Id基因在心肌营养素促心肌成纤维细胞增殖中的作用3

Id基因在心肌营养素促心肌成纤维细胞增殖中的作用3 作者:周瑞红 李菊香 夏子荣 颜素娟 谭秋波 【摘要】 目的 探讨在高静水压条件下分化抑制因子3(inhibitory of differentiation 3，Id3 )1 (cardiotrophin1，CT1 ) 促心肌成纤维细胞增殖中的作用。方法 3,4代心肌成纤维细胞用于实验，分为对照组( C 组)、CT1反义寡核苷酸组 (ASODN组) 、 正义寡核苷酸组 ( SODN组)、高静水压组( P 组)。利用自制压力培养装置，将各组细胞置于160 mmHg压力下培养8 h。CT1活性通过 Western印迹法分析测定，Id3基因达通过RTPCR方法测定，MTT测定心肌成纤维细胞增殖 。结果 高静水压明显促进心肌成纤维细胞增殖 ，CT1表达上调，Id3 mRNA表达增加;CT1 ASODN干预后能抑制高静水压所致的细胞增殖，CT1表达下调，Id3 mRNA表达减少。结论 Id3 mRNA在心肌成纤维细胞中有明显表达，且与CT1促心肌成纤维细胞增殖密切相关。 【关键词】 心肌营养素1 ;心肌成纤维细胞 ;分化抑制因子3 1 ( CT1 )与高血压心室重塑有一定的关联，在12周龄的自发性高血压大鼠(SHR)的肥厚心室肌中，CT1 mRNA明显升高〔1〕。另有研究发现，内源性或外源性的CT1能刺激成纤维细胞合成DNA及胶原，促进成纤维细胞生长〔2〕 。分化抑制因子(Id)3作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现，其基因由3个外显子和2个内含子组成〔3〕。Id3参与多种细胞生物学过程，包括骨骼肌的分化、血管平滑肌的增殖、胚胎的神经形成、骨和血管发生等〔4,7〕，表明CT1与Id3均存在于成纤维细胞中，且都有促进细胞增殖的作用，但他们之间是否存在某种联系，Id3在心肌成纤维细胞中的表达情况及 CT1促心肌成纤维细胞增殖的作用是否与Id3有关尚未见报道。 1 与方法 1.1 材料 出生1,3 d的SD乳鼠(南昌大学医学院医学实验动物科);RTPCR试剂(Promega，USA);Trizol( Invitrogen，USA);DEPC，二甲基亚砜(DMSO)(Ameresco，USA); DL2000 DNA Ladder Marker (上海生工) ;MTT增殖检测试剂盒(Sigma，USA) 。 1.2 方法 1.2.1 心肌成纤维细胞的原代培养及鉴定 在无菌条件下摘取4,5只大鼠心脏， 分离心室利用蛋白酶消化心 肌组织， 差速贴壁法获得原代心肌成纤维细胞。第 3,4代细胞用于实验。鉴定方法参照 文献 〔9〕。 1.2.2 CT1反义链与正义链的与合成 以硫代磷酸修饰反义和正义寡核苷酸链，由上海生物工程有限公司合成，各自序列为:CT1反义寡核苷酸链(ASODN):5 TGGCTCATGCTGGCCCCAGGCTGAT3; CT1正义寡核苷酸链(ASODN):5ATCAGCCTG′GGGCCAGCATGAGCCA3′。 1.2.3 实验分组及干预措施 ?空白对照组(C) :大气压下培养; ?高静水压组(P) :160 mmHg 压力下培养8 h〔9〕;?CT1反义寡核苷酸组(ASODN组):160 mmHg压力培养下，加入终浓度为10 μmol,L的ASODN;?CT1正义寡核苷酸组(SODN):160 mmHg 压力培养下8 h，加入终浓度为10 μmol,L的SODN。 1.2.4 RTPCR法检测Id3 mRNA 的表达 按照Trizol试剂说明书提取心肌细胞总RNA。参照Promege公司提供的RTPC试剂盒说明书进行逆转录反应， PCR反应共35个循环。引物设计由 Gen Bank中获取目的基因全序列，借助 primer primier 5.0软件设计完成，由上海生工合成，各引物序列(含参照序列?和目的序列?)见下 :?βactin正义5GTAAAGACCTCTATGCCAACA3′;反义5ACTCATCGTACTCCTGCTTG 3′,240 bp。?Id3正义5CATCTCCCGATCCAGACA3′;反义5′TCATAATCAGGGCAACAGAG3′;494 bp。 1.2.5 蛋白表达的检测 Western 印迹法检测细胞裂解液中CT1蛋白表达情况，用 Lab Work 3.0 UVP软件分析条带的积分吸光度值， 相对蛋白含量用积分吸光度值表示。 1.2.6 心肌成纤维细胞增殖检测( MTT法) 在各种条件培养下的96孔板实验结束前4 h ，每孔加入5 g,L的MTT ( 四氮唑盐) 20 μl，实验结束后，弃去各孔中的培养基， 每孔加入DMSD 150 μl，振荡10 min，酶标仪测490 nm吸光度。 1.3 统计学处理 实验数据以x?s表示，应用 SPSS12.0软件。组间比较采用独立样本t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析( ANOVA) ，两组均 数间比较采用 LSD检验。