胶回收DNA

胶回收DNA 胶回收DNA片段 一、实实目的 1、了解分离化实实DNA片段中的染物方法和原理实实实实实实实实二、实实原理 首先利用低熔点脂糖凝胶泳实实实实实实实DNA片段,分离目的条实DNA,然后紫外光下切割含目的DNA条的胶,利用实实实实实实实胶回收盒回收化实实实实实实实DNA片段。盒的胶回收柱采实实实实实实实实实用特殊硅基材料在一定的高冲系下高效、一地吸附实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实DNA、RNA的原理，在高、低实实实pH实情况下吸附DNA,低、高实实实pH实情况下放实实DNA。离心柱上含有Resin合成脂,具有吸附实实实实实实实DNA的功能,,配实实实实实实实实实实实实实实独特的离心吸附柱式构,使用常台式高速 离心机,在几分之内即可以高效回收核酸片实实实实实实实实实实实实实段。 三、实实实器与 实实实器 1、脂糖凝胶泳系实实实实实实实实实 2、紫外察实实实实实 3、离心机 4、面刀片实实实实 5、恒温水浴实 实实 1、DNA回收盒实实实 溶胶液:6 M NaClO (pH 5.2) ,0.03M NaAC(pH 5.2)实实实实酚少4 洗液:50 mM Tris-cl,0.1 mM EDTA,pH 8.0) 70%乙醇 存液:实实实TE buffer (10 mM Tris-cl,0.1 mM EDTA,pH 8.0). 2、50×TAE，洗液:50 mM Tris-Hcl,0.1 mM EDTA,pH 8.0) 70%乙 醇 , 3、ddHO，重蒸水,蒸两次的水实实实实实,2 四、实实实步 1,在紫外灯下切分含DNA的脂糖,尽可能除实实实实实实实实实去多余的脂糖,放入实实实实实实1.5ml离心管中。 ，切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。所以了减少胶的体,我就可以用相实实实实实实实实实实实实实实实实 实实实实实实实实实实实实实实实实实实实比薄的胶来跑泳,通常只要点即可, 或是采用薄而的梳子来跑胶。可减少回收实实实实实实实实实实实实实实实 实实实实实实引起的一些后麻。, ，紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶,要以干的实实实实实实实实塑料薄膜,使用无DNA实染的新刀片,其目的在于防止外源DNA的染。,实实实 2,按每100mg实脂糖加入300—600μl溶胶液的比例加入溶胶液，本加实实实500ul,,置55?水浴10分,使脂糖完实实实实实实实实全溶化,期实每2分倒混匀一次促溶。实实实实实实实实实实 ，利用凝胶回收盒实实实DNA回收效率低或者未回收实实实实实实实到目的片段可能有以下几个原因:胶未完全溶解,可实实实实实实实实适当延水浴,并增加上下倒次数助溶实实实实实实实实实实实实实实实实实实 解,胶体太大,先将其切小,分多次回收,泳冲液实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实pH太高,硅基膜在高低实实实实实实pH实 合DNA,如pH太高,作适实实实当整,漂洗液中未加入无水乙醇。,实实实实实实实实实实实实实实实 3,将溶化后的脂糖液移入吸附柱,实实实实实实实实实实12000rpm 室温离心1分,实倒掉收集管中的液体,再将吸附柱放入同一个收集管中。 4,在吸附柱中加入500ul漂洗液,室温静置1分后,实实实 12000rpm 室温离心30秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。 5,再在吸附柱中加入500ul漂洗液,12000rpm 室温离心15秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。 6, 12000rpm 室温空离心1分。实实 ，可以改用去离子水洗脱。但是室所用水一般实实实实实实实实实pH偏低,可利用NaOH适当高其实实实pH 实,以增加洗脱得率。 洗脱物含有残留的乙醇会影响后切实实实实实实实实实实实实实实实实 实实实实实实实实实实实实实实,确保底去除漂洗冲液, 7,将吸附柱放入一个干的实实1.5ml的离心管中,在吸附膜中央加入30ul洗脱冲液,室温静置实实实实实实实实2分后,实实实 12000rpm 室温离心1分，提高回收效率可再洗脱一次,,将实实实实实实实实实实实实实实实实实实1.5ml离心管(DNA)实存于-20?。 8,脂糖凝胶泳回收物。实实实实实实实实实实实实实实 ，不可以使用更小洗脱体，小于明提供的最小实实实实实实实实实实实实洗脱体,行洗脱以提高度,因明提实实实实实实实实实实实实实实实实实实 供的最少洗脱体是能完全覆盖吸附膜的最小实实实实实实实实实实实实实 体,若减少体不能将实实实实实实实实实实实DNA完全洗脱下来。 实实实实实实实实实实实实实实实实实实实泳只有一条目的,可以用凝胶回收 实实实实实实实实实实实实实实实实实实实盒。如果后片段度要求高,建即使 只有一条,也可以切胶化,其回收得到实实实实实实实实实实实实实实实 片段的度可能要比直接回收高一些。实实实实实实实实实实实实实实 实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实脂糖凝胶胶不溶可能是下述原因:脂糖量不好,含目的片段的凝胶再空气中放置久,实 实实实实实实实实实实使胶失水、干燥,建切 胶后立即行回收或将胶保存在实实实实实实实实实实实4?或-20?,制胶的泳冲实实实实液度高或旧。,实实实实实实实实 五、注意事:实实 ,切胶实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实快速操作,在紫外灯下容易害到眼睛, ,实实实实实实化乙染色后的DNA易受紫外光破坏,故尽量放置于暗室, 切使用实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实波紫外灯,切胶尽量短。 ,胶一定要实实实实实实实实实实实实实实实实实充分融化,否将会重影响DNA的回收率。 ,把洗脱液加,使用有利于提高洗脱液效率。实实实实实实实实实实实实实实实实 & 提高胶回收量的法:实实实 1) 增加泳的上量。实实实实实实实实 2) 实实实实实实实实实实实泳冲液用新配制的。 3) 胶尽量只切有条的胶,减小切胶体:实实实实实实实实实实实实实实实实实实 含目的片断很少的胶就不要了,不然影响回收率。 4) 把切的两或多胶实实实实实实实实实实实实实实实实融化后,无多大的体都用一个管子,移到同一个柱子上。实实实实实实实实实实 5) 溶胶所加的溶液可多一点,更有利于实实实实实实实实实实实实实实实实实DNA与膜的合,实实不一般不要多于实实实实实实实750ul。 6) 胶回收的是通柱子的溶液的度、酸实实实实实实实实实实实实实实实实 碱性，实实实实实实实实荷,和疏水性使DNA与柱子合,因实实实实实实实实实实实实实此,若泳冲液的PH偏高,可在溶胶液中加入10ul，PH 5.0,3mol/L的 NaAC,,实了使DNA分子更好的 实实实实实实实实实实截在膜上,可以添加30,异丙醇在加溶实实解胶后的液体里。 7) 加洗脱液之前,将柱子在室温放置几分，大实实实实实需10分,,实实以使乙醇充分。实实实 8,最后少加些洗脱液,尽量减少回收体,一般用实实实实实30-50μl洗脱液洗脱，不能太少,否实实实实实实实实实实实实实实实实实实实实无法浸湿膜反而不利于洗脱,,洗脱液滴在膜中央,以充分洗脱合在实 膜上的DNA。 9) 可以在加入洗脱液之后,可以在55度水浴5分或放在实实实实50度水浴10分以上再洗脱,或用实实实实实实实实实实实实实实封口膜密封4度实实实实实实夜,第二天再离心回收,效果不。实实 10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱,再次离心。