化妆品儿茶酚胺类物质检测

化妆品儿茶酚胺类物质检测 附件5: 化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的 检测方法 (征求意见稿) 1 适用范围 本方法规定了化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的高效液相色谱/荧光检测器的定量测定方法和液相色谱/串联质谱的定性确证方法。 本方法适用于膏霜类、凝胶类和水剂类化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的测定。 本方法中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检出限为0.02mg/L，定量下限为0.05mg/L;取1g样品时的检出浓度为0.2?g/g，最低定量浓度为0.5?g/g。 2 方法提要 化妆品试样经盐酸水溶液提取，正己烷除脂，低温高速离心后，采用高效液相色谱/荧光检测器定量测定，外标法定量，液相色谱/串联质谱仪定性确证。 3 试剂 除另有说明外，所用试剂均为纯，水为分析实验室用一级水。 3.1 乙腈，色谱纯。 3.2 甲酸，色谱纯。 3.3 正己烷。 3.4 磷酸。 3.5 盐酸。 3.6 磷酸二氢钾。 3.7 氯化钠。 3.8 0.1mol/L盐酸水溶液。 3.9 饱和氯化钠水溶液。 1 3.10 0.05mol/L磷酸盐缓冲液:称取6.8g磷酸二氢钾(3.6)，加900mL水完全溶解后，用磷酸(3.4)调节pH至3.0，用水定容至1L，过滤后备用。 3.11 标准溶液 3.11.1 肾上腺素(Epinephrine，C9H13NO3，CAS:51-43-4)，去甲肾上腺素(Norepinephrine，C8H11NO3，CAS:51-41-2)，异丙肾上腺素(Isoproterenol，C11H17NO3，CAS:7683-59-2)，纯度大于98.0%。 3.11.2 标准储备溶液(?,1000mg/L):称取肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素0.05g(精确到0.0001g)于小烧杯中，分别用0.1mol/L盐酸水溶液(3.8)超声溶解后转移至50mL容量瓶中，0.1mol/L盐酸水溶液(3.8)定容至刻度，配制成浓度为1000mg/L的标准储备液，4?冰箱保存。 3.11.3 混合标准储备溶液(?,10mg/L):分别量取1.00mL肾上腺素、 去甲肾上腺素、异丙肾上腺素标准储备溶液(3.11.2)至100mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸水溶液(3.8)定容，配制成10mg/L的混合标准储备溶液，4?冰箱保存。 3.11.4 系列浓度标准工作溶液:用0.1mol/L盐酸水溶液(3.8)稀释混合标准储备溶液，精密配制质量浓度为0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、5.00mg/L、10.0mg/L的系列浓度标准工作溶液。 4 仪器和设备 4.1 高效液相色谱仪，配荧光检测器。 4.2 液相色谱/串联质谱仪，配电喷雾离子源(ESI)。 4.3 分析天平，感量0.001g、0.0001g。 4.4 离心机，转速不低于12000r/min。 4.5 超声波清洗器。 4.6 涡旋混合器。 4.7 pH计，测量精度?0.02。 5 测定步骤 5.1 试样的制备 称取化妆品试样1g(精确至0.001g)于25mL具塞比色管中，加入饱和氯化钠水溶液(3.9)2mL，涡旋1min后加入0.1mol/L盐酸水溶液(3.8)定容至10.0mL，剧烈 2 振荡，涡旋1min，加入正己烷(3.3)4mL，涡旋1min，超声10min，转移至离心管中，12000r/min 4?离心10min，取水层经0.45?m微孔滤膜过滤，滤液作为待测液备用。 5.2 测定 5.2.1 液相色谱参考条件 色谱柱:SCX柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5?m，或性能相当者; 流动相:乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲液(3.10)=(5+95); 流速:1.0mL/min; 进样量:50?L; 荧光检测器激发波长:280nm，发射波长:321nm。 5.2.2 标准工作曲线的制备 在设定色谱条件下，分别取系列浓度标准工作溶液(3.11.4)，按浓度从低到高依次经高效液相色谱仪测定，荧光检测器检测，以标准工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。 5.2.3 色谱分析 采用外标标准曲线法定量测定。使用试样(5.1)分别进样，以保留时间定性，获得目标峰面积。根据标准工作曲线计算被测试样中的含量，待测物的响应值均应在线性范围内。采用液相色谱/串联质谱法对阳性样品进行确认。 5.3 阳性结果确证 测定过程中若有阳性结果，可采用液相色谱/串联质谱法进一步确证。 5.3.1 液相色谱参考条件 色谱柱:C18色谱柱，150mm×2.1mm(i.d.)，3.5?m，或性能相当者; 流动相:乙腈+0.1%甲酸水溶液=(2+98); 流速:0.2mL/min; 进样量:20?L。 5.3.2 质谱参考条件 离子源:电喷雾离子源(ESI); 扫描方式:正离子扫描; 监测方式:多反应监测(MRM); 干燥气:氮气，温度350?，流速10L/min; 雾化器:氮气，压力40psi; 3 毛细管电压:4 000V; 定性离子对、定量离子对、保留时间及碰撞能量见1: 表1 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的保留时间和质谱参数 化合物 去甲肾上腺素 肾上腺素 异丙肾上腺素 5.3.3 定性测定 每种被测组分选择1个母离子，2个子离子，在相同试验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在?2.5%之内;且试样中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，可判定为试样中含有对应的待测物。 表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对丰度(k) k ?50% 50%> k ? 20% 20%> k ? 10% k ? 10% 6 平行试验 按以上步骤，对同一样品进行平行试验测定。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 7 结果计算 试样中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的含量按下式计算获得: D???Vw? m式中:w— 试样中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的质量分数，μg/g; 允许偏差(%) ?20 ?25 ?30 ?50 保留时间(min) 2.2 2.6 6.7 母离子 170.2 184.2 212.2 碎裂电压 (V) 50 50 60 子离子 152.2 107.2 166.2 107.2 194.2 152.2 碰撞能量 (eV) 0 20 4 20 5 15 ? — 从标准曲线上计算得到的测定液中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的质量浓度，mg/L; V — 试样定容体积，mL; 4 m — 试样的量，g; D — 稀释倍数(不稀释则为1)。 8 回收率和精密度 经多家实验室验证，肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的加标回收率在85.0%,110.4%之间，相对标准偏差小于6.5%。 9 色谱图和质谱图 图1 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素标准溶液的参考液相色谱图 去甲肾上腺素 170.2?152.2 肾上腺素 184.2?166.2 异丙肾上腺素 212.2?194.2 图2 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素标准溶液LC-MS/MS多反应监测质量色 谱图 5 化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检 测方法起草说明 为进一步完善化妆品中禁用和限用物质检测方法标准体系，加强化妆品中禁用和限用物质的监督管理，国家食品药品监督管理局于2012年3月委托北京市海淀区产品质量监督检验所(国家化妆品质量监督检验中心(北京))开展化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素检测方法的建立和验证工作，现就起草工作有关情况说明如下: 1 起草的必要性 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素被统称为儿茶酚胺类物质，它们都是由酪氨酸衍生而来的系列物。其中，肾上腺素和去甲肾上腺素是人体内天然存在的，异丙肾上腺素是一种人工合成的拟肾上腺素药物。儿茶酚胺同时兼有α和β肾上腺素能活性，主要作用是兴奋血管，使血管收缩，特别是小动脉和小静脉收缩，表现在皮肤和黏膜比较明显;同时能使心脏兴奋，心肌收缩力加强，心率加快。化妆品中添加一种或几种这类物质，能促进毛发生长，防止皮肤老化，有除皱、增加皮肤弹性、抑制皮脂腺过多分泌等作用。但长期不规范使用会影响中枢神经系统和心肾等主要脏器的血液循环，出现各系统缺血症状和功能损害。欧盟化妆品条例1223/2009/EC和我国《化妆品卫生规范》(2007版)中明确规定，化妆品中禁止使用肾上腺素、异丙肾上腺素和去甲肾上腺素及其盐类。 目前对肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素的检测多限于对药物和组织提取液的分析，采用的方法多是液相色谱串联紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器或质谱检测器进行检测，其中对三种物质的同时检测少见报道。目前尚无化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素检测的标准方法，远不能满足实际监管的需要。因此，建立化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素的检测方法，对维护消费者的健康和权益，为政府部门加强化妆品质量监管提供技术支撑具有重要意义。 6 2 起草依据及文献 (1)《化妆品卫生规范》2007年版 (2)国食药监许[2010]455号附件《化妆品中禁用物质和限用物质检 测方法验证技术规范》 (3)The Cosmetic Directive of Council European Communities，76/768/EEC (4)Regulation (EC) No 1223/2009 of the European Parliament and of the Council on cosmetic products (5)《中国药典》2010版，第二部 (6)吕春平，王宏芳，金明华等(化妆品中肾上腺素的含量测定(中国卫生检验杂志，2007，17(10):1813-1814 (7)吴延晖，许泓，肖亚兵等(高效液相色谱法检测化妆品中儿茶酚胺类药物的残留量(日用化学工业，2009，39(6):439-441 3 起草原则 本检测方法兼具先进性、准确性以及可操作性强的特点，采用目前实验室普遍具备的分析技术，选择适宜、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测方法的准确性和重现性。 4 起草过程 国家食品药品监督管理局于2012年3月委托北京市海淀区产品质量监督检验所开展化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素检测方法的建立工作。在充分收集、认真研究国内外相关文献资料的基础上，进行了大量的实验研究，2012年7月基本完成了该方法的研究和建立工作。邀请中国检验检疫科学研究院、北京市产品质量监督检验所、广州市质量监督检测研究院3家实验室进行方法验证工作，验证过程中与三家实验室就方法的适用范围、原理、试剂材料、仪器设备、测定步骤等进行沟 通，并交接了验证技术资料、验证用标准品和样品。9月底对三家实验室方法验证材料进行和分析，起草了检测方法和编制说明，并报送国家食品药品监督管理局。根据项目审定会专家意见，对材料进一步补充完善，最终形成了《化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检测方法》研究。 7 5 重点说明的问题 (1)关于体例。本检测方法的体例主要参照现行2007版《化妆品卫生规范》的卫生化学检验方法和国家食品药品监督管理局已发布的化妆品禁限用物质检测方法的体例，便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作。 (2)关于3种禁用物质。肾上腺素(Epinephrine，CAS 51-43-4)，去甲肾上腺素(Norepinephrine，CAS 51-41-2)，异丙肾上腺素(Isoproterenol，CAS 7683-59-2)，均为化妆品中禁用成分。 (3)关于检测方法的建立。经过对化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素前处理方法的选择，分析条件的优化，最终采用高效液相色谱分离，荧光检测器检测建立了含量测定方法，并采用液相色谱/串联质谱的方法对阳性样品进行定性确证。三家实验室验证结果表明，方法回收率、精密度、线性范围均符合要求，证实所建立方法可以作为化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检测方法。 8 化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检 测方法编制说明 1 任务来源 受国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司委托，根据食药监保化函 [2012]71号《关于委托组织开展化妆品中肾上腺素等禁用物质或限用物质检测方法标准研究的函》和《化妆品中肾上腺素等禁用物质或限用物质检测方法标准研究》项目委托协议书的要求，开展化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检测方法研究，建立化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素快速、准确、灵敏的色谱检测方法。 2 研究背景 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素均属于儿茶酚胺类物质，它们都是由酪氨酸衍生而来的系列物。其中，肾上腺素和去甲肾上腺素是人体内天然存在的，异丙肾上腺素是一种人工合成的拟肾上腺素药物。儿茶酚胺同时兼有α和β肾上腺素能活性，主要作用是兴奋血管，使血管收缩，特别是小动脉和小静脉收缩，表现在皮肤和黏膜比较明显;同时能使心脏兴奋，心肌收缩力加强，心率加快。化妆品中添加一种或几种这类物质，能促进毛发生长，防止皮肤老化，有除皱、增加皮肤弹性、抑制皮脂腺过多分泌等作用。但长期不规范使用会影响中枢神经系统和心肾等主要脏器的血液循环，出现各系统缺血症状和功能损害。欧盟化妆品条例1223/2009/EC和我国《化妆品卫生规范》(2007版)中明确规定，化妆品中禁止使用肾上腺素、异丙肾上腺素和去甲肾上腺素及其盐类。 3 研究现状 目前对肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素的检测多限于对药物和组织提取液的分析[1-6]，采用的方法多是液相色谱串联紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器A或质谱检测器进行检测，其中对三种物质的同时检测少见报道。目前化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素检测的文献报道较少[7-8]，尚无标准方法， 9 远不能满足实际监管的需要。因此，建立化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素的检测方法，对维护消费者的健康和权益，为政府部门加强化妆品质量监管提供技术支撑具有重要意义。 本研究建立了化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的高效液相色谱/荧光检测器的定量测定方法和液相色谱/串联质谱的定性确证方法。 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的基本信息见表1。 表1 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的基本信息 名称 肾上腺素 去甲肾上腺 素 异丙肾上腺 素 4 项目完成情况 根据食药监保化函[2012]71号《关于委托组织开展化妆品中肾上腺素等禁用物质或限用物质检测方法标准研究的函》和《化妆品中肾上腺素等 禁用物质或限用物质检测方法标准研究》项目委托协议书的要求，建立了化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检测方法，方法研究充分考虑了方法的灵敏性、准确性和实用性。对测定方法的特异性、线性及线性范围、检出限和定量下限、检出浓度和最低定量浓度、精密度、准确度、回收率和实验样品检测等内容分别进行实验研究。 具体情况如下: (1)建立了膏霜类、凝胶类和水剂类化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检测方法。本方法采用高效液相色谱/荧光检测器进行定量测定，采用液相色谱/串联质谱对阳性样品进行定性确证，本方法中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检出限为0.02mg/L，定量下限为0.05mg/L;取1g样品时的检出浓度为0.2?g/g，最低定量浓度为0.5?g/g，满足分析检测要求。 (2)本方法由北京市海淀区产品质量监督检验所研究并起草，参与验证的单位有中国检验检疫科学研究院、北京市产品质量监督检验所、广州市质量监督检测研 10 英文 epinephrine CAS号 51-43-4 分子式 分子量 C9H13NO3 183.21 结构式 norepinephrine 51-41-2 C8H11NO3 169.18 isoproterenol 7683-59-2 C11H17NO3 211.26 究院。本方法主要起草人为郭启雷、曹红、刘艳琴、杨红梅、王浩，参加起草人为史海良、赵丽、潘红艳。验证结果满足《化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范》相关要求。 5 方法概述 5.1 仪器 Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Agilent 6410A三重四极杆串联质谱(美国Agilent公司);Milli-Q超纯水发生器(美国Milli-Q公司);涡旋混合器GL-88B(其林贝尔仪器制造有限公司);Anke GL-16G-II 离心机(上海安亭科学仪器厂)。 5.2 试剂 肾上腺素(Epinephrine，C9H13NO3，CAS:51-43-4)，去甲肾上腺素(Norepinephrine，C8H11NO3，CAS:51-41-2)，异丙肾上腺素(Isoproterenol，C11H17NO3，CAS:7683-59-2)，纯度大于98.0%。乙腈、甲酸为色谱纯，正己烷、磷酸、盐酸、磷酸二氢钾、氯化钠为分析纯。 5.3 方法 5.3.1 色谱条件 色谱柱:SCX柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5?m，或性能相当者; 流动相:乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲液(3.10)=(5+95); 流速:1.0mL/min; 进样量:50?L; 荧光检测器激发波长:280nm，发射波长:321nm。 5.3.2 液相色谱/串联质谱条件 5.3.2.1 液相色谱参考条件 色谱柱:C18色谱柱，2.1×150mm，3.5?m，或性能相当者; 流动相:乙腈+0.1%甲酸水溶液=(2+98); 流速:0.2mL/min; 进样量:20?L。 5.3.2.2 质谱参考条件 离子源:电喷雾离子源(ESI); 11 扫描方式:正离子扫描; 监测方式:多反应监测(MRM); 干燥气:氮气，温度350?，流速10L/min; 雾化器:氮气，压力40psi; 毛细管电压:4000V; 定性离子对、定量离子对、保留时间及碰撞能量见表2: 表2 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的保留时间和质谱参数 化合物 去甲肾上腺素 肾上腺素 异丙肾上腺素 保留时间 (min) 2.2 2.6 6.7 母离子 170.2 184.2 212.2 碎裂电压 (V) 50 50 60 子离子 152.2 107.2 166.2 107.2 194.2 152.2 碰撞能量 (eV) 0 20 4 20 5 15 5.3.3 校准曲线的制备 标准溶液(? =1000mg/L):称取肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素0.05g(精确到0.0001g)于小烧杯中，分别用0.1mol/L盐酸水溶液超 声溶解后转移至50mL容量瓶中，0.1mol/L盐酸水溶液定容至刻度，配制成浓度为1000mg/L的标准储备液，4?冰箱保存。 混合标准溶液(? =10mg/L):分别量取1.00mL肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素标准溶液(? =1000mg/L)至100mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸水溶液定容，配制成10mg/L的混合标准储备溶液，4?冰箱保存。 标准系列:用0.1mol/L盐酸水溶液稀释混合标准溶液，精密配制质量浓度为0.05mg/L，0.10mg/L，0.50mg/L，1.00mg/L，2.00mg/L，5.00mg/L，10.0mg/L的系列浓度标准工作溶液。 校准曲线的绘制:在设定色谱条件下，分别取50?L进行HPLC分析，并根据标准系列质量浓度和峰面积绘制校准曲线。图1为肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素标准溶液的色谱图。 12 图1 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素标准溶液的参考液相色谱图 5.3.4 样品预处理 称取化妆品试样1g(精确至0.001g)于25mL具塞比色管中，加入饱和氯化钠水 溶液2mL，涡旋1min后加入0.1mol/L盐酸水溶液定容至10.0mL，剧烈振荡，涡旋1min，加入正己烷4mL，涡旋1min，超声10min，转移至离心管中，12000r/min 4?离心10min，取水层经0.45?m微孔滤膜过滤，滤液作为待测液备用。 5.3.5 计算 根据峰面积，于校准曲线得出组分的质量浓度，样品中的含量应在此浓度上乘 稀释倍数。 6 方法研究 6.1液相色谱条件的建立 6.1.1荧光检测器的参数选择 通过对肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素进行激发光谱扫描和发射光谱 扫描，确定荧光检测器的最优条件为激发波长280nm，发射波长321nm(如图2、图3所示)。 13 图2 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素激发波长的选择 图3 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素发射波长的选择 6.1.2 流动相组成及色谱柱的选择 肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素均属于儿茶酚胺类化合物，分子极性较大，在反相色谱柱上的保留较弱。有文献报道采用甲醇+0.02 mol/L KH2PO4溶液=(4+96)为流动相在C18色谱柱上进行色谱分离(日用化学工业，2009，39(6):439-441)，研究发现该色谱条件可以对水溶液配制的三种化合物的混合标准溶液进行有效分离，但在化妆品实际样品的测定中发现，肾上腺素和去甲肾上腺素容易受到样品基质的干扰，而且该流动相有机相的比例已经非常小，通过改变流动相比例来改善分离的可能性很小(如图4所示)。 14 丙肾上腺素具有较好的保留效果，图5,图7显示了流动相中缓冲液pH值、浓度以及有机相比例对色谱分离的影响。 15 图5 图6 缓冲液浓度对色谱分离的影响(从上到下磷酸二氢钾的浓度分别为0.06mol/L、 0.05mol/L、0.04mol/L、0.03mol/L) 16 图7 色谱柱:SCX柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5?m，或性能相当者; 流动相:乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH3.0)=(5+95); 流速:1.0mL/min; 进样量:50?L; 荧光检测器激发波长:280nm，发射波长:321nm; 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH3.0):称取6.8g磷酸二氢钾，加900mL水完全溶解后，用磷酸调节pH至3.0，用水定容至1L，过滤后备用。 标准溶液的参考色谱图见图8。 图8 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的参考色谱图 6.2 液相色谱/串联质谱条件的优化 由于化妆品的样品基质非常复杂，而荧光检测器的定性能力很弱，仅能通过保 17 留时间定性，有必要增加定性确证的手段。本方法采用液相色谱/串联质谱对阳性样品进行定性确证。 6.2.1 质谱参数优化 肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素属于儿茶酚胺类化合物，肾上腺素、异丙肾上腺素为仲胺类，去甲肾上腺素为伯胺类，因此选用电喷雾离子源在正模式下检测，具有较高的响应。由于质谱检测器只与挥发性缓冲液系统相匹配，因此，选用乙腈-0.1%甲酸水系统为流动相。在全扫描模式(MS scan)下获得化合物的分子离子峰;在选择离子模式(SIM)下选择监测分子离子峰以优化Fragmentor值;以分子离子峰为母离子，以子离子扫描模式(product ion scan)进行二级质谱扫描，得到碎片离子信息，同时优化碰撞能量，选择一对子离子建立多反应监测(MRM)的质谱方法。肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素在不同碰撞能量下的二级质谱图叠加见图9,11。 图9 肾上腺素的二级质谱图 18 图10 去甲肾上腺素的二级质谱图 图11 异丙肾上腺素二级质谱图 6.2.2 定性测定 每种被测组分选择1个母离子，2个子离子，在相同试验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在?2.5%之内;且试样中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，可判定为试样中含有对应的待测物。 表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对丰度(k) k ?50% 50%> k ? 20% 20%> k ? 10% k ? 10% 允许偏差(%) ?20 ?25 ?30 ?50 19 去甲肾上腺素 170.2? 152.2 肾上腺素 184.2? 166.2 异丙肾上腺素 212.2? 194.2 图12 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素标准溶液LC-MS/MS多反应监测质量色 谱图 6.3 前处理条件的选择与优化 由于肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的极性较大，在色谱柱上保留较弱，若以甲醇溶解标样或处理实际样品，则三种目标化合物在色谱上的分离效果非常差。为了实现与色谱柱及流动相的匹配，样品提取液应为水相。本方法采用添加两倍量的饱和氯化钠溶液后加入0.1mol/L的盐酸水溶液提取。水剂类化妆品的提取较为简单，加入0.1mol/L的盐酸水溶液后，涡旋混匀，即可过滤，少数样品需要经过离心。凝胶类化妆品经0.1mol/L的盐酸水溶液涡旋后，需超声提取，提取液离心取上清液过滤。膏霜类化妆品的基质比较复杂，采用饱和氯化钠溶液破乳后，加入0.1mol/L 的盐酸提取液，需剧烈振荡，将样品分散，涡旋后经超声提取。由于化妆品基质的复杂性，上述提取液须经正己烷除脂，12000r/min 4?的高速离心10min，吸取其中的酸水层，过滤后经高效液相色谱分析。 6.4 线性及线性范围 6.4.1 溶液标准曲线 将三种禁用物质的对照品配制成1000mg/L的标准储备液，由三种标准储备液配制成10mg/L的混合标准储备液，再用0.1mol/L盐酸水溶液稀释成质量浓度为 0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、5.00mg/L、10.0mg/L的系列浓度标准工作溶液。 20 分别取系列浓度标准工作溶液，按浓度从低到高依次经高效液相色谱仪测定，荧光检测器检测，以标准工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制溶液标准工作曲线。 6.4.2 基质标准曲线 称取空白基质1g置于25mL比色管中，分别加入相应的标准工作溶液，然后按照标准方法进行前处理，得到浓度分别为0.5?g/g、1.0?g/g、5.0?g/g、10.0?g/g、20.0?g/g、50.0?g/g、100?g/g的基质标准溶液。 每种溶液取50?L注入高效液相色谱仪进行测定，以基质标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制基质标准工作曲线。 6.4.3 标准曲线及线性范围 溶液标准曲线、三种空白基质的基质标准工作曲线的回归方程、相关 系数、线性范围见表4,7。 表4 溶液标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围 化合物 肾上腺素 去甲肾上腺素 异丙肾上腺素 表5 爽肤水基质标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围 化合物 肾上腺素 去甲肾上腺素 异丙肾上腺素 表6 美白去皱霜基质标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围 化合物 肾上腺素 去甲肾上腺素 异丙肾上腺素 表7 凝胶基质标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围 化合物 肾上腺素 去甲肾上腺素 异丙肾上腺素 线性方程 A=273.26C+0.06 A=265.78C+0.34 A=248.91C+0.15 相关系数(r) 线性范围(mg/L) 1.0000 0.05,10.0 0.9999 0.05,10.0 0.9999 0.05,10.0 2 线性方程 A=27.21C+0.02 A=26.72C-0.15 A=24.72C-0.27 相关系数(r) 线性范围(?g/g) 1.0000 0.5,100 0.9998 0.5,100 0.9999 0.5,100 2 线性方程 A=27.92C+0.19 A=26.66C+0.65 A=24.43C+0.27 相关系数(r) 线性范围(?g/g) 0.999 6 0.5,100 0.999 3 0.5,100 1.000 0 0.5,100 2 线性方程 A=27.32C-0.39 A=26.21C-0.33 A=24.38C+0.05 21 相关系数(r) 线性范围(?g/g) 0.999 9 0.5,100 1.000 0 0.5,100 1.000 0 0.5,100 2 6.5 仪器的检出限和定量下限 稀释并检测3种禁用物质标准溶液，以信噪比为3:1时三种禁用物质的浓度确定本方法的检出限，以信噪比为10:1时三种禁用物质的浓度确定本方法的定量下限。本方法中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检出限为0.02mg/L，定量下限为0.05mg/L。 6.6 方法的检出浓度和最低定量浓度 向不含3种禁用物质的空白样品中定量添加混合标准工作溶液，按前处理方法处理后测定。以信噪比为3:1时基质中三种禁用物质的浓度确定本方法的检出浓度，以信噪比为10:1时基质中三种禁用物质的浓度确定本方法的最低定量浓度。本方法取1 g样品时肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的检出浓度为0.2?g/g，最低定量浓度为0.5?g/g。 6.7 精密度 6.7.1 日内精密度 对制备的溶剂标准溶液，选择0.05mg/L、5.00mg/L两个浓度，膏霜类、凝胶类、水剂类化妆品基质的基质标准溶液，各选择0.5?g/g、50?g/g两个浓度，分别连续进样6次进行高效液相色谱分析，计算日内精密度，见表 8。 表8 日内精密度RSD(%)(n=6) 溶剂 爽肤水 膏霜 凝胶 浓度 0.05mg/L 5.00mg/L 0.5?g/g 50?g/g 0.5?g/g 50?g/g 0.5?g/g 50?g/g 肾上腺素 1.5 1.0 4.3 1.7 3.3 3.7 4.0 0.8 去甲肾上腺素 异丙肾上腺素 1.2 1.0 1.4 1.6 3.4 2.8 1.7 1.7 4.5 2.5 1.7 2.2 4.7 4.8 1.4 1.1 6.7.2 日间精密度 分别向膏霜类、凝胶类、水剂类化妆品空白基质中加入高低两种浓度的3种禁用物质混合标准工作溶液，按照已确定的前处理方法预处理，经高效液相色谱分析。每日重复上述操作，连续五天，计算日间精密度，见表9。 22 表9 日间精密度RSD(%)(n=5) 溶剂 爽肤水 膏霜 凝胶 6.8 回收率 在本方法条件下，向爽肤水、膏霜类、凝胶类三种不同基质类型的空白化妆品中分别添加高中低三种浓度水平的标准溶液，按照确定的样品前处理方法处理，每个水平平行测定6次，计算加标回收率，结果见表10和表11。 表10 膏霜类化妆品的回收率(%)数据(n=6) 膏霜I(O/W) 膏霜II(W/O) 添加量 (?g/g) 提取回收率 方法回收率 提取回收率 方法回收率 0.5 94.7 101.3 85.5 94.8 去甲 1.0 96.2 102.9 89.2 98.9 肾上腺素 5.0 92.3 98.7 95.4 105.8 0.5 91.8 95.6 86.3 90.0 肾上腺素 1.0 96.2 100.1 90.1 94.0 5.0 90.6 94.3 97.6 101.8 0.5 90.9 91.6 85.9 90.5 异丙 1.0 92.5 93.2 87.3 92.0 肾上腺素 5.0 103.9 104.6 96.7 101.9 物质名称 表11 水剂类和凝胶类化妆品的回收率(%)数据(n=6) 添加量 爽肤水 凝胶 (?g/g) 提取回收率 方法回收率 提取回收率 方法回收率 0.5 99.7 101.0 94.3 99.1 去甲 1.0 101.2 102.5 97.5 102.5 肾上腺素 5.0 101.2 102.5 101.2 106.4 0.5 104.7 105.0 86.2 89.6 肾上腺素 1.0 104.8 105.1 85.3 88.7 5.0 104.0 104.3 102.2 106.3 0.5 98.7 102.2 102.5 104.3 异丙 1.0 98.4 101.9 100.6 102.3 肾上腺素 5.0 100.5 104.1 100.2 101.9 物质名称 浓度 0.05 mg/L 5.00 mg/L 0.5?g/g 50?g/g 0.5?g/g 50?g/g 0.5?g/g 50?g/g 肾上腺素 2.1 1.5 2.4 3.4 3.6 4.0 4.4 3.2 去甲肾上腺素 3.2 2.8 3.6 4.2 4.6 2.9 4.6 4.1 异丙肾上腺素 1.9 3.2 3.9 4.1 3.6 3.8 4.7 3.9 23 6.9 稳定性 6.9.1 日内稳定性 选择0.05mg/L、5.00mg/L两个浓度的溶剂标准溶液，分别在0h、2h、4h、6h、8h进行高效液相色谱分析;对于膏霜类、凝胶类、水剂类化妆品基质的基质标准溶液，各选择0.5?g/g、50?g/g两个浓度，分别在0h、2h、4h、6h、8h进行高效液相色谱分析，计算日内稳定性，见表12。 表12 日内稳定性RSD(%)(n=5) 溶剂 爽肤水 膏霜 凝胶 浓度 0.05 mg/L 5.00 mg/L 0.5?g/g 50?g/g 0.5?g/g 50?g/g 0.5?g/g 50?g/g 肾上腺素 4.3 3.9 4.5 3.7 4.2 4.5 4.5 3.8 去甲肾上腺素 异丙肾上腺素 4.2 4.8 3.6 3.5 4.4 3.8 4.2 4.5 4.6 3.9 3.8 4.2 4.8 4.8 4.2 3.2 6.9.2 日间稳定性 选择0.05mg/L、5.00mg/L两个浓度的溶剂标准溶液;对于膏霜类、凝胶类、水剂类化妆品基质的基质标准溶液，各选择0.5?g/g、50?g/g两个浓度，4?放置，连续五天进行高效液相色谱分析，计算日间稳定性，见表13。 表13 日间稳定性RSD(%)(n=5) 溶剂 爽肤水 膏霜 凝胶 浓度 0.05 mg/L 5.00 mg/L 0.5?g/g 50?g/g 0.5?g/g 50?g/g 0.5?g/g 50?g/g 肾上腺素 4.5 4.2 5.6 4.2 7.2 6.5 5.5 4.7 去甲肾上腺素 4.9 3.8 5.5 4.4 6.3 4.8 6.1 5.1 异丙肾上腺素 4.7 4.2 5.8 4.8 6.2 5.3 6.0 5.0 6.10 实际样品测定 本方法可应用于膏霜类、凝胶类、水剂类等类型的化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素的检测工作中。在实际样品检测中，尚未发现阳性样品。部分实测样品结果见表14。 24 表14 部分实际样品测定结果 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 名称 ××祛斑增白精华液 ××101育发剂(水) ××痘痘清啫喱 ××本草祛痘美白霜 ××晶莹美白净斑修复凝露 ××本草美容祛痘膏 ××清痘润颜修复凝乳 ××美肤啫喱 ××祛痘控油冰露 ××莹白活性育肤水 ××新逆时抗皱日霜 ××淡斑抗皱菁华霜 ××雪肌抗皱嫩 白霜 ××活肤菁华霜 ××活颜嫩白亮肤霜 ××化妆水 ××无痕净肤霜 ××祛痘膏 ××控油保湿收敛水 ××羊胎素美白保湿霜 ××鲜奶霜 ××SOD蜜 ××水蜜桃爽肤水 ××精华素保湿定型啫喱水 ××亮白爽肤水 ××净白爽肤水 ××胶原拉皱眼霜 ××维C活肤保湿收缩水 ××按摩水凝乳 ××防晒美白清热防晒霜 ××莹润美白霜 ××生物智能保湿霜 ××膏 ××水晶美白保湿霜 ××润肤白水份净白平衡露 ××美白柔润嫩肤霜 ××水活Vc保湿营养霜 ××弹力美肌按摩霜 ××膏 ××美白嫩肤霜 肾上腺素 去甲肾上腺素 异丙肾上腺素 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 6.11 液相色谱/串联质谱确证 25 测定过程中如果有阳性样品，可以采用液相色谱/串联质谱(LC-MS/MS)进行进一步的确证。 液相色谱参考条件如下: 色谱柱:C18色谱柱，150mm×2.1mm(i.d.)，3.5?m，或性能相当者; 流动相:乙腈+0.1%甲酸水溶液=(2+98); 流速:0.2mL/min; 进样量:20?L。 质谱参考条件如下: 离子源:电喷雾离子源(ESI); 扫描方式:正离子扫描; 监测方式:多反应监测(MRM); 干燥气:氮气，温度350?，流速10L/min; 雾化器:氮气，压力40psi; 毛细管电压:4000V; 3种禁用物质的定性离子对、定量离子对、保留时间及碰撞能量见表15: 表15 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的保留时间和质谱参数 化合物 去甲肾上腺素 肾上腺素 异丙肾上腺素 保留时间 (min) 2.2 2.6 6.7 母离子 170.2 184.2 212.2 碎裂电压 (V) 50 50 60 子离子 152.2 107.2 166.2 107.2 194.2 152.2 碰撞能量 (eV) 0 20 4 20 5 15 每种被测组分选择1个母离子，2个子离子，在相同试验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在?2.5%之内;且试样中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表16规定的范围，可判定为试样中含有对应的待测物。 表16 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对丰度(k) k ?50% 50%> k ? 20% 20%> k ? 10% k ? 10% 26 允许偏差(%) ?20 ?25 ?30 ?50 图13 去甲肾上腺素MRM图 图14 肾上腺素MRM图 图15 异丙肾上腺素MRM图 27 图16 肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素标准溶液LC-MS/MS多反应监测质量色 谱图 图17 爽肤水基质空白 图18 凝胶基质空白 28 图19 美白去皱霜基质空白 6.12 干扰实验 将肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素标准溶液加入到膏霜类、凝胶类、水剂类化妆品空白基质中，分别按标准方法处理空白基质和加标基质后，进行高效液相色谱分析，如图20,25，结果表明基质成分没有对三种目标化合物的检测造成干扰。 图20 美白去皱霜空白基质 29 图21 美白去皱霜加标基质 图22 凝胶空白基质 图23 凝胶加标基质 30 图24 爽肤水空白基质 图25 爽肤水加标基质 7 验证结果评价 本方法经3家实验室验证，检出限、检出浓度、最低定量浓度、相对标准偏差、加标回收率、回归方程的相关系数等指标符合检测要求，结果见表17-18。 表17 方法验证标准曲线线性范围测定结果 研制单位 验证单位1 肾上腺素 验证单位2 验证单位3 研制单位 验证单位1 去甲肾上腺素 验证单位2 验证单位3 A=273.26C+0.06 A=220.40C-0.31 A=210.49C+0.04 A=399.1C-0.95 A=265.78C+0.34 A=212.96C+0.47 A=202.82C+0.63 A=380.0C-0.93 1.0000 0.05,10 0.99997 0.05,10 0.99989 0.03,10 1 0.02,10 0.9999 0.05,10 0.99996 0.05,10 0.99996 0.03,10 1 0.02,10 31 研制单位 验证单位1 异丙肾上腺素 验证单位2 验证单位3 A=248.91C+0.15 A=198.13C+0.16 A=190.79C+0.18 A=347.1C-0.92 0.9999 0.99988 0.99998 1 0.05,10 0.05,10 0.03,10 0.02,10 表18 方法验证回收率与精密度结果 爽肤水 膏霜 凝胶 物质加标量验证实验室 名称 ?g/g 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 0.5 99.7 1.3 94.7 4.6 94.3 4.5 研制单位 1.0 101.2 3.4 96.2 3.5 97.5 3.2 5.0 101.2 0.7 92.3 2.2 101.2 2.7 0.5 93.7 4.6 87.7 2.3 85.2 3.4 验证单位1 1.0 89.7 2.1 100.0 2.8 86.1 3.6 去甲5.0 97.6 3.7 98.2 1.5 85.8 4.0 肾上0.5 96.6 3.4 92.4 4.5 86.6 4.7 腺素 验证单位2 1.0 102.9 1.2 99.1 3.6 97.1 3.4 5.0 96.7 1.7 100.6 1.7 100.4 1.4 0.5 94.7 2.8 96.0 3.7 95.4 3.4 验证单位3 1.0 92.0 5.0 95.7 2.5 96.3 3.6 5.0 100.6 2.5 97.2 2.9 89.6 2.6 0.5 104.7 2.8 91.8 4.0 86.2 2.7 研制单位 1.0 104.8 4.0 96.2 3.7 85.3 1.6 5.0 104.0 0.6 90.6 1.8 102.2 1.6 0.5 85.3 4.5 90.8 4.3 85.6 4.6 验证单位1 1.0 85.9 4.5 94.5 2.9 85.3 3.4 肾上5.0 92.6 2.7 94.3 3.3 85.5 5.0 腺素 0.5 98.0 4.3 100.2 3.3 85.0 4.0 验证单位2 1.0 99.7 1.8 95.2 2.4 90.7 2.4 5.0 98.0 1.7 98.0 3.7 100.0 0.8 0.5 100.0 6.3 100.1 6.5 88.3 6.5 验证单位3 1.0 102.8 5.0 96.5 4.8 92.1 4.9 5.0 110.4 4.9 95.6 4.9 89.1 4.4 0.5 98.7 0.8 90.9 3.4 102.5 2.6 研制单位 1.0 98.4 3.9 92.5 3.0 100.6 1.7 5.0 100.5 0.8 103.9 1.1 100.2 0.9 0.5 95.7 2.5 85.6 4.3 93.5 3.8 验证单位1 1.0 87.5 4.2 94.1 3.1 94.6 4.3 异丙5.0 97.5 2.1 97.8 2.8 91.8 4.2 肾上0.5 98.1 2.8 94.5 2.5 90.5 5.0 腺素 验证单位2 1.0 98.0 2.7 96.0 3.9 95.3 3.1 5.0 97.2 1.7 100.4 2.2 99.7 1.1 0.5 100.9 2.6 91.7 5.2 85.7 4.2 验证单位3 1.0 95.0 2.2 90.2 3.8 93.3 4.1 5.0 98.1 4.1 88.1 2.8 87.6 4.7 32 8 结论 本研究建立的高效液相色谱法测定化妆品中的去甲肾上腺素、肾上腺 素、异丙肾上腺素的方法特异性强，样品前处理操作简便，回收率高，色 谱峰重现性好，分离速度快，适合化妆品中去甲肾上腺素、肾上腺素、异 丙肾上腺素的定性定量分析。 参考文献 [1] Guan CL, Ouyang J, Li QL, et al. 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