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亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中MnSOD上调机制的研究

2017-09-25 42页 doc 71KB 24阅读

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亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中MnSOD上调机制的研究亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中MnSOD上调机制的研究 亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中MnSOD上调机制的研 究 学校代码: 学 号: 博士学位论文 亚硒酸钠诱导细胞凋亡过程中上调机制 的研究 : 所 院 基础医学研究所 : 姓 名 李竹石 指导教师: 许彩民 学科专业: 生物化学与分子生物学 研究方向: 细胞凋亡与信号转导 完成日期: 年月北京协和医学院博研究生论文 目 录 中文摘要?.??.??...?...英文摘要??.??..?..? . . 前 一 一 . . 材料 一 ...
亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中MnSOD上调机制的研究
亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中MnSOD上调机制的研究 亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中MnSOD上调机制的研 究 学校代码: 学 号: 博士学位 亚硒酸钠诱导细胞凋亡过程中上调机制 的研究 : 所 院 基础医学研究所 : 姓 名 李竹石 指导教师: 许彩民 学科专业: 生物化学与分子生物学 研究方向: 细胞凋亡与信号转导 完成日期: 年月北京协和医学院博研究生论文 目 录 中文摘要?.??.??...?...英文摘要??.??..?..? . . 前 一 一 . . 材料 一 . . . . 言方验验 掩 勰 验 果 ,仑 实 一 . . 蕊 二 . . 钙 三 . . 舛 . . 四 够 和实实结第第第第 法材方与部部部部 料法讨分分分分 ..... ..... ..... ..... .... .... .... .... 啪仃, 仃凋亡通路。为了详细阐明细胞在亚硒酸 钠诱导凋亡的过程中发生的分子生物学变化,我们仍然需要进行更深入的探 索。 本研究在前期工作的基础上,进一步探讨了在亚硒酸钠诱导细胞凋亡过程 中,一些受到活性氧调节的重要分子的变化情况、调节通路及其对凋亡的意 义,重 点对关键抗氧化酶 进行了研究。经 发现,亚硒酸钠在诱导细胞凋亡的同时引起了的显著上调,活性 氧清除剂完全阻断该上调效应,提示活性氧是其上游调控因素。经不同 活性氧探针检测发现,亚硒酸钠作用后诱导两种细胞内活性氧超氧自由基 与过氧化氢 迅速而显著的升高,其中超氧自由 基可能对于的上调起主要作用。就具体通路而言,蛋白激酶 ? 与转录因子是活性氧介导上调 的关键因素。测序结果证明本研究使用的细胞表达野生型的。经 检测核蛋白提取物和免疫荧光染色发现,亚硒酸钠诱导细胞产生活性氧 后,活性氧促使砌从胞质转位至核内,磷酸化的关键位点。免疫共 沉淀结果显示,在核内通过直接作用的方式磷酸化。采用该还发现, 在未经亚硒酸钠作用的细胞的核内,与其抑制性蛋白 处于结合状态,而经亚硒酸钠处理后,核内被?磷酸化,从而与 解离而被激活。采取选择性抑制剂恤..抑制其转录活性,或 通过干扰降低其表达,均能显著抑制亚硒酸钠诱导的上调,提示 作为的上游转录因子诱导了其表达。对于缺失或突变的白血病细 胞株.或,亚硒酸钠不能诱导上调,进一步证明了的重要 作用。通过上述研究阐明了亚硒酸钠诱导细胞凋亡过程中,细胞内存在一条 北京协和医学院博:研究生论文 ..信号通路,该通路可能是细胞在面临氧化应激时启动 的重要抗氧化机制。 前期研究已经发现,在未经亚硒酸钠处理的细胞中存在活跃的自噬作用, 亚硒酸钠处理后,在诱导凋亡的同时伴有自噬的减弱。本研究在此基础上进 行了进 一步探讨,发现的激活除了诱导上调,还是亚硒酸钠促进细胞由 自噬转向凋亡的关键因素。 和免疫共沉淀结果显示,亚硒酸钠通过蛋白 激酶水和引起关键位点的磷酸化,进而导致与其抑制 性蛋白解离并被激活。借助免疫荧光染色与免疫共沉淀发现,在此过程中 核仁蛋白从核仁转位至核质,与共定位并发生相互作用,从而起到稳 定的作用。采用抑制剂抑制其活性或通过干扰降低其表达, 均能显著逆转亚硒酸钠诱导的凋亡、激活以及自噬标志分子.和 .的表达下调,表明激活后的一方面促进凋亡的进行,另一方面抑制自噬, 从而在细胞由自噬转向凋亡的过程中扮演关键角色。 本研究还发现,在亚硒酸钠诱导细胞凋亡后期,蛋白激酶 在蛋白水平与磷酸化水平均显著下调,其下调同样由活性氧所介导。 采用抑制剂与干扰发现,在细胞中发挥抗凋亡作 用,并且该作用建立在其对蛋白激酶水与心调节的基础之上,活性氧探针检 测发现,还具有抑制活性氧产生的作用。此外,活性氧还激活了蛋白水解 酶.,诱导磷酸酶的表达,在凋亡后期,活性氧通过.与 分别在蛋白水平与磷酸化水平下调,从而加速了凋亡的进行。因此,下调 抗凋亡激酶可能是亚硒酸钠在凋亡后期维持并促进凋亡的重要机制之一。?, 是线粒体呼 细胞色素氧化酶亚基” 吸链的重要组分,在亚硒酸钠诱导细胞凋亡后期,该蛋白同样受到活性氧的 显 著下调,.显示其?水平没有明显变化,提示非转录机制参与其下调。 的下调。采用表 进一步研究发现,活性氧通过激活.介导 达载体抑制?的表达,能够显著增强亚硒酸钠诱导的细胞凋亡,表明亚 硒酸钠可能通过...?这一途径损伤线粒体呼吸链,加速凋亡的 进行。 关键词:亚硒酸钠;凋亡;;活性氧;;自噬;; 北京协和医学院博研究生论义仃 澌 ? 啪 .唱, ,, ,. .吼 ,,啪 嘶舶 啪” ,、锄.献 , ,甜啪 .、, 向 . 向 , ,嬲 砌. 印.、培. ?印 , 讹锄. 、, , , . .、? .劬 淅? .色 舭, 怼“ 舶,锄 巧 . , . 巧 .仃【 ? 北京协和医学院博:研究生论文 “ 锄 ,诵 嬲 ..,一 锄 ,缸 , . 仃 ??一砌 眦 . 锄咖 . . ,缸恤印 . ?. , 巧 .谢 ? 仃丘 , 诵 , . ? , , , 诵 印 , .甜 ? ., , ? 出 彘,/ . 虢曲 . 【 , 巧、 眦. 眦蚰, 眦印 觚,. ? ? , ?一一 ,印. :啪;;;;;; 北京协和医学院博:研究生论文 ..,?.??一 刖舌 白血病是严重威胁人类健康的血液系统恶性肿瘤,硒是具有抗癌作用的人体必 需微量元素,在本实验室的前期研究中已经发现含硒化合物亚硒酸钠能够诱导白血 病细胞株发生显著凋亡,并且对其机制进行了一定程度的研究。种种证据表明, 亚硒酸钠诱导细胞凋亡是个非常复杂的过程,多种促凋亡及抗凋亡因素参与其 中。 .硒是一种具有抗肿瘤作用的微量元素 硒是人体必需的微量元素,具有重要的生理功能。硒以硒代半胱氨酸的形式存 在于细胞内谷胱甘肽过氧化物酶砒 ,、硫氧还蛋白还原酶 等含硒蛋白中,参与多种重要的生物学过程【 。 和? 锄唱于年首先发现硒具有抗癌作用【】。此后,随着相关流 行病学调查和实验研究逐渐开展,人们对其抗癌机制的关注程度同渐提高,探讨逐 步深入,硒元素对肿瘤的作用机理已成为目前肿瘤化学防治研究中的热点领域。 大量研究表明,硒的介入治疗能降低癌症的发生率和死亡率,对肝癌、前列腺 癌、肺癌、结直肠癌的作用尤其明显【。年埃及科学家将亚硒酸钠用于非何 杰金淋巴瘤的临床治疗,取得了良好的效果‘卯。深入研究发现,硒化合物能够诱导 多种肿瘤细胞发生凋亡,以前列腺癌和白血病的研究最为广泛和深入,硒诱导凋亡 的程度与有效剂量随硒化合物形式和细胞类型的不同而有所区别。不同硒化合物在 诱导凋亡的同时,改变了肿瘤细胞内不同因子的含量或活性,包括细胞周期相关蛋 ,线粒 白、///、//、//、、//等‘ 体相关因子.、【、、、、等【‘,蛋白激酶、.、 /、、州等【之,转录因子.、.等【,。虽然硒对上 述因子的调节可以在一定程度上解释硒诱导的凋亡,但对其具体通路及其复杂调控 网络的了解远未达到透彻的程度,还需进一步研究。 .白血病及其治疗手段概述 白血病是一种常见的血液系统恶性肿瘤,是骨髓及其他部位造血细胞中原始细 胞和幼稚细胞异常增生的恶性疾病,表现为正常血细胞生成减少,周围血白细胞发 生质和量的异常,白细胞及其幼稚细胞在骨髓或其它造血组织中进行性、失控地异 常增生,浸润并损害各种组织,产生不同症状。白血病严重危害人类健康,在我国北京协和医学院博:研究生论文 年发病率为./万人口,多发于青少年,是岁以下发病率、死亡率最高 的恶性肿瘤之一。根据癌化细胞的种类,白血病大致被分为髓系白血病和淋巴系白 血病两大类型,急性早幼粒细胞白血病属于急性髓系白血病 钆八种亚型中的亚型,发病率约占急性髓系白血病的~%【,引。 其显著的生物学特征是在粒系细胞发育过程中,细胞分化被阻滞在早幼粒阶段并异 常增生。约%的病人具有特征性的“;染色体易位,使号染色体的 基因与号染色体的维甲酸受体 ,基因相连, 细胞表达.&幔融合蛋白。该融合蛋白具有不同于正常蛋白的功能, 从而引起决定细胞分化的转录调控发生改变,阻断粒细胞的分化成熟,导致 的发生【,。 白血病细胞具有分化受阻、增殖失控、凋亡异常等肿瘤细胞的基本特征,通过 诱导分化和促进凋亡来控制白血病细胞的增殖是当前白血病治疗研究中的热点。 年, 等首次发现全反式维甲酸..锄 ,能够诱 导急性髓系白血病细胞分化【。年,被引入临床,通过诱导肿瘤细胞分 化治疗,极大地提高了的治愈率。但治疗普遍存在耐药现象,并 且具有一定的毒性,有可能引发维甲酸综合征,表现为发热、体重增加、呼吸受阻、 渗出性肺炎、渗出性胸膜炎及心包膜炎、低血压、急性肾功能衰退等【.】。针对这一 情况,我国学者从世纪年代末开始应用三氧化二砷仃,治疗 ,进一步提高了的缓解率,并且在一定程度上解决了限耐药患者后续 治疗的问。研究发现,经治疗后,具有乙~耐药性的缓解率高达 %。但同时还是一种剧毒性药物,即俗称的砒霜,具有很大的毒副作用, 由于个体耐药性的差异,在剂量的把握上有一定难度,在治疗上有一定的危险性, 而且即使在安全剂量范围内长期用药,慢性中毒也是一个不容忽视的问题。鉴于 治疗中存在的问题和不足,寻找针对的更安全更有效的药物具有非常重 要的意义。 .细胞凋亡概述 ,是指在一定 细胞凋亡又称为型程序性细胞死亡, 瑚 的生理或病理情况下,机体通过基因调控使细胞自发性主动死亡的过程。凋亡对于 发育、内环境稳态的维持以及损伤细胞的清除非常重要,并且与肿瘤的发生发展密 切相关,肿瘤的发生即是由于细胞增殖与凋亡调控信号失衡,细胞增殖速度超过细 北京协和医学院博研究生论文 胞凋亡导致的消亡速度。目前发现细胞内主要存在三种凋亡信号通路,即经典的死 亡受体通路外源性途径、线粒体通路内源性途径,以及近年发现的内质网应激凋 亡通路。 死亡受体通路起始于膜死亡受体、.、、/与其相应配体 、、.、结合,继而募集接头蛋白或与 , ./酶原,形成死亡诱导信号复合物 ,激活蛋白水解酶./,并且进一步激活下游的.、、等 效应,引起切割与细胞凋亡。活化的./还能切割一家 族成员,后者的切割片段转移至线粒体,参与凋亡的线粒体通路【】。 线粒体通路则由一系列因素引起线粒体膜的损伤,使其通透性增大,导致”、 墟/、/、与等线粒体蛋白释放进入胞质。其中 在胞质与一起激活.,.进一步激活.、、,诱导 凋亡。而/和凡嘘则结合于抗凋亡蛋白,抑制其抗凋亡作用, 与则进入核内,直接介导的切割【,。 内质网通路源于内质网腔内错误折叠/未折叠蛋白积累所引发的内质网应激 ,其诱导因素包括稳态扰乱,氧化还原状态改变,蛋白质糖基化抑制等。 正常情况下,存活分子结合于、、,使它们处于无活性状 态,应激状态下,冲与上述蛋白解离并使其激活,通过一系列信号阻止蛋白质 进一步合成,.和.发挥分子伴侣的作用,促使蛋白质正确折叠,细胞 采取挽救措施以缓解应激。如果挽救措施无效,则启动凋亡信号,通过 /、嬲.、.等分子促进凋亡的进行【’?。 .自噬概述 自噬是细胞通过溶酶体降解老化蛋白或受损细胞器的过程。自噬在营养物质缺 乏、生长因子撤除、细胞损伤等情况下对于维持细胞生存具有重要作用。自噬可清 除无用或受损的细胞内容物,为细胞提供代谢原料,在不利条件下帮助细胞存活。 在发生自噬的细胞胞质内首先产生大量游离的膜结构,称为前自噬体 幻,前自噬体进一步形成双层膜的空泡,包含细胞内容物,称为自 噬体,自噬体随后与溶酶体融合,形成自噬溶酶体, 自噬体内容物进入溶酶体腔,被溶酶体水解酶降解阮,得到的组分被细胞再利用。 .和.是自噬的两种标志分子。.是分子量为的抑癌蛋白, 北京协和医学院博:研究生论文 能够促进溶酶体酶类向溶酶体运输以及自噬囊泡的形成。.包括的. 和的.,前者分布于胞质,后者主要与前自噬体和自噬体结合。与. 相比,.的含量能够更敏感地反映细胞的自噬程度【,,。 虽然自噬能够通过清除受损细胞器来对抗外界不利因素,但过度自噬会导致细胞死亡,即型程序性细胞死亡 。在不同的细胞类型 及外界刺激下,自噬与凋亡可同时存在并相互拮抗或促进,参与两种途径的分子也 存在一定程度的交叉。 .前期工作基础 本实验室在国内外率先开展了亚硒酸钠对于血液肿瘤细胞的作用研究,结果显 示,亚硒酸钠在浓度大于“时,可以显著诱导、、.细胞株以 及白血病患者的原代细胞发生凋亡,并具有明显的抑制细胞增殖的作用。采用基因 芯片和蛋白质组学筛查了亚硒酸钠诱导细胞调亡前后差异表达的基因和蛋白 质,发现在这一过程中变化显著的基因和蛋白质主要涉及线粒体调亡途径和内质网 应激凋亡途径【,。经深入研究发现,亚硒酸钠诱导典型的线粒体凋亡通路,包括 线粒体膜电位下降、细胞色素释放以及多种的激活。在此过程中,. 家族成员【、、、?参与了凋亡信号的调节。此外,亚硒酸钠在其作 用早期激活了未折叠蛋白响应 ,的三条信号通路,即 ..,.一以及,以此促进内质网对错误折叠或未折叠 蛋白的处理,使细胞得以维持其正常功能并存活。随着作用时间的延长,内质网应 激加剧,被抑制,细胞启动凋亡信号,激活了的表达。 在凋亡过程中通过抑制抗凋亡激酶魅将凋亡信号从内质网传递到线粒体,从而成 为沟通内质网应激与线粒体凋亡通路的关键节点蛋白。活性氧清除剂能 够完全阻断亚硒酸钠诱导的细胞凋亡,表明活性氧在此过程中发挥非常重要的 作用。进一步研究发现,能够延缓亚硒酸钠引起的激活,抑制促凋 亡蛋白和的激活,抑制线粒体损伤和细胞色素的释放以及多种 的激活,表明活性氧是内质网应激与线粒体凋亡通路的上游信号【.。 研究还发现不同浓度硒对细胞的作用不同,营养剂量不超过亚硒酸 钠诱导细胞增殖,促进细胞生存,而超营养剂量.“亚硒酸钠则引起细胞 凋亡。具体而言,营养剂量亚硒酸钠激活了,而对促凋亡信号分子没有明显激 活,随着亚硒酸钠剂量增大,信号分子的激活被抑制,促凋亡分子、北京协和医学院博研究生论文 以及等被激活。因此营养剂量的亚硒酸钠激活以帮助细胞修复损 伤,促进细胞生存,超营养剂量的亚硒酸钠则抑制的激活,诱导凋亡相关的 信号分子,从而引起与营养剂量亚硒酸钠截然不同的效应【。 除此之外,本实验室还对亚硒酸钠诱导细胞凋亡过程中自噬与凋亡的关系 进行了初步研究。发现在细胞中存在活跃的自噬作用,随着亚硒酸钠作用时 间 的延长,自噬水平逐渐降低,伴随凋亡的逐渐增强。进一步研究表明,亚硒酸 钠通 过下调信号通路抑制自噬?。 .本研究的主要内容及意义 本研究在前期工作的基础上,进一步阐明了在亚硒酸钠诱导细胞凋亡过程 中,一些受到活性氧调节的相关分子的变化情况、调节通路及其对凋亡的影 响,包 括细胞在应激状态下启动的抗氧化酶上调及其...信号 通路;在亚硒酸钠诱导细胞由自噬向凋亡转变过程中的作用;活性氧介导 下调在亚硒酸钠诱导凋亡过程 的蛋白激酶下调以及呼吸链蛋白 中的作用。 ..亚硒酸钠通过核转位与激活诱导上调 是细胞内最重要的抗氧化酶之一,对于细胞对抗氧化应激发挥至关重 要的作用。本研究发现亚硒酸钠能够浓度与时间依赖性地诱导上调。活性 氧清除剂能够完全阻断上调,表明活性氧在此过程中发挥关键 作用。进一步研究发现,蛋白激酶与转录因子与亚硒酸钠诱导的 上调密切相关。经测序表明,本研究使用的细胞表达野生型的。亚 硒酸钠作用于细胞,首先引起两种细胞内活性氧即超氧自由基与过氧化氢的 上 调,在活性氧尤其是超氧自由基的作用下,砌从胞质转移到核内,并且在核内 发挥其激酶活性,通过与直接结合磷酸化其关键位点。在未加药细 胞中,在核内与其抑制性蛋白结合,导致其转录活性被抑制,而在经亚 硒酸钠处理的细胞中,核内被磷酸化,从而与解离而被激活, 诱导其靶基因的表达。在缺失或突变的白血病细胞株.和 中,亚硒酸钠不能诱导的上调,进一步证明了的重要作用。推测 ..信号通路可能是细胞针对亚硒酸钠启动的一种重要的 抗氧化机制。 ..亚硒酸钠诱导的激活介导细胞由自噬转向凋亡 北京协和医学院博.:研究生论文 前期研究己发现,在未加药细胞中存在活跃的自噬现象,亚硒酸钠诱导 细胞凋亡的同时伴有显著的自噬抑制。本研究进一步证明的激活在 细胞由自噬转向凋亡的过程中发挥关键作用。通过使用多种激酶的特异性抑 制剂发 现,?与介导了关键位点的磷酸化。如前所述,在未加药 细胞中,与其抑制性蛋白结合而处于无活性状态,磷酸化的 与解离而被激活。在此过程中核仁蛋白从核仁转位至核质,与 共定位并结合,从而起到稳定的作用。特异性抑制剂及干扰显 著抑制亚硒酸钠诱导的凋亡及激活,并且逆转自噬标志分子.和 .的减少,表明的激活在促进凋亡的同时抑制自噬,从而使细胞由自 噬转向凋亡。 ..亚硒酸钠通过下调促进细胞凋亡 是重要的蛋白激酶,与包括凋亡在内的多种细胞活动具有密切关系。 在亚硒酸钠诱导细胞凋亡后期,在蛋白水平与磷酸化水平均显著下 调。活性氧清除剂完全逆转此效应,表明活性氧是下调的重 要诱导因素。抑制剂与干扰均能促进亚硒酸钠诱导的凋亡, 抑制还能增强活性氧的产生,表明在细胞中发挥对抗凋亡 和抑制活性氧产生的作用。进一步研究证明,的抗凋亡作用是通过对 与脂的调节来进行的。此外,活性氧激活蛋白水解酶.,并且上调磷酸酶 的表达,在凋亡后期,两者分别在蛋白水平与磷酸化水平下调,从 而加速了凋亡的进行。 ..亚硒酸钠通过下调 促进细胞凋亡 也被显著下调。 在亚硒酸钠诱导细胞凋亡后期,线粒体呼吸链蛋白对于线粒体呼吸链成员细 胞色素氧化酶” ,的装 配与功能至关重要,能够影响整个能量代谢与氧化磷酸化过程。?下调发生 在蛋白水平,而?水平未有显著变化,提示其下调机制与转录调节无关。活性 氧清除剂能够完全逆转 表达下调与激活,而. 抑制剂则能部分阻断 的下调,提示活性氧通过激活.引起 的减少。通过表达载体瞬时转染细胞,以干扰 的表达,能够 这 显著增强亚硒酸钠诱导的凋亡,提示亚硒酸钠可能通过... 一途径破坏线粒体呼吸链的完整性与功能,加速了凋亡的进行。北京协和医 学院博研究生论文 材料和方法 实验材料 .细胞株 人急性早幼粒细胞白血病细胞株;人急性早幼粒细胞白血病细胞株 .以及人急性单核细胞白血病细胞株。 .主要试剂 培养基与胎牛血清分别购自公司和天津灏洋生物制品科技有 限责任公司; 亚硒酸钠、二甲基亚砜、碘化丙啶、溴化乙锭、丫啶橙 、二脒基苯基吲哚、四甲基乙二胺购自“; 、 、 购自;反转录酶、 、、、、.购自; 冈田 购自:.仅、?、购自; 、× 眩; 酸购自 细聚合酶、 毹购自酞;预染蛋白购自肌; 化学发光检测试剂盒购自 ;光底片购自; .培养基购自; 购自; 皿 .凋亡检测试剂盒购自;购自碧云天生物技术有限公司;荧光防淬灭剂购自上海杰 美基因医药科技有限公司; 活性氧探针.、购自碧云天生物技术有限公司; 线粒体蛋白提取试剂盒与核蛋白提取试剂盒分别购自北京普利莱基因技术有限公 司和武汉博士德生物工程有限公司; 三氯甲烷、无水乙醇、甲醇、磷酸、冰醋酸购自北京北化精细化学品有限责任公司; 异丙醇购自北京益利精细化学品有限公司;硼酸购自北京新光化学试剂厂;液体石 、甲叉双丙烯酰胺、丽春 蜡购自北京金龙化学试剂有限公司;.甘氨酸、强 红、.、× 旋购自北京普博欣生物科技有限责任公司;丙烯 酰胺、二乙基焦磷酰胺购自北京鼎国生物技术有限责任公司;氯化钠购自北 剂厂;过硫酸铵购 及【抗体 购自 : //、、 、 、’、?、、、、一、一及一抗体购自 ; 抗体购自;抗体购自.; 冲标记的羊抗兔或羊抗鼠、砌标记的羊抗兔和标记的羊 抗鼠购自北京中杉金桥生物技术有限公司; .引物: 所使用的引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,序列如下: 基因 引物序列上游:’..’.’ 下游:’. 上游:’..’ 下游:’..’ .’ 片段:上游:’. .’ 下游:’. .’ 片段:上游:’. .’ 下游:’. .’片段:上游:’. .’ 下游:’一 .矾与表达载体 针对靶基因的荧光标记由上海吉玛生物技术有限公司合成,序列如下:北京 协和医学院博:研究生论文 ’..’ ’..’ ?表达载体系由上海吉玛生物技术有限公司合成针对靶基因目标序列的 序列,并将其插入/洲表达载体,目标序列如下: 基因 目标序列’一.’ .主要溶液的配制 培养基 取冲 培养基一袋加入约砌三蒸水,加入 .,磁力搅拌使其完全溶解,加入终浓度为 / /的青霉素和 /的链霉素,用 调定 值为.,加三蒸水定容至 。经.岬滤膜 滤过除菌后分装,?保存。 . / 溶液 . 加入双蒸水中搅拌,用调 至.,双蒸水定容至,高压灭菌,?存放。 溶液 ×母液:双蒸水中加入 , ,,用/ 调 . ,. 定值至.,加双蒸水定容至,高压灭菌,室温保 存。 ×工作液:取×母液稀释十倍,?存放。 溶液 以配成咖,?避光存放。 溶液 将胰核糖核酸酶 溶解于./醋酸钠缓冲液 .,使终浓度为/,沸水煮,放在室温 下缓慢冷却,用 .调整至.左右, 分装保存在.?备用。 ? ×电泳缓冲液 卧硼酸 .、 .,加双蒸水至 。 ,充分溶解,最后定容至 .%水 取 溶于 双蒸水,高压消毒,?存放。 全细胞蛋白裂解液 , , ., 北京协和医学院博:研究生论文 ,% ,.焦磷酸钠, .甘油 磷酸,原钒酸钠,分装保存在.?备用,临用时加 。 入‖ 和 %乙醇,加入 将考马斯亮蓝溶于 考马斯亮蓝染液 %磷酸,搅拌溶解,以双蒸水定容至,滤 纸过滤,室温避光保存。 .电泳缓冲液 ×母液:. 和 甘氨酸,电泳级, 双蒸水定容至。 . 电转缓冲液 甲醇,定容至 ,. 甘氨酸, 。 溶液 溶于约 ×母液:. , 双蒸水中,用浓调值至.后,双蒸水定容至 。 溶液:取×母液稀释倍后加入.% .。 配制为 的储存液,.?密闭避光保存。 . 配制为 的储存液,.?密闭避光保存。 配制为 的储存液,.?密闭避光保存。 配制为 的储存液,.?密闭避光保存。 配制为 的储存液,.?密闭避光保存。 配制为 的储存液,.?密闭避光保存。 配制为 的储存液,.?密闭避光保存。 配制为 的储存液,?密闭避光保存。 配制为 的储存液,.?密闭避光保存。 ? 配制为 的储存液,室温密闭避光保存。 溶液 配制为 /的储存液,.?密闭避光保存 .主要仪器: 北京协和医学院博研究生论文 , .?低温冰箱海尔,.型、.?超低温冰箱 型、二氧化碳培养箱 ,.型、超净工作台北京半导体设备一厂、 倒置显微镜,.型、荧光倒置显微镜, 一型、电子天 平,型、计 朋,.型、紫外分光光度计, 型、台式高速离心机北京京立离心机有限公司, .型、台式低 速离心机北京京立离心机有限公司,.型、台式高速低温离心机, 型、超声波细胞粉碎机 ,型、核酸、蛋白电泳槽和电 , 转移装置.、仪 ,型、真核电转仪 型、.成像系统.、细胞离心涂片机长 沙湘仪离心机仪器有限公司,型、磁力搅拌器浙江乐成电器厂,二型、 电热恒温干燥箱天津泰斯特仪器有限公司,.型、水平摇床北京六一仪器 厂,.型、自动旋转式混匀仪江苏兴化市分析仪器厂,型、各型加 样器等。 实验方法 .细胞培养、冻存及复苏 ..细胞培养 、.及细胞株均采用悬浮培养的方法。细胞培养于含%胎牛 血清、.%碳酸氢钠、/青霉素以及/链霉素的冲 培养基中, 孵箱温度?,湿度饱和,含量%。维持细胞密度在.×/。实验时采 用处于对数生长期的细胞,调整细胞浓度为×/。 ..细胞冻存 选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天更换培养基。 离心收集细胞 ,分钟,弃去上清液,加入预冷的含% /。 的胎牛血清,轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为×.× 、.?小时、.?过 将细胞分装于专用冻存管中,依次置于? 夜后放置于液氮中保存。标记细胞名称和冻存日期,同时作好登记同期、 细胞种类及代次、冻存支数。 ..细胞复苏 从液氮中取出冻存的细胞,立即放入?水浴中快速解冻。轻轻摇动冻存管, 北京协和医学院博:研究生论文 使其尽快全部融化不要超过分钟。 将解冻的细胞液加入到约倍体积完全生长培养基中,轻轻混匀。 离心收集细胞叩,分钟,弃去上清液。 用完全生长培养基轻轻悬浮细胞团,接种至培养瓶中。 小时后更换培养基,以去除残余的。 .标记检测细胞凋亡 ..实验原理 凋亡细胞在内源性核酸酶作用下产生小的片断,细胞在经过乙醇固定时, 小的片断可以被抽提出来,细胞成为亚二倍体。可以透过已经穿孔的细胞 膜与染色质结合,在流式细胞分析时,在?期前形成明显的亚二倍体峰。 ..实验步骤 离心收集收集 个细胞, , ,弃去上清液,预冷洗 涤两次。 预冷的%乙醇重悬细胞,?固定过夜。 重悬细胞,加 离心弃去上清液,预冷洗涤细胞两次,然后用“ 。 入? 咖,?孵育 置于冰上,加入“‖染色,避光后进行流式细胞术检测。 .、佃双染检测细胞凋亡 ..实验原理 磷脂酰丝氨酸在正常细胞内位于细胞膜内侧,但在凋亡细胞中,可从细 胞膜内侧翻转到细胞膜表面。 是一种依赖性磷脂结合蛋白,能与 高亲和力特异性结合。除凋亡细胞以外,在坏死细胞中同样会发生外翻。核 酸 染料碘化丙啶不能透过正常细胞完整的细胞膜,但在凋亡中晚期细胞和坏死 细 胞,能够透过细胞膜与染色质结合。因此将经过标记的?蛐 与联合使 用,能够对凋亡进行更准确的检测。 ..实验步骤 按照试剂盒说明操作 离心收集×个细胞,印, ,预冷洗涤一次,重悬于. 髓重悬细胞,将细胞悬液转移到小容量玻璃 加入适量预冷的. 匀浆器内,置于冰上,用间隙严密的研杵研磨细胞若干次,显微镜下观察细 胞破碎程度。 ?离心 ,细胞核、大的膜碎片、 将细胞匀浆物转移至离心管, 未裂解细胞等沉淀于管底。 ?离心 ,弃去沉淀。 收集上清液并转移至新的离心管, ?离心 ,离心后的上清液即为 将上清液转移至新的离心管,, 胞浆组分,沉淀为线粒体组分。将上清液转移至新离心管,一?保存。 ?离心 ,弃去上 用适量? 腧洗涤线粒体沉淀,, 清液。 用适量?裂解液重悬线粒体沉淀,一?保存。 ..核蛋白提取 离心收集个细胞,预冷洗涤两次,弃去上清液。 用适量核蛋白提取侬预先加入和重悬细胞,剧烈振 荡 。 ,然后置于冰上 剧烈振荡 ?离心 ,上清液为胞浆组分,收集上清液 ,,印 北京协和医学院博研究生论文 于预冷离心管中,一?保存。 ,剧烈振荡 ,置于冰上 尽量吸尽残余上清液,然后加入适量虢 。 ,每隔 剧烈振荡 ,,叩?离心 上清液为核蛋白组分,收集上清液于预冷离心管中,一?保存。 ..法测定各组分蛋白浓度 ‖ 为标准蛋白,分别取“、 绘制蛋白标准曲线:以. 、 ,加入 考马斯亮蓝染液,反应 “、“,用补足至 . 。在 波长紫外光激发下,检测体系的吸光值,绘制 标准曲线。 稀释倍。 取蛋白样品,加入肛 考马斯亮蓝染 取 ,加入稀释的样品混匀,再加入 液,反应.。 在姗波长紫外光激发下,检测体系的吸光值。 对照标准曲线,计算蛋白样品浓度,然后将各组样品浓度用裂解液调 整至均等。 ,待样品降温后保存于 加入适量×向脏混匀,沸水浴中作用 .?备用或直接用于蛋白电泳。 ... 按照《分子克隆》所述方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳.巧锄 ,?。浓缩胶含%聚丙烯酰胺,根据目标蛋白的分子量 大小可灵活选用含%或%聚丙烯酰胺的分离胶。蛋白上样量一般为鹇,视 具体情况可有所增减。电泳以恒压进行,浓缩胶中使用电压,电泳至分离胶中 时使用电压。至前端溴酚兰行进至分离胶下缘时停止电泳。 ..蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜湿式转膜 电泳停止前提前准备好合适大小的硝酸纤维素膜州膜、滤纸及电转板海绵 垫,先于蒸馏水中浸泡约 ,再浸泡在电转缓冲液中约 ,以平衡离子强 度。电泳结束后,取出带有凝胶的玻板,用割胶刀沿下边缘小心撬开短板,将 凝胶 转移至电转缓冲液中。 按以下顺序在电转缓冲液中制作电转三明治:由下至上依次为张滤纸, 膜,凝胶,张滤纸。对齐,并用手指或玻璃棒按压以赶出气泡。轻轻从缓冲液 中 孵育.小时。 。 洗涤膜:二抗孵育后,取出膜,洗涤次,每次 显像:将膜在滤纸上适当沥干,结合有蛋白的一面朝上平铺。根据 膜的大小,将适量试剂液、液等体积混合,滴加至膜上, 使液体覆盖整张膜。反应后将膜提起,边缘接触滤纸将液适当沥 干,夹在两层干净的透明薄膜中放入暗盒,用胶布固定。在黑暗中进行 光片曝光,根据膜上荧光信号强弱灵活掌握曝光时间。光片曝光后依次进 行显影和定影,再用自来水冲洗干净并晾干。 . .. 提取细胞总州 离心收集×个细胞,加入商 ,反复吹打,加速细胞裂解 。 然后室温静置 。 氯仿,猛烈振荡 ,室温静置? 加入. ,?,离心 离心后体系分为下层酚.氯仿有机相、中层及上层水相,全部存在于 水相中约占总体积的%。将水相转移至一洁净管中,加入.异 北京协和医学院博:研究生论文 。 丙醇,混匀后室温静置 ,?,离心 。 弃去上清液,用 %乙醇洗涤沉淀,?,离心 弃去上清液,使矾沉淀在空气中略微干燥不能使之完全干燥,否则会影 响其溶解度,用适量水溶解?沉淀。 将溶解后的稀释倍取 用水稀释成“体系,用 紫外分光光度计测定其值并计算酬浓度。 ..逆转录为 在洁净的扩增管中加入如下成分: 低 “ / 扯 水 ,混匀 在另一扩增管中加入总量为.鹏的,以水补足至 后?孵育 ,然后迅速置于冰上。 ,即可逆转录得到 将两管内容物混合,?孵育小时,?孵育 ,保存于.?备用。 ..扩增目的基因 取洁净扩增管,按照以下方法进行扩增: 反应体系: “ 斗 肛 .“ 上游引物“ .肛 下游引物 目的基因上游引物“ “ 目的基因上游引物 “ .“北京协和医学院博:研究生论文 反应条件: ? 步骤 ? 步骤 ? 步骤 ? 步骤 步骤.循环次 ? 步骤 ? ? 步骤 ..琼脂糖凝胶电泳检测产物 毹混匀后,在含有的%琼脂糖凝胶中 取扩增产物“与山× 进行电泳。电泳完成后在紫外灯下观察产物条带。 序列测定 . 编码区序列设计三对引物引物序列见实验材料,使产物 根据 覆盖编码区全长。以为模板进行扩增,扩增条件同上。片段长 ,覆盖整个外显子.以及外显子和的一部分;片段长,覆盖整 个外显子.以及外显子和的一部分;片段长,覆盖整个外显子. 以及外显子和的一部分。将产物送交上海英骏生物技术有限公司纯化和 编码区序 测序,以扩增引物作为测序引物,根据测序结果可确定完整的 列。 .干扰 ..转染 配制工作母液:将.. 针对靶基因的双链和阴性对照 锄 水中,得到浓度为 ?分别溶于 的 母液。 刚?转 在六孔板每孔中加入? ?培养基,然后加入 北京协和医学院博:研究生论文 染试剂,混合均匀。 在洁净管中加入肛 培养基,然后加入适量,轻轻 。 混匀后加到已有.的孔中,混合均匀,室温静置 培养基洗涤两次,然后加入 离心收集足量细胞,用无血清无双抗 适量无血清无双抗 培养基,使细胞浓度为.×/,每孔加入 细胞悬液,使每孔细胞总数为×,轻轻混匀后放入细胞培养箱中 培养。 培养.小时后每孔加入“含%血清的无双抗冲 培养基。 小时后收集细胞,按照上述步骤进行第二次转染转染后在荧光显微镜下观 察转染效率。 ..表达载体转染 离心收集×个细胞,用无血清无双抗 培养基洗涤两次,然后 重悬于适量无血清无双抗 培养基中,转移到电转杯中。 ,电容 加入烬?表达载体,用电穿孔法进行瞬时转染,电压 心。 吸取细胞悬液转移到六孔板中,加入完全生长培养基,放入细胞培养箱 中培养。 .细胞内活性氧的检测 ..实验原理 本身没有荧光的探针.和可穿过细胞膜进入细胞,分别被细 胞内的过氧化物和超氧自由基氧化脱氢生成和啪例如等荧 光物质。在适当的激发波长和发射波长下.激发波长眦,发射 波长,激发波长啪,发射波长 ,使用荧光显微镜、 激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光, 可分别测定细胞内的过氧化物和超氧自由基水平。 ..实验步骤 培养基 离心收集足量细胞每一处理组×个细胞,用无血清 洗涤一次,然后用适量无血清心 培养基重悬细胞,加入扯 。 .或探针,?孵育北京协和医学院博:研究生论文 离心收集细胞,用无血清 培养基洗涤两次, 培养基。 含“亚硒酸钠的无血清 将细胞悬液分至孔板中,每孔“,每一处理组设 标仪中连续读数总计小时,时间间隔小时。?激发波长 ,发射波长,激发波长,发射波长。 根据多次测定的结果绘制曲线。 .免疫荧光染色 细胞接种于孔板,每孔,接种密度×/,加药处理。 离心收集细胞,预冷洗次,然后以适量重悬细胞,用细胞离心 涂片机将细胞平铺至载玻片上。 细胞固定:将载玻片浸入%多聚甲醛,室温,然后洗次,? 次; 透膜:用含%一的室温处理,洗次。 加入一定比例稀释的一抗,?湿盒过夜,洗次。 加入一定比例稀释带有荧光标记的二抗,室温避光小时,洗次。 用荧光防淬灭剂封片,立即在荧光显微镜下观察。 .免疫共沉淀 离心收集ב个细胞,预冷洗涤两次,用适量对全细胞蛋白裂解 。 液重悬细胞,置于冰上 ?离心 ,收集上清液,即为全细胞蛋白。用法测定 , 各样品蛋白浓度并将浓度调至均等。 向蛋白中加入适量一抗,?旋转混匀过夜。 ,?旋转混匀小时,, ?离心 加入 ,弃去上清液。 脏重悬沉淀, 用预冷裂解液洗涤沉淀次,然后用适量× 。 沸水中作用 离心收集上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。北京协和医学院博:研究生论文 .丫啶橙染色观察酸性囊泡 细胞接种于孔板,每孔,接种密度×/,加药处理。 。 加入“丫啶橙,室温避光孵育 离心收集细胞,预冷洗涤三次,用适量重悬细胞,滴加至载玻片 上。 立即在荧光显微镜下观察。 .统计学处理 数据以均数士标准差表示。采用双尾咖’ 对数据进行统计学分析。 .表示差异具有显著性。北京协和医学院博:研究生论文 实验结果与讨论 第一部分亚硒酸钠通过核转位与激活诱导上调 实验结果 .亚硒酸钠诱导细胞凋亡伴随细胞细胞内活性氧的迅速产生 为了检测亚硒酸钠诱导细胞凋亡情况,我们采用了 /双染的 方法。以亚硒酸钠作用于细胞不同时间,然后使用专用试剂盒对细胞进行 /双染,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,随着作用时间的延长, 阳性细胞逐渐增多,表明亚硒酸钠时问依赖性地诱导细胞发生凋亡 图和图。亚硒酸钠作用后,细胞凋亡率达%以上,从而进一步证实 了前期工作的结论,即亚硒酸钠诱导细胞显著凋亡。我们还检测了亚硒酸钠 作 用于细胞后,细胞内的活性氧变化情况。细胞内的活性氧主要包括两类,即超 氧自 由基和过氧化氢。分别采用针对这两种活性氧的探针和.检测它们 的变化情况,发现细胞内的超氧自由基和过氧化氢水平在亚硒酸钠作用后均 立即升 高,并且在作用后小时左右作用达到峰值。两者的区别在于,超氧自由基在达 到峰值后出现明显的下降趋势,而过氧化氢则保持在较高水平图,关于造成 这 一差别的原因,在后文中将进行讨论。 獭 翮 飞 ’ 连 ????叫 鼍鹈 黔 ,‖四卜 万’ 嚣 誊萄 巷俘 ‘ 驴 矿酽争静争??季。乏 ;?一一一逡 。上一一一二一一泌 .,北京协和医学院博:研究生论文 图亚硒酸钠诱导细胞凋亡伴随细胞细胞内活性氧的迅速产生。和亚硒酸钠诱 导的细胞凋亡。弧硒酸钠作用于细胞不同时间后进行、仰舣染,流式 细胞术检测细胞凋亡。数据以平均值士标准差表示,?与对照组相比.。距硒 酸 钠诱导的活性氧产生。洲哑硒酸钠作用于细胞,分别用或?探针标记并检测 细胞内的超氧自由基和过氧化氢。数据以平均值士标准差表示。 .. ? . ?. 仃 ;吖 嬲. ?/ ”哕仃 私锄 ,. .协 印. 佻仃. . 硒、 觞 . .、 邪蛐 .亚硒酸钠通过活性氧诱导抗氧化酶的表达上调。 是定位于真核细胞线粒体基质的超氧化物歧化酶,是细胞内最重要的 抗氧化酶之一。它能催化超氧自由基歧化为过氧化氢,与分解过氧化氢的酶 类如过 氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶一起维持细胞内的氧化还原平衡,保 护细胞免受氧化应激损伤【】。由于我们已经发现亚硒酸钠引起细胞内活性 氧的迅 速升高,因此我们针对这一现象检测了抗氧化因素的表达。用“亚硒 酸钠作用于细胞不同时间,发现在亚硒酸钠诱导细胞凋亡过程中,从 开始,的表达发生了显著上调图。以不同浓度亚硒酸钠作用于细 胞,结果显示低浓度的亚硒酸钠同样能诱导的表达上调,但远不如高 浓度亚硒酸钠的作用显著图。那么细胞内高水平的活性氧是否与的上 调有关我们采用活性氧清除剂预处理细胞,抑制亚硒酸钠诱导的活性 氧升高,然后用亚硒酸钠作用于细胞小时,检测的表达情况,结果显示 在这种情况下,亚硒酸钠诱导的上调完全被抑制图。在预 处理细胞的前提下,亚硒酸钠作用于细胞不同时间,的表达均维持在对照 水平,没有任何程度的上调图。上述结果表明活性氧是介导上调的关 键因素,由于主要针对活性氧中的超氧自由基而不是过氧化氢,因此具 体而言,超氧自由基可能在上调过程中发挥主要作用。北京协和仄学院博: 研究生论文 一书? ,‖ 鳋一????一删瓿, 》四煳嗍糊蝴黼嗍黼一一粼缸 塑堕呈《 蓼‰,嗍一嬲麟艄黼 甥懒鳓嗍黼渺黼黼懈一?稻 ,’ . 一 幽一 一 黟了戮?鬣鼍 绷黼黔黼槲槲一?矗 幽群要譬娶翟 》黼荆黼嬲蝴黼湖黼嘿一?鬈 图亚硒酸钠通过活性氧诱导抗氧化酶的表达上调。亚硒酸钠时间依赖性地诱 导 表达上调。肛亚硒酸钠作用于细胞不同时间,提取全细胞蛋白, 检测表达。?硒酸钠浓度依赖性地诱导表达上调。不同浓度亚硒酸钠作 用于细胞小时,提取全细胞蛋白, 检测表达。和活性氧 清除剂对亚硒酸钠诱导的上调的作用。州预处理细胞小时, 然后用州弧硒酸钠作用于细胞小时或作片不同时间,提取全细胞蛋白, 检测表达。 ... 、仃? 啪 嬲. 锄“、? . . 胞 . 嬲 ? .艉 . 北京协和医学院博:研究生论文 ’弱.弱 . .蛋白激酶参与亚硒酸钠诱导的上调 亚硒酸钠诱导细胞内活性氧的产生如此迅速,而活性氧尤其是超氧自由基介 导 了的上调,因此我们推测活性氧是这一调节过程中的上游因素,在活性氧 产生与上调这两个事件之间必然存在一条信号通路,活性氧通过这一通路 引起了的上调。蛋白激酶是细胞内一类成员众多、影响广泛的群体,能够 通过磷酸化多种靶蛋白的氨基酸残基参与细胞功能的调节。活性氧是否通过 特定的 蛋白激酶对的表达进行调节为此我们使用了几种主要蛋白激酶的选择性 抑制剂,包括抑制、抑制?和抑制 ?。用这些抑制剂预处理细胞,然后用亚硒酸钠作用小时,结果显示, 与对亚硒酸钠诱导的表达上调均无显著影响图,表明这一 调节与和玳无关。但用预处理细胞后,亚硒酸钠作用于细 胞小时,的上调被完全阻断图。在预处理细胞的前提下, 亚硒酸钠作用于细胞不同时间,的表达均维持在对照水平,没有任何程度 的上调图。上述结果提示?是表达升高的重要因素。作为细 胞内的重要激酶,参与细胞增殖、分化、周期进展、老化、迁移、骨架形成 以及凋 亡等多种细胞活动,,接下来我们将主要研究参与上调的具体方 式。北京协和医学院博研究生论文 . . 一 . . .. .爹“二” ’静锄粼翰黪镳嘲神?一 ?豁, .~??缸。。 ,。&。? ,?一?档,,旃,‰自慨 . . 一 一 多一?黝黼硼嘲蝴嘲》端滞物御肺蝴榭鞔捌”?嗍辩解 譬。二 。’?一一一 ?, 编黼绷绷缈嗍黼嗍黝黼嘲獬罄一钗、囊 %‰, ?、~, 。 。‰ 图蛋白激酶参与亚硒酸钠诱导的上调。抑制剂和州抑制剂 对亚硒酸钠诱导的上调的作用。分别用 预处理 和“ 细胞.小时,然后用洲?硒酸钠作用于细胞小时,提取全细胞蛋白, 检测表达。和抑制剂对亚硒酸钠诱导的上调的作用。州 预处理细胞.小时,然后用州亚硒酸钠作用于细胞小时或作用不同时间, 提取全细胞蛋白, 检测表达。 .. . 刷 .州 州. ?陀 . 锄 部 .锄 诧. . .、. 缎..亚硒酸钠通过活性氧诱导从胞质向核内转位 已经证实活性氧和参与了亚硒酸钠诱导的上调,那么活性氧与 水究竟是通过何种方式发生联系由于细胞核是调节蛋白表达的大本营,而活 性 北京协和医学院博研究生论文 氧主要产生于胞质,因此我们推测水可能是衔接活性氧与胞核的关键因素。 根 据已有文献报道,在特定刺激下能够从胞质转移到核内,发挥抑制凋亡、促进 细胞周期进展等作用【。,那么是否有可能通过转移到核内将活性氧的信号 传递给调节表达的分子为了阐明这一问题,我们检测了亚硒酸钠处理前 后在细胞内定位情况的变化。鼬与?是?家族的主要成员,两者 具有高度相似的结构与功能【,,我们主要以鼬作为研究对象。我们用亚硒酸 钠作用于细胞不同时间,提取核蛋白与胞质蛋白,然后检测两种组分中砌的 变 化情况。色 结果显示胞质中的砌及其磷酸化形式 /屹厂心逐渐减少,而核内的砌及./则逐渐增多图 ,表明鼬可能发生了从胞质向核内的转位。而一旦用活性氧清除剂 预处理细胞,然后再用亚硒酸钠作用或作用不同时间,则上述砌 及.的趋势变化被完全阻断图和图,提示活性氧是砌转位的上游 调节因素。 为了提供活性氧诱导砌核转位更直观的证据,我们通过免疫荧光染色直接 观察鼬在细胞内的定位情况,并且用染料标记胞核图。图中 红色荧光为砌所在位置,蓝色荧光为胞核所在位置。在对照细胞中,我们可以 看到鼬与胞核位置明显没有重叠,在叠加图中两者界限依然分明,表明砌 主要位于胞质。而在亚硒酸钠处理小时后,砌与胞核出现了明显的重合区域, 表示砌进入核内。而在预处理的细胞中,亚硒酸钠不能引起两者所 在区域的重叠,未进入核内。上述现象进一步证实了 的结果,即 亚硒酸钠作用于细胞后,通过活性氧诱导砌从胞质转位进入核内。北京协和 医学院博士研究生论文 ?喀 鲫姗 ???‘辱量?僦 釉一。?篇嵩孙拟 ? 塾?‘????? 釜嘲?巴?~一。。。。。。。;么喇 怕阚咖 . . . ?.??嗡一?‘~翻隙愆 ’????,?????嘲 謦 ???????毫.幽。。。。幽~。?盆曲盈曲 黼陆护 四?鬈目嗍 麓????????孙一一一日? 一一一一一一一一叫需笺猕槲 。???,? 。?叠?豳?啦???盔曲??????????岱础蕾???《瞄? 誓一 拳?一?.岫。?。妇粕幽。一。。。。。.一配岫 的水核转位。 检测与北京协和医学院博:研究生论文 ?,蛋白水平。肛与分别作为胞质蛋白与核蛋白的内参。活性氧清除剂对 核转位的作用。“ 预处理细胞小时,然后用亚硒酸钠作丁细胞 小时或作用不同时间,提取胞质蛋白与核蛋向, 检测与/ 蛋白水平。免疫荧光染色显示的核转位情况。弧硒酸钠作用于细胞小时, 或? 预处理小时后再用亚硒酸钠作用小时,用一抗与 标记的二抗显示红色,片 显示胞核蓝色。 . . .虢 沁拍“ 雒. 仔 锄舔 雏 /田 .?锄 雒 龃 .行 伽.甜 州 嬲. ”嬲 ‰、 豁 .盯锄 鼬 . 仃舔 . , 州” 州 签 觚. 叫卸锄 . .细胞表达野生型的 虽然转位至核内,但水本身并非针对的转录因子,不能直接 引起的表达上调,因此我们推测在核内存在某种因素使?与上 调发生关联。我们把注意力放到了上面。是众所周知最重要的抑癌蛋白之 一,具有阻断细胞周期进展、起始修复、诱导凋亡等多种功制删。作为一种 转录因子,调节一系列靶基因的表达,其中就包括的编码基因。 基因的启动子区域包含结合位点,在阿霉素等刺激下其表达可受到的 诱导【’。但另一方面,又是一种在肿瘤细胞中突变率非常高的蛋白,大约% 的肿瘤细胞都不表达或表达突变型的。而细胞中是否具有野生型并不 确定,主要取决于所使用的具体的细胞株,因为细胞表达野生型【】或突 变型【,均有过报道。因此,要研究在上调中的作用,首先要确北京协和医学 院博:研究生论文 定本研究使用的细胞中的状态,为此我们采用了测序的方法。 全长 ,其中. 为编码区,包括外显子.的全部以及外显 子和的一部分,此前所报道的细胞中突变均发生在此区域内,尤其 是外显子.,是突变的“热点区域” 。我们设计了三对引物,使其 扩增产物首尾重叠
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