蛋白质工程复习题1

蛋白质工程复习题1 一.填空 1. 蛋白质一级结构(primary structure)指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序，也是蛋白质最基本的结构。蛋白质一级结构的N端测定法最常用的是 Edman化学降解法 。 2. 蛋白质指纹图谱技术也称为表面增强激光解吸电离飞行时间质谱SELDI-TOF-MS，是一种包含层析和质谱的特殊蛋白质芯片技术，用于蛋白质定量。 3. 双向电泳是两种电泳的组合，即先进行等电聚胶电泳(按照pI)分离，然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小分离)。经染色得到的电泳图是二维分布的蛋白质图。 4. 噬菌体表面展示技术将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中,将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合,并在其表面展示, 直接将可见的表达型与其基因型联系在一起,利用其配体的特异性亲和力,将所感兴趣的蛋白质或多肽挑选出来。 5. Kunkel法或称 “U” 法所用的双缺陷大肠杆菌是:dut-dUTP 酶缺陷和ung -UDG 酶缺陷。 6. 维持蛋白质空间构象的作用力有氢键 ，配位键，疏水作用力和范德华力等，研究蛋白质构象的方法可以分为两大类:一类是测定溶液中蛋白质分子构象，如核磁共振;另一类是晶体蛋白质构象测定方法如X射线衍射结构分析法等。 7. 常见的蛋白质超二级结构有 ,, ，,,, 和 ,,, 等。 8. 利用分子生物学技术，在体外试管中可以通过碱基取代、插入或缺失使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，叫做定点诱变。 1. 在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理的蛋白质分离纯化方法。 2(在基团工程中常用的限制性内切酶的类型是 2型限制性内切酶, 大部分限制性内切酶识别的序列呈 回文结构 。 3. 常见的蛋白质二级结构有α螺旋、β折叠和β转角 。 4. 转化指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。 6(抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。 二.名词解释 1(蛋白质芯片:基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。 2.蛋白质工程:蛋白质工程是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生新的特征蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质结构和功能的关系。 3. 基因工程抗体:是将将IG基因结构与功能的了解与DNA重组技术相结合，根据研究者的意图在基因水平对IG进行切割拼接或者修饰,甚至是人工全合成后导入受体细胞表达,产生新型抗体,由此形成的抗体称为人源化抗体。 4. SCFV:FV片段抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段,由轻链的可变区和重链的可变区组成,通过一段适当的寡聚核苷酸接头连起来,使之表达成一条单一的肽链,成为单链抗体SCFV. 5. PDT:噬菌体多肽文库是利用噬菌体表面表达技术(phage display techniques ,PDT) 在 体外条件下构建的多肽文库,将编码外源肽可变区DNA 片段插入噬菌体基因组中,以融合形式与噬菌体的表面蛋白共同表达于噬菌体表面。 6. 生物信息学:生物信息学是综合生物学、数学、物理学、信息科学以及计算机科学等多学科的理论方法的一种交叉学科。 1(双向电泳:双向电泳是两种电泳的组合，即先进行等电聚胶电泳(按照pI)分离，然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小分离)。经染色得到的电泳图是二维分布的蛋白质图。 2. 超二级结构:超二级结构是介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件，其基本形式有αα、βαβ和βββ等。 3(亲合层析:利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其它分子的层析技术 4. 分子病 (molecular disease)由于遗传上的原因而造成的蛋白质分子结构或合成量的异常所引起的疾病。蛋白质分子是由基因编码的，即由脱氧核糖核酸(DNA)分子上的碱基顺序决定的。 5. 限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 6. 基因工程抗体:根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括-嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。 三(选择 1. 定向进化中两项重要的支撑技术是:[AC] A.产生大量的突变体以提供素材; B.DNA改组(DNA shuflling); C.合适的筛选系统; D.交错延伸技术(StEP); 2. 不连续PAGE电泳时会产生3种物理效应:[ABD] A(样品浓缩效应 B(分子筛效应 C(电渗效应 D(电荷效应 3. 蛋白质时两性电介质，当溶液的PH在其等电[点以上时蛋白质分子带 电荷，而PH在等电点以下时，带 电荷.[A] A(,，， B. ，，, C(，，， D(,，, 4. 基因载体应具备的条件:[ABCD] A(有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个 B(有选择标记，例如抗药性标记; C(有一定容量; D(有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。 5. 以下说法那 一个是对的[C] A(凝胶过滤法可用于测定蛋白质分子量，分子量小的蛋白质先流出柱，分子量大的后流出柱. B. 蛋白质在小于等电点的PH溶液中，向阳极移动，而在大于等电点的PH溶液将向阴极移动. C. 通过透析法和超滤法浓缩蛋白质。 D. 一个蛋白质样品，在某一条件下用电泳检查，显示一条带。因此说明该样品是纯的. 6.常用的基因和基因组数据库有[ACD] A(GENBANK; B.PDB; C.EMBL; D. DDBJ; E.SWISS-PROT; F.KEGG 7. 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是 [D] A. 修复自身的遗传缺陷 B. 促进自身的基因重组 C. 强化自身的核酸代谢 D. 提高自身的防御能力 8. 目前唯一能够直接观察蛋白质内部的原子和基团的排列是[B] A. NMR B. X-射线衍射法 C. 电子显微镜 D. MS 9. 用下列方法进行重组体筛选，只有[C]说明外源基因进行了表达。 A(Southern印迹杂交 B. Northern印迹杂交 C. Western印迹 D.原位菌落杂交 10.白细胞介素2在医学上具有广泛的用途,其多肽链上有3个[A]残基,在产品纯化过程中它们之间极易发生二硫键的错配,导致整个多肽失活。蛋白质工程将其中不应配对的那个[ ]通过点突变转变成丝氨酸,就可避免二硫键的错配,从而把活性提高了7倍以上。 A(Cys Cys B. ALA ALA C. Cys ALA D. ALA Cys 1(噬菌体抗体库技术的优点:[ABCD]; A(可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程; B(抗体基因筛选的范围广; C(技术稳定、可靠、生产周期短; D(可规模化生产; 2(离子交换剂按化学性质分为[ABC] A(纤维素离子交换剂 B(交联葡聚糖离子交换剂 C(树脂离子交换剂 D(阳离子交换剂 3 定点诱变的意义与应用有:[ABCD] A.蛋白质功能的研究，研究影响蛋白质功能的关键结构域 B.对调控区进行突变研究基因结构与功能之间的关系 C.通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造。 D.新型疫苗或药物的开发:在不影响蛋白质抗原性的同时，最大限度的降低其毒性作用。 4(下列关于蛋白质变性作用的叙述哪一个是正确的[A] A.高级结构的破坏 B. 肽键的断裂 C.分子中共价键的断裂 D. 蛋白质一级结构的改变 5. 不连续PAGE电泳时会产生3种物理效应:[ABD] A(样品浓缩效应 B(分子筛效应 C(电渗效应 D(电荷效应 6. 目前唯一能够直接观察蛋白质内部的原子和基团的排列是[B] A. NMR B. X-射线衍射法 C. 电子显微镜 D. MS 8. 表达载体应具备的条件:[ABCD] A(启动子 B(MCS; C(SD序列; D(终止子。 10. 下列关于免疫球蛋白 G 结构的叙述哪一个是不正确的[C] A. 由两条轻链和两条重链组成 B. 其分子形状为 Y 型结构 C. 重链和轻链之间主要靠非共价键连接 D. 轻链有两个结构域，重链有四个结构域组成 四(简答题 1(蛋白质工程的程序有哪些, 答:筛选纯化需要改造的目的蛋白，研究其特征常数;制备结晶，并通过氨基酸测序，X射线衍射分析，核磁共振等研究，获得蛋白质结构和功能的相关的数据;结合生物信息学的方法对蛋白质的改造进行分析，确定蛋白质结构和功能的关系，进而找出可以修饰的位点和可能的途径，根据氨基酸序列设计核酸引物或探针，并从CDNA文库或者基因文库中获取编码该蛋白的基因序列;在基因改造设计的基础上，对编码的序列进行改造，并在不同的表达系统中表达，分离纯化表达产物，并对表达产物的结构和功能进行检测。 2(蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同, 答:基因工程是遵循中心法则，从DNA?mRNA?蛋白质?折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的:确定蛋白质的功能?蛋白质应有的高级结构?蛋白质应具备的折叠状态?应有的氨基酸序列?应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。 3. 图解说明重叠延伸PCR定点突变的原理和过程 ,,,法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过,,,扩增而获得定点突变的基因或,,,片段。 • 4(什么是SDS-PAGE,SDS-PAGE测定蛋白分子量的原理是什么, 答::SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 3(什么是单克隆抗体和多克隆抗体,两者有什么异同, 答:多克隆抗体指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。而单克隆抗体是通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体. 4( 常用的原核表达系统和真核表达系统有哪些,各有什么优缺点, 五.论述题 1.简述蛋白质结构与蛋白质功能的关系，及其蛋白质工程的在研究此关系中的应用。 答:蛋白质中的氨基酸序列与生物功能密切相关，一级结构的变化往往导致蛋白质生物功能的变化。如镰刀型细胞贫血症。蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化，其功能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。 (1)核糖核酸酶的变性与复性及其功能的丧失与恢复 核糖核酸酶是由124个氨基酸组成的一条多肽链，含有四对二硫键，空间构象为球状分子。将天然核糖核酸酶在8mol/L脲中用β-巯基乙醇处理，则分子内的四对二硫键断裂，分子变成一条松散的肽链，此时酶活性完全丧失。但用透析法除去β-巯基乙醇和脲后，此酶经氧化又自发地折叠成原有的天然构象，同时酶活性又恢复。 (2)血红蛋白的变构现象 血红蛋白是一个四聚体蛋白质，具有氧合功能，可在血液中运输氧。研究发现，脱氧血红蛋白与氧的亲和力很低，不易与氧结合。一旦血红蛋白分子中的一个亚基与O2结合，就会引起该亚基构象发生改变，并引起其它三个亚基的构象相继发生变化，使它们易于和氧结合，说明变化后的构象最适合与氧结合。 从以上可以看出，只有当蛋白质以特定的适当空间构象存在时才具有生物活性。 2.什么是蛋白质组学,蛋白质组学研究的技术方法有那些,蛋白质组学的发展趋势怎样, 答:这个概念最早是在1995年提出的，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 蛋白质组学研究的基本技术 : 对于蛋白质组学的研究来说，它的最基本的实验手段就是利用双向凝胶电泳(2DE)，在整个基因组水平上检测蛋白质表达的情况。双向凝胶电泳首先利用等电点聚焦来分离不同等电点的蛋白，再利用SDS,PAGE来分离不同分子量的蛋白，其分辨率是非常高的。微克级的蛋白质就可以被很好的分辨开了，如在微克级水平上，有人从一个蛋白混合物中最多分开了11200种蛋白质，数量是非常可观的。因而，微克级的蛋白的双向凝胶电泳常被用来初步检测表达或修饰有变化的蛋白。然后，同样的蛋白混合物样品可用于毫克级的2DE，这样，电泳图谱上的每一个多肽就可被纯化并进行下一步的分析，如质谱，末端或中间的氨基酸序列分析等。 仅仅进行双向凝胶电泳显然是远远不够的，因为由双向电泳得到的蛋白质表达情况的变化并不能和具体的何种蛋白表达出了变化联系起来。而一些如蛋白质印迹或凝集素亲和印迹等传统技术对于这方面的信息也帮助不大。为了鉴定这些由电泳得来的蛋白，质谱(MS，mass spectrometry)被广泛应用在蛋白质组学中。对于蛋白质的鉴定，有两种方法用的最为广泛，即MALDI,MS 和ESI,MS。这两种方法各有自己的 适用范围，通常前者对于分析高分子量的蛋白更有效，而后者对于蛋 白的检测灵敏度更高，常可达到飞克级水平以下。质谱可以用于蛋白质分析主要是因为它可以提供特定蛋白的不同方面的结构信息，如它可直接测定蛋白或多肽的分子量信息，也可用来获得一些蛋白质序列信息等。同时，质谱也可通过多肽片段分子量的改变来得到一些关于糖型，磷酸化和其它翻译后修饰的数据。因此，质谱对于蛋白质的鉴定是非常重要的，而它的进展也无疑会大大促进蛋白质组学的研究进展。 在基础研究方面，近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。 在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的 前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。 3(如果测定了某生物的一段DNA序列，你认为通过哪些可能的途径可以了解此段序列的功能, a) 首先进行未知基因的描述性功能研究:包括生物信息学分析,二级结构预测等 b) 开展实验性描述工作:包括时间空间表达,组织特异性表达,细胞定位,基因组中copy多少 等 c) 功能性研究:过表达对生物体发育影响,抑制表达对生物体发育影响和其他基因变化 d) 真正意义的深入研究:可以深入到信号通路中明确影响 (任何1-2点深入讨论即可以) 举例说明其在蛋白质工程中的应用。 1(简述理解酵母双杂交的原理, 答:酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白,蛋白的相互作用。 A、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 B、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 C、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 D、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map) 4:已知一种突变的噬菌体蛋白是由于单个核苷酸插入引起的移码突变的，将正常的蛋白质和突变体蛋白质用胰蛋白酶消化后进行指纹图分析。结果发现只有一个肽段的差异，测得其氨基酸顺序如下: 正常肽段 Met-Val-Cys-Val-Arg 突变体肽段 Met-Ala-Met-Arg 1) 指出此肽段在该蛋白质分子中的位置，并说明原因。 2) 什么样的突变(什么核苷酸插入到什么地方)导致了氨基酸顺序的改变, 3) 推导出编码正常肽段和突变体肽段的核苷酸序列。 (提示:有关氨基酸的简并码) Val GUU GUC GUA GUG Cys UGU UGC Arg CGU CGC CGA CGG AGA AGG Ala GCU GCC GCA GCG) 答:(1)N端;(2)在正常肽段的第一个Val的密码GUA的G后插入了一个C ;(3)正常肽段的核苷酸序列为:AUG GUA UGC GU* CG*;突变体肽段的核苷酸序列为:AUG GCU AUG CGU