不同肿瘤坏死因子受体糖基化修饰糖链的初步分析

不同肿瘤坏死因子受体糖基化修饰糖链的初步分析 ,, , ,,年 ,月 第 , 国际药学研究杂志 ,, ，, ,, ,，, , , ,, ,, ,, ,卷 第 ,期 , , , , ( ,, , , , ，, (，,,， ,, , 融合蛋白 , 糖基化 不同肿瘤坏死因子受体; 修饰糖链的初步分析 ， 何椿鹏,,，华 玲,，杨小盼,，万德有,，李萌萌,，王清清,，陈 方,， 董立厚,，高 新,，高 月,，宋海峰, 〔摘要〕 ,, 的 目的 建立基于 , , ,糖基化修饰糖链的分析方法， , , ), 融合蛋白 并比较不同肿瘤坏死因子受体( , , ;,糖基化修饰差异。方法 用肽,糖苷酶 ,释放糖蛋白中的修饰糖链，有机溶剂沉淀蛋白后， 利用还原胺化反应将 ,氨基苯甲酰胺标记至糖链上，并通过亲水作用萃取柱除去过量标记试剂， ， ，， 所得糖链采用 ,,, ,,亲水作用色谱柱结合离子阱质谱 , ,, 融合蛋白为品，进行分析。以市售 , , ; 对 , ,, 融合蛋白制品的 优化影响标记效率的各种因素后， ,和 ,两种 , , ; , ,, 融合蛋白 ,和 ,中的修饰糖链主要含有岩藻糖、,糖基化修饰糖链进行了分析和比较。结果 , , ; 末端唾液酸、末端半乳糖、 末 端 ,乙酰葡糖胺等糖型，且末端唾液酸含量相近， 但融合蛋白 ,的岩藻糖和末端,乙酰基葡萄糖的含量显著高于融 ，合蛋白 , 而融合蛋白 ,末端半乳糖含量高于融合蛋白 , ,, 的 。结论 成功建立了基于 , , ,糖基化修饰糖链的分析方法，该方法可有效分析糖蛋白中的修饰糖链类型和含量比例，对于详细表征糖蛋白药物结构及性质具有参考价值，并为进一步研究糖基化对糖蛋白药物药理活性以 融合蛋白;,糖基化; 肿及药代动力学研究奠定了良好基础。 〔关键词〕 , 瘤坏死因子受体; ,, ;,,, ,, ,氨基苯甲酰胺标记;, , ， ，，;糖型 〔 , , (, , , 中图分类号〕 ,,, ; , 〔文献标志码〕 〔 , ,, , ,, ) ,, ,, , , , 文章编号〕 ,,,, ( ,, , , , ,, , ,,, ,, ,,, ,,, ,, ,,,,, ; ,, , , , , , ,,, , ,, ,,,, , ,,;,,,; ,,;,,; ,, ,, , , , ,, ,,,, :,,,,,,,, , , , ,, ,, , , , , , , ,,,,,,，, ,,,,，, , , ,,，,, ,,,，, , , ,,，,, ,,,, ,， ,, ,,,， , , , , ,,, ,, , ,, , ， ,,, ,, , , , , , ？, , ,,,, , ,, , , , , , ,, , ,, ,, , , , ,,，, , , ,,，, ,,,，, ,, ,，, , , , , , , , , ,,, ,, , , , ,，, ,, ,,, , , , ，,, , , ,, , ,,, ; , ,, , ( ( ,,, , , , , , ,, ,, ,,,, ，, , ; (,,, , , , ,,, , , ， , ,, ,, ;, ;,, , ,, , , ,, , ; ,, ,, ,,, , , ; , , , , , ,,, ,, , ,,,, , , ,, ; ，,, ,,,, ，, , ) , , ,, , 〕 ,, , , ,, ,,, , ,, ,, ;, ,, , ,,,, ,, ，,,;, , , ,,, , ,, , ;, , 〔 ,, ; , , , , ,,,, , , , ,,, ,, , ,, ,, , , , ,, ,,, ;, , , , ,, , , , ,, ,, , ,,, , ,, , , , , , , , , ), , , , , (,, , , , ,,, , , ,, , , , ;, , , ,, , ,, , ,, ; , ; ,, , ,; , , , , ,, ( , , ;, , , , , , ,, ,, , , ,, , , , ,,, , , ,, , , , ,, , , , ; ,, , , , ,, ; ,, , ,,, ,, , , , , ,,, ,, , ,, , , , , ,,, , ,,,;, ,, , ,,, , ,, , ,,, , ,, , , ; ,,,, ,, , ; , , ,, , , ( , , , , , ,, , , , ,, , , , ,, , ,,, ,,,;,, , , , ,,, , , , ,, , ,,, , , , ,, , , , ,,, , , ,,,, ,, ,,, , ,,,, , , ,,, , , ,, ,,, , , ,, ,;,, ,, , , ,, , , , , , ,,, , , ,,, , (,, ,;, ,, , ,,, , , , ,, , , ,,, , , , ,,,,, , ,,,,,, ,, , , ,, , , ,, ,, ,,;, , , , , , , ,, , ,, ,, ;, , , ，, , ,, , ,, , ,,,, ,,;, , ,,, ,,, ,,,, , , , , ,, ,; , , , , ,, ; ,, , ,, ， ，， , , , , , ,, , , , ,, , , ,,, , , (, ,, , , , ,, , ,, ,, , ,, ,, ,, , , , , , , , , , ,, ,,, , ,, , , , ,, , , , , ,,, , ,,, , , , , , , ,, , ,, ;, ,, , , , ,, , ,, ,,,, , ;, , ,, ,,,, , , ; 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, ，, ;,, ,,,, ,,,, , , ,, , , ,, , , , , ,,, , , , , , ,, ,, , , , , , ,, , , , ,, , , ; ，,,, , ,, ;, ,;, , , ,,, , ,, ,,; , , ,, ,,, , , , ( , ,, ,, , , ,, , , , , , ,, , ), , , , , ,,, ,, , ,,,, ,, ;, , , ,, ; , ; , , ,, ,, 〔 , ,,〕 , , ,; , , , , ,, ( , , ;, , , , ;,, ;,,, ;,, , ,,, , ,, , ,, ; , ,, , , ,, , ， ，，;,;,, ,, ; , ,,,, ,, ,;, ,;,,作者简介: 男， 何椿鹏， 硕士研究生，专业:药理学， , ,,,,,, ， ,:,,,,,,, , (, ,, , ,,, ,, , ,;,,,,, ,,, ;, : , , ,,,,作者单位:(,,,南宁，广西医科大学( ;(,,,北京， 何椿鹏) ,,,, 军事医学科学院放射与辐射医学研究所(华 玲，杨小盼，万德有，李萌萌，王清清，陈 方，董立厚，高 新，高 月，宋海峰)通讯作者: 男， 宋海峰， 研究员，研究方向: ,, , ,,, ,, , ,,, 生物技术药物药理学， , ,,,,,, ， ,:,,, , ,, ;, 高 月， 研 , , ,, (, (, ; 女， 研究方向: ,, , ,,, ,, , 究员， : , ,,,,, ,,(, : , ,中药药理学， , ,,,,,, ， ,:,,, ,(;; ,,年 ,月 第 ,国际药学研究杂志 ,, ，, ,, ,，, , , ,, ,, ,, ,卷 第 ,期 , , , , ( ,, , , , ，, (，,,， ,, , ,, 糖蛋白是蛋白质经糖基化修饰形成的具有重要 司; ， ，， ,,, ， ,,, ,,分析柱( ,× , , ,,μ )生物学功能的共价复,,, ， , 合物，糖基化是最常见和最复 , ,,, ,, ; 瑞典 , , , ,, 公司。杂的蛋白质翻译后修饰之一， , 在哺乳动物中有 , , 试剂 ,, , 〔〕以上的蛋白质可能发生糖基化 。蛋白质糖基化 , ,, ,,,, ， 标准品为市售 , , ;融合蛋白 ( ,,,,在许多生命活动过程中发挥重要作用，例如胚胎发 ,,, , 辅料为甘露醇、 , ,支， 三羟甲基氨基甲烷)， , 〔〕 , 〔〕育 、细胞与细胞黏附、信号转导、免疫应答 等。 上海中信国键药业; , ,, 融合蛋白 ,和 , 本 , , ; (其中蛋白质 ,糖基化的详细结构特征的阐明对于 实验室药代动力学研究样品 , ,表达产物) 肽 , ; ,细胞基础研究和有机体生物学研究具有重要意义， ( , ,, ) 美国 , ,, , , ,,, 糖苷酶 , , , ,, ， , , , ,, ,,, , 公同时在药物生产与研发领域的重要性也在不断上 司;二甲基亚砜 ( , , ， , , ,公司; , , ) 美国 , , 氰基硼 , 〔〕 , 〔〕升 。, ,, ,, 等 研究表明， , ,单链抗体上 , ,, 氢化钠( , , , ) ,氨基苯甲酰胺( , ， , , , , 、 ,, ) 天津糖基化修饰糖链中的岩藻糖去除后，抗体依赖性细 希恩思公司;色谱纯乙腈， , , ,;公 , , ; ,, 美国 ,,, ,, ,,胞介 导 的 细 胞 毒 ( , ,,,,,, , ,,, , , ,, ,, ,,,,,,,;,, , , 司;其他试剂均为国产分析纯;实验室用水为 , , ,, ,;,,,, , , 活性显著升高。新近研究还表 , , ;, , , ,，, , ) ,制备纯水。 , 〔〕明 ，末端为甘露糖修饰糖链的抗体药物具有更高 实验方法 ,,的体内清除率，进而影响到药物的体内半衰期。因 糖蛋白中的糖链释放 首先取 , , ; ,,, , ,, 融此， ,糖基化修饰在糖蛋白药物研发中占有越来越 合蛋 白 标 准 品 ,, ,溶 于 ,, μ 水 中， 照 ,, , , 按重要的地位，其糖链结构与药效 及药代间关系探索 , ,,,说明书， , ,, , , 向样品中加入 , μ 变性用 ,,×也具有重要的研究意义。 缓冲液， 于 , ?加热 , ,， 混匀， ,, ,,, 使蛋白充分变 , ,,; , 人可 溶 性 肿 瘤 坏 死 因 子 受 体 (, , ,, , , ,, , ,, 性。然 后 向 上 述 溶 液 中 加 入 , μ , × ,,, , , ,, ， , , 与 人 ， ;段 的 融 合 蛋 白, , , , ,, , ) ;, ; , , , , ( ,,磷酸钠溶液) , μ , , , , ( ,,, ,, 、, , , ,, 壬基酚, , ; , ,, 由两条肽链通过二硫键连接组成，每条肽 聚氧乙烯醚 , 、, , , , ,, ,型) , μ 纯水和 ,μ , , , ,酶，链含有 ,个 ,糖基化位点。, , ;融合蛋白于 , ,, 组成酶切体系。,, ,,年由 , ,批准上市， , 在治疗斑块状银屑病、强 处理好的酶切体系，分别采用两种酶切条件，即直性脊 柱 炎 和 风 湿 性 关 节 炎 等 疾 病 上 有 显 著 疗 , ,,, , ?恒温过夜反应模式和微波炉解冻档加热 , , , 〔〕效 ，是全球最畅销的治疗性蛋白药物之一，并因 模式， , , ,比较两种模式的 ,, , ,此成为生物仿制药领域的关注热点。美国 , ,于 酶切效 然后通过 , 率，选择合适的酶切条件。 ,,年发布的生物仿制药研究指南中，,, 明确了重组 提取回收释放出的糖链 将融合蛋白酶切 ,,,蛋白类生物仿制药物申报应提供基于药物分析、动 后的样品分装为两管，分别加入 ,倍体积预冷的丙 , 〔〕物模型和临床研究的比较性数据 。,糖链作为 ,, 酮和乙醇， , ?冰箱放置 , 。然后以 ,,,×,一种翻译后修饰，对药物结构、活性和药代动力学多 , ,, ,,, 取上清液用真空浓缩离心仪干燥。 离心 , ,，方面均有影响，因此，建立适当的分析方法并将其应 糖链的荧光标记 配制 ,, ,,, ,荧光标记液。用于生物仿制药研究更加必要。 首先称取 , , ,, ， , ,, ,, 的 , 加入 ,,μ , ,的醋酸 本研究旨在建立一种基于 , ,的 ,糖基化 ,, , ,溶液， , , 震荡使其完全溶解。然后将上述溶液 并修饰糖 链 的 分 析 方 法， 应 用 该 方 法 分 析 不 同 , , ,, , , ,中， ,,μ 加到 , ,, , ,, 涡旋震荡至完全溶, , ; , ,, 融合蛋白 ,糖基化修饰的差异，从而为详 ,, 解。配制好的标记液应避光保存， 内使用。细表征糖蛋白药物的结构和性质以及进一步的药代 取融合蛋白释放并经纯化的糖链样品，直鸺佣 ρа芯刻峁?恢钟行У姆治龇椒ā?,, , , ,标记液进行标记， 入 , 、,和 , μ ,, 在标记过 程中如有不溶微粒，可以 , ?加热震荡 ,,, 使其 , ,，, 与方法 全部溶解。将加入标记液的样品放入恒温混匀仪,, 仪器 , ?震荡， 中，, 反应 ,,。 ,, ,,型高效液相色谱仪， , 美国 , ,, 公司; ,,, 线 去除过量标记试剂 由于过量的标记试剂 ,,, ,， ,, 公司;, , , , .