组氨酸对局灶性脑缺血引起的长期脑损伤的保护作用（已处理）

组氨酸对局灶性脑缺血引起的长期脑损伤的保护作用（已处理） 浙江大学医学院 硕士学位论文 组氨酸对局灶性脑缺血引起的长期脑损伤的保护作用 姓名:赵华伟 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:张仲苗;陈忠 20091228 浙江人学硕(Ij学位论文 中文摘要 组氨酸对局灶性脑缺血引起的长期脑损伤的保护作用 浙江大学医学院 药理学 硕士研究生 赵华伟 导 师 张仲苗主任药师 陈 忠教授 中文摘要 【背景和目的】 组胺是一种在中枢神经系统内广泛存在的神经递质和神经调质，它在中枢神 经系统的生理、病理过程中起着重要的调节作用。已有研究发现，组胺可以减轻 脑缺血前期的脑损伤。但是，组胺对脑缺血后期脑损伤的作用尚不明确。由于组 胺在脑缺血前期、后期可能的作用靶点不同，并且组胺还可以双向调节与脑缺血 损伤密切相关的NMDA受体，因此我们在缺血前期后期利用不同的给药给予 可增加组胺能神经元活性的组胺前体物质组氨酸 组胺本身无法通过血脑屏障 ， 研究组胺对脑缺血引起的长期脑损伤的保护作用。 【实验方法】 采用SD大鼠，分为假手术组、缺血模型组以及四个给药组，给药组采用不同 的给药方案，其中His1000(0是只在缺血前期给予1000 mg,kg的高剂量的组氨酸; His 500(500是在整个缺血过程中给予低剂量组氨酸500 1000(500是 mg,kg;His 在缺血前期给予高剂量组氨酸1000mg,kg而在缺血后期给予低剂量组氨酸 500 1000(1000是在整个缺血过程中给予高剂量组氨酸1000 mg,kg;His mg ,kg。在相 应的时间点对各组大鼠进行行为学检测以及脑梗死面积和胶质疤痕的检测。 【结果】 实验结果发现，与缺血模型组相比较，组氨酸在His1000(500给药方 式下， 可以明显的改善脑缺血引起的长期脑损伤:在神经症状评分上，His1000(500 在缺 血后第14、28、42、56天均有显著改善作用，而其它各组均没有显著改善作用; lI 浙江人学顾I:学位论文 中文摘要 在运动量上，His1000(500在第14、28、42、56天时均有显著性的降低了运动量， 1000(1000 另外，His500―500在缺血后第14、42、56天也可以降低运动量，同时His 在缺血后第14天也可以降低运动量;在恐惧学习记忆方面，在缺血第28、56天， His 1000(500可以显著改善大鼠的背景和线索学习记忆，另外His500(500也改善 了第28天时线索记忆，His1000(1000也改善了第56天的背景记忆;在空间学习 记忆上，第28天时His1000(500显著改善了大鼠的学习记忆，第56天时，His 1000(500和His500(500效果相当的改善了学习记忆;在脑梗死面积上，第28、56 天时，均只有His1000(500显著减小了梗死面积;在胶质疤痕上，第28、56天时， His 500(500也减小 1000(500显著减小了胶质疤痕的面积，另外，第28天时，His 了胶质疤痕。 【结论】 本课研究发现组氨酸对脑缺血后长期脑损伤具有明显的改善作用，表现为 神经功能和学习记忆的改善，梗死和疤痕面积的减少。在前期给予1000 mg,kg， 后期给予500 mg,kg，可以最为显著地减轻缺血损伤，可能是因为不同的剂量在前 期和后期发挥了不同的作用机制，针对性的改善了前期和后期的损伤。这种缺血 后不同时期给予不同剂量的给药方案也为临床治疗缺血性脑损伤提供了一种新的 策略。 关键词:组胺;组氨酸;脑缺血;胶质疤痕;学习记忆 III 浙江人学硕(I:学位论文 英文摘要 Histidine cerebral protectsagainstlong??-term injury inducedfocalcerebralischemia by Schoolof Medicine，ZhejiangUniversityPharmacology forMasterZhaoHuawei Postgraduate ZhangZhongmiao Supervisor Chen Zhong Abstract isoneofthemost distributedneurotransmitterof Background:Histaminewidely an in and neuromodulatorand role playsimportantphysiologicalpathologicalprocesses inthecentralnervous hasbeenknownthathistamine cerebral system(It protectsagainst ischemiathe roleofhistaminethelate of duringearlystage(However,the during stage isstill thedifferentofhistaminetothe cerebralischemia targets unclear(Considering orlate after bi-directionalofNMDA which early stage ischemia，and regulation receptor inthebrainischemia usedifferentadministrationschedules involved byhistamine，we to theeffectof of enhancescentral histidine，a histamine，which study precursor the aftercerebralischemia( histaminergicactivity,onlong??terminjury were model and Methods:SDrats dividedinto group，ischemicgroup sham-operated 1 fourtreatment treatment differentadministrations:His groups，and groupsusing 000-0， ofhistidineof1000 the givenhigh―dose mg,kgduringearlystage;His500―500， only 500 low―dosehistidineof thecourseofbrain throughout ischemia;His given megkg 1 histidineof1000 the andlow-dose 000-500，givenhigh-dose m眺gduringearlystage histidineof500 thelate His1000-1 megkgduring stage;and 000，givenhi曲-dose histidineof1000 theCOurSeofbrainischemia(Atdifferenttime throughout mg,kg after sizeand scarareawereevaluated ischemia,behavioral points change，infarctglial 浙江人学硕。I:学位论文 英文摘要 ineach group( Results:Administrationofhistidine alleviated cerebral significantlylong-terminjury causedcerebralischemia(His1000―500 the scoreand neurological by improved 56 reducedthelocomotoron 1 after 42，day ischemia，In activityday4，day28，day alsoreducedthelocomotoron 1 500―500 42， and56， addition，His activityday4，day day reducedthelocomotoron 14(Onfear whileHis1000―1000also activityday 1000??500 thecontext andcue conditioning，Hissignificantlyimproved memory on 28and His500-500 thecue on 28， memoryday day56，while improvedmemoryday andHis1000―1000 thecontext on 56(On and improved memoryday spatiallearning 1000―500 on His1000―500 improvedmemoryday28，while memory,Hissignificantly andHis500―500 on 56(Oninfarct His day considerablyimprovedmemory area,only 1000―500 reducesinfarctsizeon 28and 56(Onthe SCar significantly day day giial area， His1000-500 SCar His500-500alsoreducedthe significantlyreduced西ialarea,and 西ialscaronday28( histidine the Conclusions:Thefoundthat markedlyprotects long-term study against aftercerebralischemiaon and memory,infarctarea, injury neurologicalscore，leafing and scararea(Theadministrationofhistidinewith1000 atthe glial mg,kg earlystage， and500 atthelate themostobvious m眺g stage，showed protectiveeffect(Maybe mechanismsatthe andlate differentdosesofhistidinehavedifferent early stages(And thiswill anew forclinicaltreatment( providestrategy and words:Histamine;Histidine;Cerebralischemia;Glialscar;Learning Key memory V 浙江大学硕J:学位论文 缩略词表 缩略词表 英文缩写 英文全名 中 文全称 NMDA N一甲基-D-天冬氨酸 N-methyl-D―aspartate MCAO Middlecerebralocclusin artery 大脑中动脉阻塞 o【-FMH S 一o【一flioromethylhistidine His Histidine 组氨酸 DAB 二氨基联苯胺 3,3(Diaminobenzidine tetrahydrochloride PBS bufferedsaline 磷酸缓冲液 Phosphate P皤 Paraformaldehyde 多聚甲醛 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝望盘鲎或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:匙笄, 节 签字日期: 功，口年弓月乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘鲎有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆盘鲎可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名:1起库伟 翩躲澎肜 签字日期: 伽『口年?月 孑日 签字日期形‖秒年夕月垆日 浙江人学硕一l:学位论文 致谢 致 谢 值此论文完成之际，在这将要跨出校门、走进社会的当前，我要向所有帮 助过我的老师、同学、亲友表示衷心的感谢! 首先衷心感谢我的两位指导老师，张仲苗主任药师和陈患教授。感谢张老 师从我入学以来对我在各方面的帮助和悉心指导，也感谢张老师能安排我在陈 老师的实验室完成研究生的学习。在这里，也特别感谢陈老师，感谢陈老师在 这两年半的时间里一直把我当自己的学生看待，并且对我实验研究的开展提供 了极大的指导和帮助，陈老师敏捷的思维方式、丰富的科研经验和忘我 的工作 热情都给我留下了深刻的印象，是我终身学习的榜样。我衷心的感谢我的两位 指导老师，谢谢你们! 衷心感谢实验室胡薇薇老师和张世红老师对我的指导和帮助，感谢实验室 所有同学对我在学习、实验和生活上的帮助和关心，真心的谢谢你们，在以后 的生活中，我会经常怀念这段生活。 最后，要衷心感谢我的家人，感谢他们对我物质上的支持和精神上的鼓励， 谢谢! 浙江大学硕J:学位论文 引言 1引 言 脑卒中是中老年人的常见病和多发病，具有“三高一低” 发病率高、致残率高、 病死率高、治愈率低 的特点。在发达国家，该病已成为第二大致死性疾病，第一大 致残因素。我国每年卒中死亡人数约达百万，生存者常留有不同程度的认知、行 为能力减退，给家庭和社会带来沉重负担。 大部分脑卒中为局灶性的脑缺血，为了解决脑缺血对人类的危害，目前已有 大量的治疗方面的研究。但是，目前被FDA批准的治疗急性缺血性卒中的方法只 等研究认为3(6小时内溶栓治疗是十分有效的【41，但其缺点是溶栓治疗的时间窗 太短，且溶栓后血氧再灌注过程中产生的大量自由基，也会可能造成再灌注损伤【51。 除此之外，几乎所有在实验中有效的药物都没有能够进入临床使用。很多开发出 来的药物在三期临床试验时都被证明无效，如谷氨酸盐拮抗剂类中的两个药物 钙通道拮抗剂中的尼莫地平 减少钙离子内流 ;钠通道拮抗剂中的磷酸苯妥英 降低兴奋性和谷氨酸盐释放 ;自由基清除剂中的替拉扎特 降低自由基团的 损伤 ;一氧化氮阻滞剂中的芦贝鲁唑 减少谷氨酸盐释放或者减少一氧化氮介 导的损伤 等。 究其原因，是因为缺血后脑组织发生着复杂的病理生理变化。在脑缺血 前期， 能量代谢障碍使胞外钾离子浓度升高，神经元去极化引起谷氨酸大量释放，过度 激活NMDA受体，NMDA受体操纵的钙离子通道开放，大量钙内流，引起细胞内 钙超载【61;并且在缺血再灌注时，生成大量的自由基，引起瀑布式的自由基连锁反 应[71。这些都导致了脑缺血前期的神经元兴奋毒性损伤。随着时间的延长，受损的 神经元产生多种粘附分子和调节因子，以及白介素(1和白介素(6等细胞因子，引 发了炎症和神经细胞的凋亡【8。111;而在脑缺血的后期，则主要是以神经元再生、胶 质细胞增生和血管再生为主要表现的脑重构为主，胶质增生所导致的疤痕的形成 对神经再生起到了抑制作用[12-14】。脑缺血的治疗主要包括前期抑制损伤的发生和 l 浙江大学顾I:学位论文 引苦 后期促进康复的过程，仅针对某个单一靶点的治疗，与缺血后发生级联反应的复 杂性是相悖的，因此在临床上没有取得很好的治疗效果。近年来有学者开展联合 应用多种脑保护剂的研究，并已发现针对缺血后多个靶点的鸡尾酒疗法有更好的 脑保护作用。所以，开发针对多靶点的缺血后脑保护药物已成为脑缺血治疗研究 领域的一个重要方向。 组胺是一种体内广泛存在的神经递质和神经调质。它在许多中枢神经活动中 起着重要的调节作用，如觉醒(睡觉、痛觉等。研究表明，组胺在脑缺血中也发挥 着重要作用。首先，组胺可以缓解缺血前期的神经损伤，在局灶性脑缺血2小时 以后，立即给予以及缺血后6小时给予组氨酸可以剂量依赖性的减小梗死面积， 组氨酸进入体内后，在组氨酸脱羧酶的作用下生成组胺，通过H2受体而发挥保护 作用【15】，并且，给予组氨酸后还能增加纹状体和海马CAl区存活神经元的数目【16， 17】。另外，给予组胺和促进组胺释放的H3受体拮抗剂可以减轻由NMDA引起的 皮层神经元兴奋性损伤，这种作用主要是通过H2受体,cAMP,蛋白激酶A介导的， 本研究组的前期工作进一步发现其机制可能与组胺促进NMDA受体内化的作用有 关。这些研究表明，组胺在缺血早期对神经元有保护作用，机制可能是其通过H2 受体抑制NMDA介导的神经元兴奋性毒性作用。同时，组胺可以通过其H2受体 抑制缺血后中性粒细胞、小胶质细胞、T淋巴细胞的浸润，并且组胺可以通过H2 受体抑制TNF―a、IAM(1等因子的产生，抑制炎症反应【18】(但是组胺在缺血后期 的脑保护作用尚不清楚。 Anayansi等报道【19】，组胺可以通过H2受体浓度依赖的促进神经干 细胞的增 殖，并通过H1受体促进其定向分化成神经元，而通过诱导凋亡使分化成星形胶质 细胞的数量大大减少。最近又有报道，微摩尔浓度的组胺可以促进中脑神经干细 胞的分化。另外，我们的预实验发现，给予组胺前体物质组氨酸可以显著减少脑 缺血后期梗死区边缘星形胶质细胞形成的疤痕面积，提示了组胺对缺血后期的神 经功能恢复可能有促进作用。所以，组胺可能不仅可以通过改善脑缺血前期兴奋 性毒性损伤和炎症反应，也可能通过改善脑缺血后期神经再生和胶质疤痕改善缺 血后期的神经损伤，起到神经保护作用，这种对于前期和后期的多靶点作用强烈 2 浙江大学硕(I:学位论文 材料 提示着组胺可能是一种切实有效的脑保护药物。因此，我们将着重研究组胺的长 期的脑保护作用以及对其后期星形胶质疤痕形成的影响。 另外，同一靶点在缺血前期和后期也发挥不同的作用，如在脑缺血中扮演重 要角色的NMDA受体。脑缺血后早期给予NMDA受体拮抗剂后，可以抑制兴奋 性神经毒性损伤，从而起到保护作用。但是，长期应用NMDA受体拮抗剂会不利 于神经损伤的恢复，神经再生、神经网络的重建也会被NMDA受体拮抗剂所抑制。 因此，长期同一程度的抑制NMDA受体不能起到很好的脑保护作用。如NMDA 受体拮抗剂也曾一度被认为可以作为神经保护剂保护缺血损伤，但是他们在缺血 后期却加重了损伤[20,21]。组胺有抑制NMDA介导的神经元兴奋性毒性作用，并对 NMDA受体有双向调节作用【22'231。因此，组胺可能需要不同的给药方案，不同程 度地调节NMDA受体，从而在缺血的前期和后期发挥最佳保护作用。另外，由于 组胺对缺血前期和后期的可能存在着不同的作用机制，因此进一步提示可能需要 采取不同的治疗方案。 由于组胺本身不能通过血脑屏障，所以我们利用组胺前体物质组氨酸 其可 以透过血脑屏障，在组氨酸脱羧酶的作用下转变成组胺 ，观察其对缺血后长期的 神经功能的影响，包括神经症状和学习记忆能力，并针对缺血后期的作用靶点如 对胶质疤痕形成的影响进行研究，且寻找最佳给药方案。 2材料 2(1实验动物 SD大鼠购自浙江大学实验动物中心。所有的动物实验均遵照国家实验动物饲 4-1 养和使用指南，动物饲养在温度控制的环境 22 oC 下，12h明暗循环，自由 饮食和饮水，采用体重在220(250 g的大鼠进行试验。 2(2化学试剂 1 浙江人学硕I:学位论文 材料 清、兔抗鼠GFAP单克隆抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司 1:50 ;异硫氰 研究所;蔗糖、中性树胶、30,H202、水合氯醛，均购自国药集团化学试剂有限 公司;四硼酸钠 硼砂 ，购自江苏太仓化工二厂;牛血清白蛋白、叠氮钠、30,triton -X100，均购自上海生工生物工程有限公司。 2(3实验仪器 条件恐惧性记忆的刺激器， Hamilton(Kinder maze company,CA，US ;Water FacilitiesCo ZhenghuaBiologicApparatus Ltd，Huaibei，China 2(4溶液配制 O(1MPBS: NaCl 9 g 2(8 Na2HP04‘12H20 g 0(4 NaH2P04。2H20g H20 100ml PH 7(2(7(4 抗体稀释液: 牛血清白蛋白 l g 叠氮钠0(08 g 100 l ml 30,triton(X 0(01MPBS lOOml DAB ml mlPBS，然后加入o(01 称取固体粉末6mg，加入10 30,1均H202溶解，即可 配得。 4 浙江人学硕(I:学位论文 实验方法 多聚甲醛 PAF : 1(0(2MPB 配PAF用 32(6 NaH2P04’2H20 g NaOH 6 g 去离子水 1000ml 2(8,PAF 160 ml，加热溶解，加适量NaOH 80 g多聚甲醛用去离子水定容至2000 edl ， 可使液体澄清透明。 3(4,PAF M 8,PAF与o(2PB等量混合，调PH至7(4，过滤。 甲苯胺蓝溶液配制 1, 500mg甲苯胺蓝用去离子水定容至50ml，过滤。 3实验方法 3(1大鼠短暂局灶性脑缺血模型的制作及给药方法 cnl左右，头端o(500toni涂 栓线的准备:取O(180rain尼龙渔线，截做每段4 innl、15nlnl、20 上硅胶最终直径0(300rllrn左右，距插入端10 111111三处分别用标 记笔作标记。 模型制作:参照本实验室依据Longa等建立的大鼠大脑中动脉阻塞 middle cerebral artery 灶性脑缺血【24，251。将大鼠用10,水合氯醛3(5 ml,kg腹腔注射麻醉，颈部正中切 端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉近分叉处切口，插入拴线，插至稍感阻力时 即可，其深度为17,20mm，动脉外用手术线绑扎固定。栓线进入颈内动脉，入 min后，拔出栓线，扎 颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。缺血90 浙江人学硕’Ij学位论文 实验方法 4-o(5 紧切口，缝合皮肤。实验过程中保持肛温37 oC。术后将大鼠放入保温箱 Peco Services Ltd 内至苏醒，然后放入笼中饲养。 实验分组:组氨酸溶于生理盐水 100mg,m1 ，调节pH至6(3(6(4。根据给 药时间和剂量的不同共分为6组 如图3(1 ，@sham组是不给予缺血处理，也 不给予组氨酸腹腔注射;@ischemia组是给予缺血处理，但不给予组氨酸腹腔注 射;@His1000(0组表示在缺血后立即给药、缺血6小时后、缺血后第1、3、5、 7天给予组氨酸1000 500(500组表示在缺血后立即给药、缺血6小 mg,kg;@His 时后、缺血后第l、3、5、7„„天给予组氨酸500 mg,kg，一直隔天给药至灌流 取脑; ?His1000(500组表示在缺血后立即给药、缺血6小时后、缺血后第1、 3、5、7天给予组氨酸1000 mg,kg直至灌流取脑; mg,kg，之后一直隔天给药500 ?His1000(1000组表示在缺血后立即给药，缺血6小时后、缺血后第l、3、5、 7„„天给予组氨酸1000 mg,kg，一直隔天给药至灌流取脑。 6 浙江人学硕J:学位论文 实验疗法 口 器 量 ?UIJIJU肖研 器 ' 箔 口 霜 口 西芒西E 罱 胃 oo啦 mU暑lJU曙协 ? _ 榴 里，6 l 曩兰蕊E E 西卫,6E 旦、6Lu l o 西 o 08 oooI- 一 卜- 蕾 n I n 西 f，6 西 l，6 E E 勺 '_ 二 oool- oooI- ‘? 三 a 2 _皇o_置一(I苎】【?oII_-o?一j勺oIIu? 鳘 稍长糯禽朵蠼长刚裂留舞雌娶碌淼想球一(,fij o二日一(,(兽函 E币c? 一-E?二o?一 宁 ooor?茔 oo蚺-oo蚺?莹 oon-oooI(sIz oao?oa口 I_?一Z 7 浙江人学硕I:学位论文 实验方法 3(2体重检测 在缺血前以及缺血后第1、3、7、14、28、42、56天进行大鼠的体重检测， 并做记录。 3(3神经症状评分 在缺血后第1、3、7、14、28、42、56天进行大鼠神经症状评分。评分方法 采用按照Longa等的神经功能缺损评分法【261，0分:无神经损伤症状;1分:不 能完全伸展对侧前爪;2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发行 走，意识丧失。 3(4运动量测定 为了持续测定大鼠的运动量，我们把每只大鼠放在一个单独的有机玻璃 盒子 中 40x40x40cm ，在脑缺血后第3、7、14、28、42、56天时，采用运动量监 测系统 Anymaze，stoeltingCo(，USA ，将不同组的大鼠依次放入盒子，测定 大鼠15 min内所走过的距离。 3(5脑梗死范围的测定 缺血后第28、56天，以10,水合氯醛 4 mL,kg 腹腔注射麻醉成功后，迅速 开胸暴露心脏，经左心室200ml生理盐水快速冲洗，4,多聚甲醛灌流固定，断 头取脑，随后置入4,多聚甲醛在4oC冰箱内固定24h，30,蔗糖脱水，做冰冻 切片。整个大脑每隔1(5Iillil取一张20 pm的冰冻切片做甲苯胺蓝的染色，染色 J软件计算 结果:正常组织呈蓝色，损伤梗死组织呈白色。拍照后用Image 每一张脑片正常侧 图3(2a 及缺血侧脑半球未缺血区域的面积 图3(2b ，参照Lin 等的方法【271，将两者相减得到校正后的缺血面积 图3(2c 。将每一张脑片校正后 的梗死面积相加，除以每一张脑片正常侧面积的总和，得到梗死面积的百分比。 计算方法如公式所示， iIl胁area, 可YJa-Xb×l。。, 淅?^学硎I??学位论文 实验A, 田3,2脑缺血后大鼠梗死面积示意田 ofinfarctlll'P阻 Fig(3(2Theillustration 3(6恐惧学习记忆的测定瑚??捌 在脑缺血后第28、56天时，对大鼠进行恐惧学习记忆能力的检测。将大鼠放 入训练盒内，经过120s的适应后，给予30s的2800Hz，84dB的声音刺激 条 件刺激 ，在声音刺激的最后2s，同时给予1mA的电流刺激【非条件刺激 ，刺 教结束30 s后将大鼠从训练盘内拿出。在大鼠训练后24小时，分54对每只大鼠进 行背景和线索记忆的测试，按照训练时的顺序，依次将每只大鼠放入训练盒内， 不给任何刺激，观察5rain内恐惧反应出现的百分比。然后，再依次将大鼠放入一 个新的环境 新的盒子 ，适应120s后，给予360s的训练时的声音刺激，但不给 予电流刺激，观察出现恐惧反应的百分比，恐惧反应的百分比是通过计数每5s内 恐惧反应的出现与否而得到的。 3(7水进宫空问学习记忆的测定 为了剥定大鼠的空间学习记忆能力，在脑缺血后第28、56天时，对大鼠采用 水迷宫进行测定‘,6,301(本实验中，采用一个黑色的圆形水池，其直径为150cm， 高度为50cm，在水池周围有不同的可见图案作为标志(水池中水深30cm，水温 为25?1。C，在水中加入黑墨水，使水不透明。 浙江大学硕I:学位论文 实验方法 将大鼠从8个对称的提前设定好的位置放入池中，直到大鼠找到水下的平台， 或者在1min内未找到平台的，用木棒引导到平台上，在平台上待大概10S后， 将大鼠从平台上拿下，放入有台灯烘烤的笼子内。整个实验过程为7天，池中的 象限分布如图3(3所示，前三天为记忆获得阶段，每天训练6次，平台放 在第二象 限，保持不动，放入水下1(5cnl，第四天，去掉平台，对大鼠进行测试，观察大 鼠在第二象限停留的时间，第五、六天进行对位训练，是大鼠重新学习，记忆再 获得的过程，将平台放在第四象限，每天训练6次，第七天移走平台，对大鼠进 行对位测试。所有的实验都通过摄像头录像，并通过电脑辅助图像分析软件进行 FacilitiesCo 分析 ZhenghuaBiologicApparatus Ltd，Huaibei，China ( 厂 , | o 、 , | , 第一象限 第二象限 , 矩象, ?, 图3(3水迷宫内的象限分布示意图 Distributioninthewatermaze Fig(3(3Quadrant 3(8免疫组化 为了观察胶质疤痕的变化，我们采用了GFAP抗体标记星形胶质细胞， 从而进 min，重复3次，然后用 羊血 行观察。首先制作10?m厚的冰冻切片，PBS浸润5 oC孵育过夜， 清封闭2个小时，孵上兔来源的GFAP一抗 1:50，北京中杉 ，4 之后用PBS浸润5min，重复3次，孵上二抗 1:200，辣根酶标记山羊抗兔IgG， ZB(2301，北京中杉 ，PBS浸润5min，重复3次后，即可用DAB显色液显色。 10 浙江火学硕I:学位论文 结果 3(9统计分析 数据均表示为iTlean ofvariance 4-SEM。统计分析是采用one―wayanalysis T3 hoe ANOVA 结合LSD或者Dunnett’Spost test对体重、运动量、梗死面积、 水迷宫进行各组数据间差异的分析，采用非参数检验对神经症状评分、恐惧学习 记忆和胶质疤痕面积进行各组数据间的分析。P 0(05表示有统计学差异。 4结果 4(1组氨酸对脑缺血后大鼠体重的影响 大鼠局灶性脑缺血以后，与假手术组相比，缺血组在各时间点都表现出体重 的显著性下降，给予各种剂量的组氨酸对体重无明显影响 如图4(1所示 。 4(2组氨酸对脑缺血后大鼠运动量的影响 从脑缺血后第3天开始，在相应的时间点测定大鼠在15min内的运动的总距 离。统计学分析显示，脑缺血后第7、14、28、42、56天，脑缺血都导致了大鼠 运动量的增加。His500(500组与缺血组相比较，在第14、42、56天时均显著降低 了运动量;His 1000(1000组与缺血组相比较，在第14天时显著降低了运动量; His 低了运动量 如图4(2所示 。 4(3组氨酸对脑缺血后大鼠神经功能的影响 从脑缺血后第1天开始，在相应的时间点，观察并记录大鼠的神经功能症状。 假手术组没有出现神经功能缺失症状，缺血组则出现了明显的神经功能缺失，表 现为较高的神经功能缺失评分。与缺血组相比较，His1000(500组在第14、28、 42、56天时均显著性地降低了神经功能缺失的症状评分 槲 o(01，如图4(3所示 。 其它各组在相应时间点均无显著性改善作用。 浙江人学硕二I:学位论文 结果 (!-o o-000 E叮c?几U 耍Lu?co?,?? r?IH? oo田_OoD?IH日H廿 oo蚧-ooo广价IH心N蚪 ooo?o001(?IH―历留 09人晒D N葛?刁?乙人?D:人BD皇?D ,人Bp L人四D eJ旦?CI o oo岭 oo寸 oon ooN ooI， 6 6 譬玲蛊螂妊蛙K粤f黾卷担茛镫城爵密蚺礞匿佟娶铽椒糯?匣恃一0匝 Hi口意 叫暑Q量譬_uI矗-盆基盖矗?瓮(I眉兰暑I。参h口。五皇o?分参苗2基弓 葺膏。譬露皇衍?眉昌它爵Q暑它墨?互Jo?芑尝阉一寸(暑笛 (dnoj&暑对 专若一?它2时QIIIoo(Ho(0y艮**(no(0y?*(芝衄?州I 品。吕事0q? ?Dj墨? 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