鱼弧菌病研究.集美大学(自然科 学版),6(3):191,196 黄琪炎.1995.水产动物疾病学.上海:上海科学技术出版社 樊海平.2001.恶臭假单胞菌引起的欧洲鳗鲡烂鳃病.水产,2:147,150 Chen,X.H.,Lin,K.B.,andWang,X.W.2003.Outbreaksofaninridovirusdiseaseinmaricultu redlargeyellowcroaker,Larimichthyscrocea (Richardson),inChina.JournalofFishDiseases,26:615,619 Delong,E.F.,Wickham,G.S.,andPace,N.R.1989.Phylogeneticstains:ribosomalRNA— basedprobasfortheidentificationofsinglecells. Science,243:1360,1363 0tsen,G.J.,Larsen,N.,andWoee,C.R.1991.TherebosomalRNAdatabaseproject.Nucleic. Acids.Res.19(Supp1):2017 Sallen,B.,Rajoharison,A.,andDesvarenne,S.1996.Comparativeanalysisof16Sand23SrR NAsquenceoflisteriaspecies.Jut.J.Sys.Bacteri lo.46(3):669,674