rhEPO增加脑创伤小鼠调节性T细胞水平减轻TBI后神经功能障碍研究(可编辑)

rhEPO增加脑创伤小鼠调节性T细胞水平减轻TBI后神经功能障碍研究(可编辑) rhEPO增加脑创伤小鼠调节性T细胞水平减轻TBI后神 经功能障碍研究 1 分类号: 密级: 学位类别: 科学学位口 专业学位囱学校代码: 学号: 学科门类: ?医学又坪鲁科鼻导 鹣觚 硕士学位论文 ’ 论文题目:增加脑创伤小鼠调节性细胞水平 减轻后神经功能障碍的研究 一级学科:临床医学 二级学科:外科学 神外 论文作者:陈通恒 指导教师:张建宁教授 导师组成员:陈洁丽教授 天津医科大学研究生院 二零一三年五月2 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外,论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名 学位论文版权使用授权书 :埔月昭 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定, 即:学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文,并编入有关数据库。 本论文属于 保密口,在??年解密后适用本授权书。 不保密囹。 请在相对应的方框内打“?” 学位敝储虢隧期驯销月严曰3 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 研究目的:炎症在创伤性脑损伤的病理过程中促进继发性脑损伤的发展, 导致脑水肿的形成、局部脑组织的坏死、神 经元的凋亡和神经功能的缺失。据 相关报道,调节性细胞是一类具有下调过度炎症反应能力的淋巴细 胞亚群。因此,有理由认为后通过外源性干预如给予一定剂量重组人促 红细胞生成素等增加体内的水平可能有利于减少创伤后过度炎 症反应所致的继发性脑水肿、神经元的凋亡和局部脑组织的坏死,从而减轻由 所致的空间学习记忆等神经功能障碍。这将为治疗提供参考。 研究方法:选用成年健康清洁级雄性/小鼠,按照随机化原则分为假手 术组、脑创伤后重组人促红细胞生成素组和生理盐水 组。分组后建立小鼠液压打击脑创伤模型。于模型制 作成功后小时经腹腔注射。脑创伤小鼠于伤后小时和伤后小时处死。 应用流式细胞术和免疫组织化学染色方法分别观察各组实验小鼠的调节性细 胞在脑创伤后第、小时在外周脾脏和脑组织的变化情况。通过水迷 宫于各组小鼠伤后第一天进行认知功能评价。应用干湿重法检测各组小鼠 伤后脑组织水肿情况。通过染色方法评估各组脑损伤小鼠伤后和小时 脑组织坏死体积。酶联免疫吸附测定法测定各组小鼠脑组织中细胞因 子.、?、. 和?【变化情况。最后应用免疫组织化学/免疫荧光 方法检测各组小鼠脑组织中细胞、细胞、 及小胶 质细胞激活情况。 研究结果:小鼠体内的水平在脑创伤后小时各组之间比较无差异。小 鼠脑创伤后小时,与组相比,组中外周脾脏中的数量 明显减少.与组相比,组中的数量增多 .。在观察脑组织中的浸润情况发现:与组相比较,伤后 小时组的明显增多.;与组相比较, 组中的数量增多.。干湿重法观察发现:在伤后和 小时,与组相比,组脑水含量增加明显佃.;与 组相比较,组脑组织的水含量明显减少.。对小鼠脑损伤后4 天津医科大学硕士学位论文 坏死体积检测:伤后小时,组小鼠脑坏死体积较组小 鼠明显减少口.。脑创伤后,组小鼠在训练第二天后逃避潜伏期 开始明显长 于组.;而与组相比, 组在训练第二天逃避潜伏期开始短于组.。观察脑组织中的炎 症细胞发现:伤后小时,组脑组织中激活的小胶质细胞及 阳性细胞的浸润均较组减少.;而中性粒细胞则在伤后小 时浸润增多,持续到伤后小时,但呈下降趋势,组较 组减少.。应用检测技术观察创伤侧的促炎细胞因子.、 .和抗炎细胞因子.、.的浓度时发现:在伤后小时和 小时,组中.和的表达水平均较组增高 .;而.和.的表达在组中却降低.。观察小鼠 脑创伤后神经细胞的凋亡情况发现:与组相比,组中神经元凋 亡在第小时增多.;与组相比,组脑创伤周围 明显减少神经元的凋亡.。 研究结论:治疗小鼠脑创伤后增加体内的水平能够抑制后发生 的过度炎症反应,从而减轻脑组织水肿,减少局部脑组织的坏死和神经元凋亡, 达到减轻所致小鼠空间学习记忆等神经功能障碍的目的。提示增加 水平可能成为治疗的新途径。 关键词:促红细胞生成素创伤性脑损伤调节性细胞炎症免疫5 天津医科大学硕士学位论文 ,. 。 .: ....,, , .?,一伐,一 ? .....: ,. , .,,,.. 一?, .~ 略 . , . , 6 天津医科大学硕士学位论文 . ,. :,,. .: 7 天津医科大学硕士学位论文 目录 中文摘要?.. 缩略语/符号说明?.. 前言 月看 研究现状、成果研究目的、方法对象和方法? 实验材料?.?实验动物. 实验仪器. 实验试剂. 实验方法? 小鼠液压打击模型制备??. 恤及注射. 评分评估小鼠后行为功能损害 流式细胞术测定小鼠外周脾脏组织的水平?. 小鼠脑组织石蜡切片的制作过程及染色. 脑组织石蜡切片染色?.. 测定脑组织坏死体积??.. 小鼠脑水含量测定干湿重法??. 酶联免疫吸附法测定小鼠脑组织细胞因子含量?. 水迷宫检测空间学习记忆能力? 统计学分析方法?.. 结果??.. 后,小鼠外周脾脏的变化情况.. 后,小鼠脑组织中细胞的变化情况. 评分评估小鼠行 为学功能变化水迷宫检测小鼠脑损伤后空间学习记忆功能情况??. 各组小鼠脑水含量测定??.. 各组小鼠脑损伤后脑坏死体积测定??. 后,各组小鼠脑组织中凋亡神经元比较 小鼠后,外周血中性粒细胞向创伤区浸润情况.. 小鼠后,细胞在脑组织中浸润情况小鼠后,小胶质细胞在脑组织中的激活情况 各组小鼠后,脑组织中细胞因子的变化情况?. 讨仑..~8 天津医科大学硕士学位论文 结论??.. 参考文献?. 发表论文和参加科研情况说明?. 综述??.. 调节性细胞在中枢神经系统中的作用? 综述参考文献??. 致谢??.. 9 天津医科大学硕士学位论文 英文缩写 ?.【 ..缩略语/符号说明 英文全称 中文全称 重组人促红细胞生成素 改良神经系统评分 调节性细胞 创伤性脑损伤 效应性细胞 流式细胞学分析细胞扫描 促红细胞生成素 水迷宫 抗原分化簇 转移生长因子. 肿瘤坏死因子. 、.白介素. 白介素. 酶联免疫吸附测定法 血脑屏障 白介素. 中枢神经系统 普通盐水 大气压 液压冲击伤 二氨基联苯胺 磷酸盐缓冲液 牛血清白蛋白 脱氧核糖核酸10 天津医科大学硕士学位论文 .上一 刖吾 研究现状、成果 随着社会的不断进步,创伤性颅脑损伤 痂,发生 率逐年升高,在美国,每年有,,人遭受创伤性脑损伤,给家庭和社 会带来严重负担【】。尽管现在对的认识逐渐深入,但是依然缺乏有效的治疗 措施。遭遇初始创伤后幸存的患者,病残或病死率在很大程度上取决于继发性 脑损伤进展程度,而加重继发性脑损伤的因素包括炎症、氧化应激反应、机体 离子失衡、血管通透性增加、线粒体功能障碍及细胞兴奋毒作用等【’】。其中颅 脑创伤后的局部炎症反应被认为是继发性脑损伤病理过程中最为重要的影响因 素之一【】。而这一过程以小胶质细胞激活、大量的细胞因子的分泌以及 外周淋巴 细胞、中性粒细胞的浸润为主要特点【】。由于这些炎症细胞的浸入,导致神经组 织水肿,进一步加重了神经元的损伤和死亡,引起严重的神经功能缺去。如何 处理好这一过程,是我们所面临的难题。近年的研究发现,有一类细胞名为调 节性细胞 ,,具有下调过度炎症反应的功能。而 所具有的这一功能已经在脑缺血、多发性硬化及炎症性肠病等实验研究中得到 了证实【?。 属于淋巴细胞亚群中的一类细胞。年,首先由通过 体内和体外实验研究阐明其具有免疫调节功能。它对维持人体免疫系统正常功 能及对抗微生物方面具有重要作用。早期的研究发现:在体外与细胞共培养 时,他们具有强烈抑制应答细胞增殖的能力?。在研究的特异性标记 物时发现,转录因子被认为是功能的主要调控者【, 。对于小鼠, 可作为的标记物;而对于人类,的辨别主要还是通过. 受体的表达来衡量。因为在激活的细胞中表达上调。此外,人 不成熟的细胞能够诱导表达【,】。除了和作为分子 标记物外,同样表达其他的分子标记物比如: 、 、 和等【】。基于具有重要的免疫调节作 用,目前在脑血管疾病、多发性硬化、神经胶质瘤、炎症性肠病等实验研究中天津医科大学硕士学位论文 得到了部分证实。除了在疾病的研究中证实其免疫调节作用外,在正常脑组织 中具有的功能还与学习和记忆有关】。但是的具体作用机制如何 呢目前并没有得到一致的结论,主要有以下几个方面【】:、通过分泌 抗炎细胞因子如.、.、.等抑制效应性细胞的作用,从 而缓解炎症反应。、通过细胞裂解的途径即分泌颗粒酶、,在 穿孔素的共同作用的条件下,从而裂解达到抑制炎症反应的目的。、 通过消耗所需要的一,促进的凋亡;另外还可通过其膜上表达的 、和第二信使去影响的功能。、还可通过调节抗 原提呈细胞树突状细胞等的成熟和功能,抑制细胞激活为冠从而达 到免疫调节的作用。以上途径说明了作用机制的复杂性,而且其作用的机 制并非在创伤性脑损伤研究中得出。在脑创伤中的作用究竟如何上调或 者下调对脑损伤会有什么样的影响目前并无相关报道。 是由个氨基酸组成的糖蛋白,是一种造血生长因子。是由肾脏和肝 脏分泌的一种激素样物质。重组人促红细胞生成素 是一种通过重组技术生产的含有与天然分离的 具有相同的氨基酸序列,与天然具有相同的活性。长期以来,主要用 于治疗由肾脏疾病引起的贫血。近年的研究发现,除了具有促进红细胞生 成的作用外,它还具有神经保护的作用【,。在实验性脑脊髓膜炎的研究中, 给实验小鼠注射邕够增力的数量,缓解神经功能损伤【。但是 在创伤性脑损伤的病理生理研究中的作用机制并没有得到确切的评估。本实 验 以/、鼠为平台,通过注射观察是否能够增力鼠体为的水平, 增力是否减轻脑组织局部发生的炎症反应以及是否影响、鼠的学习记 忆功能。 研究目的、方法 本实验中,我们观察后试验小鼠体内的是否参与继发性脑损伤的过 程并减少脑损伤后局部的炎症反应,从而减轻后神经功能的障碍。为了观察 这一变化过程,我们首先建立小鼠模型,其次应用、免疫组织化学染 色等实验技术观察小鼠在不同的时间点外周脾脏、脑组织拘变化。随后, 我们给予、鼠体内注射,再次使用、免疫组织化学染色等实验技 术观察小鼠的变化情况。通过、干湿重法、免疫组织化学/免疫荧光天津医 科大学硕士学位论文 染色等技术观察实验小鼠后给予治疗和未给予治疗在认知功能、脑水 肿及炎性细胞在脑组织中浸润情况以及脑组织坏死之间是否存在差别。 本实验研究的目的首先是观察的变化与小鼠脑损伤之间的关系。其次 观察治疗是否增加脑损伤后体内的水平以及增加体向水平后 是否具有减轻后所致的神经功能障碍,从而为作为脑外伤后的治疗靶点 提供新思路。天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 对象和方法 .实验材料 .实验动物 本实验中采用北京阜康生物科技股份有限公司提供的周龄清洁级雄性健 康成年/小鼠共计只,体质量为~,饲养条件为白昼 夜晚、常温、避免异常声光刺激,单笼饲养。采用完全随机化分组方法分为 假 手术组组、创伤后重组入促红细胞生成素治疗组组和创伤后 生理盐水治疗组组,每组各只小鼠。具体实验分组情况及用途见 表 分组表 组别 例数只 用途 .实验仪器 液压打击仪:见图该系统由底座、旋摆、带刻度的角规、球形增强型打击 锤、有机玻璃液体管、压力记录盒、压力传感器、冲击转移导管和数据记录 设 备组成。该仪器是完整的拥有校准功能的一款神经打击仪器和研究系统。它 在 打击作用的同时,记录下作用于打击位置的准确压力变化。液压的打击方式 会 呈现一个规律的正弦波压力打击,是理想的打击研究仪器。 流式细胞仪:见图流式细胞仪主要由以下五部分构成: ?流动室及液流驱动系统; ?激光光源及光束形成系统; ?光学系统; 对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 ?信号检测与存储、显示、分析系统; ?细胞分选系统; 图 液压打击仪 图流式细胞仪公司 迷宫荷兰公司生产: 水迷宫 ,见图实验是一种强迫实验动 物大鼠、小鼠游泳,学习寻找隐藏在水中平台韵一种实验,主要用于测试 实验动物对空间位置觉和方向觉空间定位的学习记忆能力。该设备直径为 、高,可见平台直径为、高。水迷宫平台置于水下 .,并向水中倒入牛奶。水温??,位于一黑色屏风内,屏风内四面 有不同图案,小鼠可根据屏风内图形线索进行定位,实验过程中图形位置大 小 保持不变。小鼠的游泳轨迹由设备上的摄像头跟踪,并每隔.拍摄一照片。 图 水迷宫荷兰公司生产对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 其他相关设备见表 实验设备表 实验仪器 生产厂家 立体定向仪 日本公司 数字存储示波器 美国公司,型 倒置显微镜 日本公司 普通显微镜 日本公司 牙钻 韩国公司 小动物呼吸机 江西特力麻醉呼吸设备有限公司 。恒温水浴箱 江苏太仓实验设备厂 计 瑞士 公司 石蜡切片机 德国徕卡公司 石蜡包埋机 德国徕卡公司 超低温冰箱 美国公司 电热干燥箱 天津河北仪表厂 酶标仪 美国.公司 电动移液器 德国讼司 电动摇床 美国.公司 纯水系统 美国 公司 微量加样器 德国公司 电子天平 瑞士 公司 低温冷冻高速离心机 德国公司 低温冰箱 日本砧吖公司 .实验试剂 见表 实验试剂表 试剂名称 生产厂家 美国公司 始 .? 英国公司 英国公司 对象和方法 天津医科大学硕士学位论文英国公司 . 英国公司 美国 公司 一 红细胞裂解液 天津博美科生物科技有限公司 . 北京中杉金桥公司 %多聚甲醛 武汉博士得公司 .%牛血清白蛋白 美国公司 北京中杉金桥公司 .二抗 .二抗 北京中杉金桥公司 显色液 北京中杉金桥公司北京中杉金桥公司 注射液 华北制药金坦公司 玻璃子水门汀 上海齿科材料公司 .实验方法 .小鼠液压打击模型制备 制备方法:组和组小鼠经简单随机抽样编号后称体 质量,经腹腔注射质量浓度为%水合氯醛/进行麻醉。麻醉满意后, 小鼠取俯卧位、头部固定于立体定向架上,剔除颅骨项部皮毛,碘伏酒精消毒 皮肤,质量浓度为%利多卡因行头皮局部浸润麻醉。沿头部正中线切开头皮肤、 筋膜,分离骨膜直至显露颅骨,致伤部位选择以前囟后、矢状线向右旁开 为中心,磨钻钻孔直径.形成圆形骨窗,保持硬脑膜完整,自制 打击管注射器乳头与增强型牙科磷酸锌水门汀结合后将打击管紧密固定 在骨窗周围颅骨上;采用自制打击套管与.型颅脑创伤仪紧密连接, 确定打击管与打击套管严密无渗漏,调整液压打击仪摆锤高度摆锤与打击活 塞夹角.使打击力度稳定于.,小鼠清醒后进行液压冲击致伤,并记 录打击后液压创伤仪波形峰值。然后即刻行小动物呼吸机进行抢救,待小鼠生 命体征平稳后消毒头皮、缝合,放回笼中饲养。假手术组小鼠不接受液压打击。 经液压打击后即刻出现呼吸暂停,随后逐渐清醒,创伤后改良神经功能缺 损评分为~分中度脑损伤者,视为模型制备成功天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 .及 注射 小鼠液压打击术后小时立即予以需用生理盐水稀释至/ 经腹腔连续注射至处死前一天,每次剂量为/;生理盐水组小鼠打击术 后立即给予生理盐水腹腔注射所需量等于组稀释所需的生理盐水量。 . 评分评估小鼠后行为功能损害 该评分主要以运动、感觉、反射和平衡功能等指标对小鼠全面进行评定, 满分为分。其中.分为重度损伤;.分为中度损伤:分为轻度损 伤见表。 评分表表 评定项目 得分 运动功能测试 提起鼠尾时 前肢屈曲 后肢屈曲 、一 在内鼠头部转动角度于垂直轴 ‘ 行走实验’ 正常行走 不能直线行走 向偏瘫侧转圈 向瘫痪侧跌倒 感觉实验 视觉和触觉不存在 深感觉不存在提拉四肢,不见肢体肌 肉收缩 平衡能力实验 在平衡木上正常姿态 紧靠平衡梁一侧 紧靠平衡梁一侧,一后肢悬挂在平衡梁 之外天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 紧靠平衡梁一侧,两后肢悬挂在平衡梁 之外或在平衡梁上转圈 在平衡梁上保持时间在以上后坠落 在平衡梁上保持时间在以上后坠落 在平衡梁上保持时间不到后坠落 反射缺失和反常运动 耳廓反射当触及耳廓时头部不动 角膜反射当用棉花触及角膜时,眼睛 不眨动 惊吓反射噪音引起的运动反应 出现癫痫、肌阵挛或肌张力障碍 总分 轻度损伤卜分; 中度损伤一分; 重度损伤一分 .流式细胞术测定小鼠外周脾脏组织的水平 一小鼠脾脏组织单个核细胞的分离与提取红细胞裂解法 取直径为培养皿置于冰袋上; 取适量无菌置于培养皿中,并使其温度保持在?; 将小鼠放于充有蒽氟烷瓶中,使其麻醉; 在小鼠左腹切一小口,充分分离暴露脾脏组织,并迅速取走脾脏且置 于含有培养皿中; 将滤网中公司置于离心管中,并以湿润; 将脾脏置于滤网上,以注射器内头充分研磨至完全滤过滤网; 应用电动移液器取冲洗滤网; 更换移液管,移出悬浊液,并用/滤网再次过滤悬浊液; 离心机离心细胞悬浊液,。,: 去除上清液后,加入红细胞裂解液并吹打混匀,在室温下裂解 ; 待细胞充分裂解后即悬浊液红色透明后,加入并离心 ,。,终止裂解反应 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 离心完毕,去除上清液,离心管底可见白色沉淀物,加入 悬浮细胞并进行计数; 二单个核细胞计数 取细胞悬浮液与 或者 等体积混 匀于.小离心管内: 取少许混合液约加入至白血球计数器中,盖上盖玻片,于 倍倒立显微镜下观察计数,活细胞不染色,死细胞染为蓝色或红色一 计数个大方格细胞总数,再除以,乘以稀释倍数乘以,因与 等体积混合,最后乘以,即为每毫升中细胞悬浮液细胞数。 若细胞位于线上,则记录上线与右线细胞或下线与左线细胞; 若不用血球计数板,可用 自动计数,但不能分辨死细 胞与活细胞; 然后按下公式计算:细胞数/个大格细胞总数,若镜 下见两个以上细胞团,则按单个细胞计数;若细胞团大于%以上则需重新制 备细胞悬液; 三细胞活性测定 将细胞悬液以.加入试管中; 加入. 染液,染色; .% 吸取细胞悬液涂于载玻片上,盖上盖玻片; 镜下取任意视野分别计数死细胞和活细胞数,评价细胞活力。死细胞 能被 染上色,镜下可见深蓝色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无 色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞 悬 液的加倍稀释作用。 四流式细胞术上机样本制备一细胞悬浊液 细胞表面抗原流式染色 根据细胞悬浊液的浓度,计数加入上机管内细胞悬浊液体积,至没管 ×个细胞; 离心,。,,去上清,加入%封闭非特异性 抗原,在条件下孵育; 各管加入.的; 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 避光条件下滴加一抗.、.各,轻弹混匀,。 条件下避光孵育;如为非染色剂直标抗体则需孵育后加入.的 ,吹打混匀,并离心,。,,去上清,滴加荧光二抗暗室 内进行并。条件下避光孵育分钟。 各管分别加入.的,吹打混匀,离心,。,; 去除上清夜,重复上述步骤,再次洗涤; 细胞内抗原流式染色 中已含有,并吹打 去除上清液,加入×固定透化工作液 混匀; 室温/?条件下避光孵育.分钟鼠的样品在?条件下可以最多 孵育小时; 中 孵育后勿洗,直接加入的.的或者透化液 己含有,轻振混匀; 离心,。,后去除上清液; 重复.的步骤,再次洗涤悬浊液; 用.的或者透化液 中己含有重新悬浮细 胞; 用%再次封闭细胞内非特异性抗原,室温,避光,分钟; 勿洗,直接加入一抗?进行细胞内抗原染色,室温、避 光条件下孵育至少分钟:如为非染色剂直接抗体则需孵育后加入. 的,吹打混匀,并离心,,,去上清,滴加荧光二抗暗 室内进行并在。条件小避光孵育分钟。 在各试管中均滴加.的或者透化液中已含有, 轻弹混匀后离心,。,; 去除上清液,重复第步骤,再次洗涤; 去除上清液,滴加.的,轻弹混匀后上机。 流式细胞术一仪器设定、数据采集和分析 流式细胞仪的软件配合微球自动进行仪器 的灵敏度、补偿等校正,确保仪器正常运行。 软件用于分析样品盒 设定数据格式。 软件对数据做分析。天津医科大学硕士学位论文 对象和方 法 软件是一个建立在 包括,,,或苹 果系统包括 ,,之上的插件。用户可以通过该软件,设置 标准稀释系列,得到四对数曲线,每一步操作都有详细的。 仪器设定及质控 一准备 到个标示威、、、质控管中; 分别加入. 管中加入阳性质控试剂; 管中加入阳性质控试剂; 管中加入阳性质控试剂; 各试管于室温下避光孵育; 管加洗涤缓冲液,、和中各加入.洗涤缓冲液。 二用软件和微球校准仪器 开机: 做液流检查; 准备 微球管,打开 软件; 模式下运行 在/ 软件; 详细操作按用户指南进行。 三用 校正仪器 在校正过程中,不时暂停、重启动采集操作,以得到根据调整的设置得到 的检测数据。 运行 软件 软件,打开 模版; 软件以个参数分析数据: 设定仪器为模式 、、.、.和.,关闭多余的检测器; 设定、为对数模式; 设定 的电压比的设定值降低; 设定的阈值为; 试管,利用和圈定 在模式下运行 设门,则位于中的细胞为单个核细胞; 利用和圈定设门,则位于中的细胞为单个核细胞; 试管、和以调节电压及荧光补偿。 分别运行天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 数据采集 打开 软件上的采集模版; 设定采集模式,从前述恢复优化的仪器设置; 在采集和存储窗口,设定分辨率为; 设定、.内计数数目为; 设定欲采集的数为 ; 在模式下,第一检测管质控管,用对做散点 图,使.区域圈住单个核细胞群。 设定流速为,开始样品采集; . 流式细胞仪显示的图左下角为和双阳性细胞群、右下角 为阳性和阴性细胞群、右上角为和双阳性细胞群.、 左上角为阴性和阳性细胞群; 左下角为和双阳性细胞群、右下角为阳性和 阴性细胞群、右上角为和双阳性细胞群、左上角为阴 性和阿生细胞群; 为圈定的和双阳性细胞群,可由此确定阳性 细胞占和双阳性细胞群的百分比; 样本数据的分析 将文件的本实验数据移到安装有 软件的计算机上; 新建个文件夹,分别标记为‘标准’和‘样品’; 将数据文件移到相应文件夹; 按软件用户指南分析数据; .小鼠脑组织石蜡切片的制作过程及染色 石蜡切片法是最常用的一种制片法。其制作过程是:取材一固定一脱水一 透明一浸蜡一包埋一切片一贴片一烤片一脱蜡一复水一染色一脱水一透明 一封 藏。现对其进行具体描述: 一取材 取材前的准备:%多聚甲醛的配置方法 称取多聚甲醛溶于装有水的玻璃容器中,持续加热搅拌至 .,使其成乳白色悬液。滴加./的稀释至值为.,使其天津医科大学硕士学位论 文 对象和方法 呈清亮,再加入约,充分混匀,可再检测,过滤后定容至, ’ ?保存,备用。 取材灌注:将实验小鼠用%的水合氯醛按/进行腹腔注射麻醉,待 其麻醉满意后沿小鼠前正中线切开充分,暴露胸腔及腹腔脏器。游离心脏, 寻 找右心耳并迅速剪开。从左心室插入连接有注射器的头皮针。推入适量生 理盐水,可见其肝脏及肠道等器官变白,说明其冲洗干净。迅速将适量%多聚 甲醛快速推入,可见小鼠身体发僵说明灌注成功。 取材:切断小鼠头部;用剪刀剪开头部皮肤,皮下组织,暴露颅骨。接下 来用小号止血钳逐步小心去除头骨,剪破脑膜,充分暴露脑组织,小心迅速取 出脑组织。 取脑组织的注意要点: ?取材时所用的剪刀需锋利; ?要保证取材的完整性; ?因神经组织容易变性,需迅速取出; ?根据实验需要,切取相应部位脑组织; 二固定:固定的目的在于保存组织内细胞原有的结构和形态,使其与生活 时相似,因此要求固定的材料越新鲜越好。把动物杀死后应立即割取组织块, 并快速投入固定液中。 将切取好的脑组织,置于%多聚甲醛中固定小时; 三脱水:柔软并含有多量水分的组织是不易切成薄片的,故必须增加组织 的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织,以达到支持增硬的作用。但水与 石 蜡是不相混合的,因此,在浸蜡、包埋前须将组织中的水分完全除去,这一步 骤即为脱水。 将固定好的脑组织依次从低浓度酒精到高浓度酒精脱水。具体方法是,将 材料经%酒精一%酒精一%酒精一%酒精一无水酒精一 无水酒精,各级酒精.小时。脱水应彻底,否则材料不能透明,影响石 蜡的浸入,致使难以切片。 四透明:酒精与石蜡不能混和,因此,脱水后的材料在浸蜡前,还必须经 过透明。透明剂既可替代组织中的酒精,又能溶解石蜡,以利石蜡的渗入。二 甲苯是常用的一种透明剂。 对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 具体方法:将脱水后的材料经:无水酒精与二甲苯一二甲苯一二甲 苯,各级时间约为..小时,务必使组织达到透明为止。 五浸蜡:将己透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除 组织中的透明剂,而使石蜡渗入整个组织,获得一定的硬度和韧度,以便切成 薄的切片。 具体方法:先将经透明的组织放入融化的软蜡熔点为.?内小时; 然后将组织放入硬蜡中熔点.?约.小时,并使熔蜡箱的温度保持恒 定约?,切勿太高或太低。浸蜡时间视材料大小而定,一般总的浸蜡时 间为.小时左右。 六包埋:将浸蜡后的材料包埋于石蜡中,并使它凝固成蜡块,这一过程 称为包埋。 注意事项: ?脱水的过程应逐步进行,不能操之过急; ?脱水时间应根据组织大小和类型而定; ?组织块在高浓度,特别是在无水乙醇中不能放置的时间过长。无水乙醇 吸水能力太强,容易造成组织块的过度硬化,使得切片时组织易碎裂; ?在脱水的过程中可以将组织块停留在%.%的酒精中; ?每次更换新的脱水剂时组织块从低浓度到高浓度,都要把组织块放 在吸水纸上吸干,装组织块的容器也要烘干水分,以免将水及低浓度脱水剂 带 入高浓度脱水剂中,影响脱水效果; ?透明时间不能过长,否则组织容易变脆; ?温箱中的浓度必须严格控制在。的范围中,不能超过;浸蜡时问 不宜过长;浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度和脆变; ?包埋时不能有气泡,包埋面必须平整,否则不好切片 七切片:用石蜡包埋好的蜡块,需要用摇转式切片机切片。在切片以前 需要把蜡块修正,只让材料四周剩留一部分石蜡,蜡块四边要切平行。装上切 片刀,使蜡块的切削面跟刀口垂直。调整切片刀的倾斜度。清除角。左右时, 倾斜度比较适合;倾斜度不足时,清除角为负角,不能切片;倾斜度过大,不 是切片过厚,就是切不成片子。切片机通过调节上下左右来来使组织和切割 方 向一致,然后调节切片的厚度,一般为?,如果比较难切,则可以适当调整厚 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 度,用毛笔将切割的切片向外拉,并用小镊子将包含有完整组织的片置于 温水中展片。 八捞片及贴片 ?洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓混合液中,目的是为了是载 玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便 于组 织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓。大约冲一个小时 左右,再将载玻片浸泡于酒精之中,然后放到架子上,置于温箱中,将多 聚赖氨酸涂布于玻片的表面,由于带正电,而大多数的组织带负电荷,从而 产生吸附作用。 ?捞组织:当组织载玻片置于温水中之前,要先将水浴中的气泡赶走, 以免气泡受热上浮而贴到组织上,组织受热展开,最好是组织不起皱纹,用载 玻片捞组织时,一般取载玻片的下/或者下/一般每种组织捞张,其中 .张是备用的,每张载玻片上通常捞两份组织,做对照使用,这样形成的误差 就比较小了,而且捞载玻片的时候最好方向一致,以便观察,再将捞出来的载 玻片置于架子上,室温晾干。 九烤片贴附是利用水使切片展开,烤干便是用恒温箱加热除去水分,使 材料在去蜡后依然能够粘在玻片上,烤片时放入温箱中小时烘干备用。 石蜡切片操作步骤:免疫组织化学法染色步法 十脱蜡:将烤于的切片放入二甲苯一二甲苯中,各为, 以溶 去切片上的石蜡。起脱蜡作用的主要是二甲苯,天气热可以少放几分钟,相 反, 天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间。 十一复水:是将脱蜡后的切片经各级浓度酒精逐渐下降到水的过程,即 将二甲苯中取出的切片移入无水酒精×次一%酒精×次一%酒精一 %酒精,各级中停留。最后在电动摇床上用洗石蜡切片次。 十二抗原修复:将.柠檬酸缓冲液用电炉加热至.。,再将复水 后的切片放入其中,加热。蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。缓 慢放至室温冷却。 十三封闭:冷却至室温后,将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗次,并将载玻 片置于中,洗次,擦干组织周围的液,马上加上%,使 一些非特异性的位点封闭起来,然后放入温箱中半小时。天津医科大学硕士 学位论文 对象和方法 ? / 十四加一抗: / . / . .将温箱中的载玻片取出,用吸水纸 擦干载玻片反面和正面组织周围的,加一抗,如果做对照实验,就在对照 的组织上加。加完一抗后于冰箱中保存过夜。 十五加二抗: 二抗/二抗将载玻片从冰箱中取出, 放入温箱。之后将载玻片放入中洗次,每次,擦干组织 周围的后加上二抗,然后置于温箱中小时。 十六显色:将载玻片从温箱取出后,在摇床上用清洗 次。擦干组织周围的后加上显色剂。显色,待切片组织变为棕 色后用自来水充分冲洗约分钟; :复染:用苏木素复染,然后用自来水充分冲洗;之后盐酸酒精 酸化,氨水返蓝; /脱水透明:将复染后的片子依次放入%酒精%酒精 一%酒精一%酒精一%酒精一%酒精甲 苯一二甲苯。 十九封片:将切片从二甲苯中取出,用纸或布擦去材料周围的二甲苯。 在材料中央滴一小滴树胶,然后,用镊子加盖盖玻片。切片封好后,放在切片 托盘上待干燥,即可用显微镜观察。 注意事项: ?制片是一个连续的操作过程,往往要连续几天才能完成,因此,事先一 定要制订工作日程计划,应按顺序进行工作。这样可避免和其它工作发生冲 突, 也不会因前后顺序颠到或超过了规定的时间,给工作带来不必要的损失。 ?制片的各个步骤都是互相关联的,如脱水不彻底就会影响到透明的程度, 以至影响蜡块的质量。为此,必须对任何一个步骤,都要细致、严格进行操作。 ?通过本实验可了解到每张切片都是来之不易的,因此,应倍加爱护,不 要损坏。 对照/标本无染色 ?确认是否忽略了应该加的某种试剂,包括一抗、二抗等。 ?确认所有的试剂是否按正确的顺序加入,是否孵育了足够的时间。 ?对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体,以及所用的检测系统是否和 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 一抗匹配,这一点是非常重要的。比如,如果一抗是兔来源的抗体,二抗一定 要用抗兔的二抗来匹配;或一抗是小鼠的一抗,二抗必须是山羊/兔抗小鼠 的不是二抗。 ?检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。 ?检查抗体的有效期和保存条件,尤其是标记了酶或荧光素的抗体,现在 大多数试剂公司的抗体均要求在?条件下保存,应避免反复冻融,试剂保存 时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室,以免降低抗体的效价。 ?检查标本的储存条件,最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。 ?检查色原/底物溶液,最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到 制备好的底物溶液中,如果底物发生预期的颜色变化,则可排除底物的因素。 需要注意的是,有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完,否则会失效。 非特异性染色 ?是否有效地去除了内源性酶和生物素。 ?是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色 消除方法是以二抗动物的非免疫血清,用稀释为%.%溶液孵育切片, 以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白,如牛血清白蛋白也常应用。另外,取材 时避开出血、坏死区亦极重要。 ?一抗的使用浓度是否过高。 ?清洗是否充分。应严格操作规程。 的使用是否正确。的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜 色,使用浓缩型试剂盒时,请严格按照说明书标明的滴加顺序操作,注意 校正蒸馏水的值,以确保实验结果的正确性;粉剂溶解时,常有一些 不溶性颗粒,这些颗粒须经过滤除去,否则可能沉积于切片组织上,产生斑点 状着色。另外,保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上,因此需将 保存于避光干燥处,现用现配。孵育时间过长也会造成背景染色。 ?标本染色过程中是否曾经干涸,否则会造成边缘部的非特异性染色。 石蜡切片免疫荧光染色步骤 一切片常规脱蜡至复水:二甲苯分钟二甲苯分钟一梯度酒 精、、、%各分钟一双蒸水冲洗浸泡次×分钟一用 %浸泡,室温.分钟或。 分钟一双蒸水系次×分钟;对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 二抗原修复:将切片浸入.枸橼酸盐缓冲液.,微波炉加热至 沸腾后断电。自然冷却到室温; 洗次×分钟 四封闭:滴加%封闭液,室温分钟。甩去多余液体不洗 五滴加一抗:滴加适当稀释的一抗 . ,超过组织边 缘,置于湿盒内过夜或者 ?小时; 六复温:取湿盒于。温箱复温,。 七冲洗次×分钟。 八/抗:滴抗 .,温箱孵育,避光二 抗的量要多一些; 九洗次×分钟; 十滴加:避光室温孵育; 十一封片:滴加含有防止荧光淬灭剂。甘油封片。甘油:水:或甘油: :;封片后立即显微镜下观察。: .脑组织石蜡切片染色 将烤干的切片放入二甲苯一二甲苯中,各为, 以溶去切 片上的石蜡。起脱蜡作用的主要是二甲苯,天气热可以少放几分钟,相反,天 气 较冷的话,就要适当延长脱蜡时间; 是将脱蜡后的切片经各级浓度酒精逐渐下降到水的过程,即将二甲苯 中取出的切片移入无水酒精×次一%酒精×次一%酒精一%酒精,各 级中停留; 石蜡切片自来水冲洗分钟; 苏木素滴在组织上分钟; 盐酸酒精酸化秒; 自来水冲洗分钟; 氨水返蓝秒钟; 自来水冲洗分钟; 伊红覆盖组织分钟; 自来水冲洗分钟: %酒精一%乙醇分钟一%乙醇分钟一无水乙醇分钟对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 一无水乙醇分钟一二甲苯分钟一二甲苯分钟; 封片:中性树脂封片固定; 显微镜下观察; .测定脑组织坏死体积 将染色的切片用尼康显微镜拍下,使用软件将照片进行修整。 修整好后使用软件进行坏死体积的计算。公式为:? ×北,为坏死面积;为切片厚度。 .小鼠脑水含量测定千湿重法 将小鼠处死后,迅速剥离脑组织保持脑组织完整性; 用锋利刀片以脑组织中线切开,留取创伤灶侧脑组织,电子分析天平 称其湿重; 之后放入电热恒温干燥箱,?烘烤时,得其干重; 计算公式:含水量湿重一干重/湿重%。 .酶联免疫吸附法 测定小鼠脑组织细胞因子含量 一样品的采集和制备 、收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检 测的标本可储存在.?备用,如有特殊原因需要周期检测,将标本及时分装后 放 在.?条件下保存,并避免反复冻融。样本.?可保存时,.条件下可 保存个月。 、将三组实验小鼠按照不同的时间点收集其脑组织,并迅速把所收集的脑 组织放入.?冰箱保存备用,并做好标记; 、将冰冻脑组织用锋利的无菌刀片沿大脑中线均等切开,并将创伤侧和非 创伤侧分别装在无菌分离管中,并在分离管中放入一定量的无菌冰。 、用一烧杯装上冰块,将装有脑组织的分离管置于烧杯中; 、用超生粉碎机对分离管中的脑组织进行粉碎,可用国产超声波发生仪, 用安培,秒/次间隙秒反复?次; 、将已经匀浆好的组织使用。离心机转/分,离分钟进行离心, 最后使用无菌管收集上清液。并将其置于。冰箱中; 二分析过程 对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 实验前处理步骤 、试验前将试剂和待测样品放置室温下平衡充分混匀,并确定好本次检测 所需的酶标板孔数目,将所需要的微孔放置到配套板架上; 、按照要求用纯净水来稀释浓缩清洗液,充分混匀后备用; 、将本次实验所需微孔做好相应标记, 如有需要做空白对照孔可预留一 孔作为空白对照孔备用,最好采用双孔平行加样: 、准备好一 的刻度移液管: 、准备好.无菌一次性吸管; 、准备好无菌一次性吸管; 、多通道移液器水槽; 、准备的离心管;微孔板摇床; 、准备好波长为的酶标仪;去离子水; 实验前注意事项: 、严格遵守实验室规章制度; 、做好防护,穿戴好防护衣服; 、避免皮肤或眼睛直接接触试剂;若直接接触到试剂,立即使用清水冲洗; 、为避免交叉污染,使用一次性无菌枪头; 配制实验试剂 实验前应该将浓缩缓冲液平衡至室温;待其恢复至室温,再将浓缩液稀释。 如果浓缩液出现结晶析出,将其缓慢加热,直至完全溶解。 、洗涤缓冲液的配制 将浓缩的缓冲液约全部倒入至一个的干净容器中。并将 去离子水倒入至容器中,使其体积达 ;轻轻摇晃,避免起泡。将 稀释好的缓冲液转移至干净的容器中并放至。冰箱,留以备用。×缓冲液可 以 放置天。 、分析缓冲液×的配制 将的浓缩的分析缓冲液全部倒入至干净容器中。并将 的去离子水倒入。轻轻摇晃,避免起泡。将稀释好的缓冲液放至。冰箱,留以 备用。×分析缓冲液可以放置天。 、生物素结合物的稀释 注意:生物素结合物稀释后必须在分钟内使用。用稀释好的分析缓冲液 :对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 将生物素结合物按 的浓度进行稀释。 、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 注意:辣根过氧化物酶标记链霉亲和素稀释后必须在分钟内使用。用稀 释好的分析缓冲液将辣根过氧化物酶标记链霉亲和素按:的浓度进行稀释。 、小鼠.、、及.的标准浓度 注意:使用去离子水复溶小鼠标准.、.、及师.仅:按瓶上 标签溶解达到的体积,轻轻摇晃混匀,使其充分溶解达到浓度的标准为/。 使用后剩余的不能继续储存;标准的稀释液可以直接放入微孔板中。 外部标准稀释 分别在个管上做好标记:、、、、、、,每个管代表相应的 浓度。然后按照以下方法制备:系列浓度的标准刻度:每管加入.的×分析 缓冲液,之后用移液管吸取的标准稀释浓度浓度标准为/到第 一个管中并标记,充分混匀浓度为/。接下来再用移液管从中 吸取第二管中并标记,充分混匀。然后重复次并分别标记好。如下图 所示: 转移 /??、/一??、/??、/??、/??、/??、 .图标准浓度的配制 、检测步骤 开始测试前准备好脑组织上清液。用分析缓冲液×按以下方案对 上清液稀释:此上清液分析缓冲液×;盐酸到此 预稀释的上清液中,混合,室温孵育小时;加入微升氢氧化钠进行中和。 确定测试所需数目的样品加上运行空白和标准所需的适当数目的微孔 条。每个样品,水平,空白和可选的对照样品进行检测,一式两份。移除多余 的微孔条,并铝箔袋与干燥剂密封储存在。冰箱。 每孔约“洗涤缓冲液彻底清洗微孔,清洗微孔条两次。让洗涤缓对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 冲液在孔内约?秒。请注意不要划伤微孔的表面。最后一次洗涤后,用移液 器吸出孔内的洗涤液并用吸水纸巾去除多余的洗涤液。清洗微孔条后立即使 用。 另外,清洗微孔条时,可以将微孔条上下晃动不超过分钟。不要让微孔板干 燥。 把标准品稀释液的加入微孔板中:加入检测缓冲液到所有 制备好的标准液浓度为.皮克/毫升, 标准孔中,一式两份。吸取 一式两份,每份为和见表。反复抽吸混匀孔和的内容物浓度 .皮克/毫升,和微升分别转移到孔和参见图。小心不 要划伤的微孔内表面。重复这个过程次,制备两排的小鼠.、、 及?从.到.皮克/毫升的标准稀释浓度。丢弃从最后的微孔, 中微升的内容。 转移 /,?~、/,?~、//??、/??、/??、/?~、 . . 图标准浓度液加入至微孔板 表 样品 样品 :/ / 样品 样品 呻样品 样品 / 样品 样品 酌: / 样品 样品 / / 样品 样品 ./ ./“ 样品 样品 ./ ./ 空白 空白 样品 样品 将“分析缓冲液一式两份,加入空白孔中;天津医科大学硕士学位论文 对象 和方法 将的分析缓冲液×加入到样品孔中; 将的样品一式两份加入到样品孔中; 将微孔板用膜封闭好,在室温下孵育时并用振动器转摇晃; 准备好生物素结合物; 去掉粘膜,甩空微孑;按步骤洗微孔板次; 把.生物素结合物到所有的微孔中; 将微孔板用膜封闭好,在室温下孵育时并用振动器转摇晃; 准备辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 去掉粘膜,甩空微孔:按步骤洗微孔板次; 加?辣根过氧化物酶标记链霉亲和素到所有的孔中; 将微孑板用膜封闭好,在室温下孵育半小时并用振动器转摇晃; 去掉粘膜,甩空微孔;按步骤洗微孔板次; 吸取底物溶液加入到所有的孔中; 将微孔板在室温下孵育分钟避光; 终止酶反应。 通过快速移液在各孔中加入终止液 重要的是,终止液能够快速且均匀地分散在整个微孔。结果必须马上读取; 如 果微孔条被保存在.?在黑暗中一小时内可读取。 使用的主波长度的分光光度计阅读各微孔的吸光度任选 处作为参考,波长在至范围内是可以接受的。根据制造商 的说明,空白板读数器读取空白孔吸光度。再确的样品和标准的吸光度。 、结果计算 计算每个组标准品和样品的平均吸光度值。副本应取%的平均值: 建立各细胞因子的标准曲线图; 确定的每只小鼠细胞因子对每个样品的浓度,首先找到在纵坐标上的 吸光度平均值和扩大一条水平线的标准曲线的交点,延伸的垂直线的横轴。 相 应的读取小鼠细胞因子的浓度; 如果在本实验步骤中已被血清和血浆样品已稀释:样品 和微升的预 微升分析缓冲液×:的 处理样品检测缓冲液:和细胞培养上清液样品稀释: 样本 .检测缓冲液 盐酸氢氧化钠: 和 预处理的样品“微升检测缓冲液×:.”,从标准曲线上读出 对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 的浓度必须分别乘以稀释倍数或; 样品的浓度超过的计算可能导致不正确的,低小鼠细胞因子水平。 这样的样品需要进一步的外部预稀释根据预期小鼠细胞因子值与分析缓冲 液 ,以便精确地定量实际小鼠各个细胞因子等级; 每个试验者都应根据自身试验室条件建立出适合自己的试验数据及标 准曲线。 . 水迷宫检测空间学习记忆能力 定航实验水迷宫平台置于水下.,水温??,位于一黑 色屏风内,屏风内四面有不同图案,小鼠可根据屏风内图形线索进行定位,实 验过程中图形位置大小保持不变。每只小鼠在进行训练前一天需进行适应训 练 分钟。小鼠空间参考记忆能力的测试见图:通过记录小鼠每次寻找平台所需 要时间即为逃避潜伏期,进行记录,反映小鼠对平台空间位置的记忆来评 价小鼠的空间学习能力,逃避潜伏期越短则说明小鼠空间学习能力越好。实 验 动物随机从水池的四个入水点将小鼠轻放入水,给予每只小鼠最长的学习记 忆时间。如小鼠在找到平台,则允许小鼠在平台上停留进行巩固记忆; 如小鼠在内不能找到平台,则学习时间记录为,实验者同时将小鼠引导上 平台,保持其停留在其上。每只小鼠每天四个入水点各训练次,共训练次: 计算每天各组次逃避潜伏期。水迷宫软件自动记录逃避潜伏期。每天训练完 后 将其身体水分吹干并放回笼中饲养。连续训练天。 图小鼠水迷宫入水点 探索实验小鼠于后第天进行空间探索实验,探索实验过程为将平台 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 去掉,各组小鼠由距平台最远的点头朝池壁入水进行探索,给予每只小鼠半 分 钟的时间,并进行记录统计其在目标象限的百分率。 统计学分析方法 计量资料用均数士标准差士表示。各组小鼠认知功能之间的比较采用重 ;多组间的比较采 复测量方差分析 . ,组间比较采用法,所有数据均采用 .进行统计学分析。检 验水准为.,以.为差异有统计学意义。 天津医科大学硕士学位论文 结果 多士里 三日木 .后,小鼠外周脾脏的变化情况 本实验中用流式细胞术检测小鼠脾脏的水平,使用、、 单克隆抗体标记。我们观察到小鼠脾脏组织中水平在伤后第一天各 组间未见明显变化;在伤后第三天时各组间出现了差异,与假手术组比较,其 余两组的水平都出现下降,而生理盐水组中的水平下降更明显。与 生理盐水组相比,小鼠脑损伤后第一天时,重组人促红细胞生成素治疗组 水平比较无明显差异。在伤后第三天时,小鼠的水平促红细胞生成素组中 的水平比较有差异,有统计学意义.。见图皤 ”。 .% .%, 三 ; : ‘ 甘。 寸‘ 寸 口 一 : ; ? 、 , .’., ?’ 帕’ ’ ?一 ; ’。 。毫套 凄装 一 : ’ 、,?“ 黟 漂; : “。 一 滋黼鸶 , 口叫 一’ 计 黻 灞 蒸. 蘸熬 ?‘??’‖?一?’》‘ ?‖?‖?‖”‘焉‘ “”;: ?‘裂川? ? .%.% .兰 飞