灯盏花乙素苷元离解常数和油水分配系数测定

灯盏花乙素苷元离解常数和油水分配系数测定 灯盏花乙素苷元离解常数和油水分配系数 测定 第33卷第5期 2010年lO月 云南中医学院 JournalofYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine Vol_33No.5 lO.2OlO 灯盏花乙素苷元离解常数和油水分配系数测定 张伟,荣娜娜.,催文博.,杨兆祥 (1.昆明制药集团股份有限公司药物研究院,云南昆明650100; 2.昆明医学院,云南昆明650500;3.大理学院,云南大理671003) [摘要]目的:通过高效液相色谱(HPLC)研究了灯盏花乙素苷元的离解常数和油水分配系数.方法: 利用待测组分的保留因子(k值)与流动相的pH值,导出了pH—k的曲线方程,并通过曲线拟合软件求出拐点 即是灯盏花乙素苷元的离解常数.采用振荡一液相色谱法测定了灯盏花乙素苷元的油水分配系数.结果:HPLC 对灯盏花乙素苷元离解常数的测定中k—pH曲线符合s型数理模型,灯盏花乙素苷元的油水分配系数在水相pH 3.0—8.0范围内不随pH变化而变化.结论:用所建立的方法分别测定了灯盏花乙素苷元的离解常数和油水分 配系数,HPLC法准确度高,重现性好,方便简单,快速,准确. [关键词]灯盏花乙素苷元;高效液相色谱法;离解常数;油水分配系数 中图分类号:R284文献标志码:A文章编号:1000--2723(2010)05--0028-'o5 灯盏花,又名灯盏细辛,系菊科植物短葶飞蓬 Erigeronbreviscapus(Van.t)Hand—Mazz的干燥全 草?J.性寒,味苦,微辛,具有散寒解表,祛风 除湿,活络止痛之功效.临床主要用于治疗脑 血栓形成,脑栓塞等脑血管意外所致完全性及不全 性瘫痪.其主要有效成分为灯盏花素(breviscap— ine),以灯盏乙素(scutellain)一4,5,6一三 羟基黄酮一7一葡萄糖醛酸苷为主(占80%以上), —0一葡萄糖 还包括少量灯盏花甲素(芹菜素一7 醛酸苷).灯盏花乙素苷元(Scutellarein)的化学 结构是是5,6,7,4一四羟基黄酮,与灯盏花乙素 的区别在于7位羟基上未接葡萄糖醛酸.结构式见 图1. H H 图1灯盏花乙素苷元结构式OH 目前,临床上使用的灯盏花制剂,其有效成分 是灯盏花乙素,葛庆华等对灯盏花乙素在犬体内的 28 药动学和绝对生物利用度进行了研究,发现灯盏花 乙素体内消除迅速,不适于静脉注射给药,且口服 制剂的生物利用度极低,几乎不吸收L6J.灯盏花 乙素在大鼠胆汁中的代谢产物研究【结果发现, 中间产物灯盏花乙素苷元是灯盏花乙素吸收的主要 形式.此外,在对灯盏花乙素苷元代谢产物的研究 中发现,灯盏花乙素苷元口服吸收后在体内主要转 化成灯盏花乙素. 本文针对灯盏花乙素苷元的基本理化性质,采 用pH高效液相色谱法测定了灯盏花乙素苷元的离 解常数.采用振荡一液相色谱法测定了灯盏花乙素 苷元的油水分配系数. 1仪器与试药 美国Agilentl200高效液相色谱仪,包括 G1322A真空脱气机,G1311A四元梯度泵, G1329A自动进样器,G1316A柱温箱,G1315D二 极管阵列器,Chemstation化学工作站.Luna 5uC18150×4.6mm色谱柱.雷磁pHS一3C酸度 计灯盏花乙素苷元对照品:昆明制药集团股份有限 公司药物研究院制备,含量99.5%.尿嘧啶对照 ,含量99.5%.甲醇,四氢呋喃为 品:FMC公司 色谱纯,磷酸,磷酸氢二钠,氯化钠,正辛醇为分 析纯.水为重蒸馏水. 收稿日期:2010—07—05修回日期:201O—08—30 作者简介:张伟(1973,),男,云南昆明人,高级工程师,主要研究方向:新药研发,药物 分析. 第5期张伟,等:灯盏花乙素苷元离解常数和油水分配系数测定 试验用容量仪器均经过校正符合一,二等品. 2实验原理 pH高效液相色谱法的原理是:有机酸或生物 碱经同一色谱柱中洗脱,但每次洗脱时,所使用流 动相都用不同pH值缓冲溶液调配.这样即可得到 一 系列t值,用尿嘧啶测定死时间t.,再根据物 质保留因子值与t值的关系求出k值.然后用 值和对应的pH(pOH)值作图,就可得到该物质 的k—pH(pOH)曲线.依此曲线采用恰当的数理 模型拟合,并求出该曲线的拐点,即二阶导数为零 所对应pH,就可求得该物质的离解常数.原理如 表1[73. 3实验部分 3.1pH—HPLC测定灯盏花乙素苷元的离解常数 3.1.1色谱条件 用十八烷基键合硅胶为填充剂;以甲醇一四氢 呋喃一不同pH缓冲溶液(35:10:55)为流动 相;分别在336nm和259nm检测,流速为1mL/ min,进样量为1I,理论板数按灯盏花乙素峰计 表1pH—HPLC原理 相关说明pH高效液相色谱法原理 分配系数 分配系数与保留时间的关系 分配系数与保留体积关系 容量因子与保留时间关系 一 pH关系式 k=Cs/Cm tR=f.[1+(Vs/Vm)] = [I+k(Vs/Vm)] t=t0(1+JI.) =aka/(ka+[H]) 注:cs:样品组分在固定相中的浓度;Cm:样品组分 在流动相中的浓度;t:不被固定相吸附或溶解的组分的保 留时间即死时间;Vo:未被固定相所占有的空间即死体积; :在色谱柱中固定相所占有的体积;:在色谱柱中流 动相所占有的体积;k.:未离解酸的分配系数, 算应不低于5000.柱温控制在35?.检测图见图 2,3. 不同pH流动相的配制:试验设汁缓冲溶液的 pH范围为2.00—9.00,此范围的缓冲溶液用 0.1%磷酸和0.01mol/L的磷酸氢二钠混合配制, 图2灯盏花乙素苷元HPLC色谱图 f 0 图3尿嘧啶HPLC色谱图 4 29 =三?舯钔加0 云南中医学院第33卷 各缓冲液中分别加入一定量的50mmo~L的氯化钠 以控制离子强度,每一种缓冲液的pH值用酸度计 检测,准确度为0.02pH单位. 3.1.2pH—HPLC测定灯盏花乙素苷元的离解常 数方法 取灯盏花乙素苷元适量,精密称定,置于 50mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,制成 0.1mg/mL的溶液,即得灯盏花乙素苷元的对照 液.取尿嘧啶适量,精密称定,置于50mL容量瓶 中,用水加热溶解并稀释至刻度,制成0.1mg/mL 的溶液,即得到尿嘧啶对照液.按照规定的色谱条 件,分别精密吸取灯盏花乙素苷元对照液和尿嘧啶 对照液各1L,注入液相色谱仪测定,即得到灯盏 花乙素苷元的保留时间t和尿嘧啶的保留时间t. (即死时间),从而求得容量因子k,然后再以pH — k作图,并利用合适的数理模型求得灯盏花乙素 苷元的离解常数,结果见表2,3,图4. 利用拟合曲线方程进行二阶求导,可以求出 p. HPLC法测定离解常数pk.=6.54189. 利用拟合曲线方程进行二阶求导,可求出. HPLC法测定灯盏花乙素苷元离解常数pk=6.54. 表2pH一七表 表3Lo~stic数理模型拟合pH一图 3.2pH—HPLC测定灯盏花乙素苷元的油水分配 系数 3.2.1色谱条件 HPLC测定灯盏花乙素苷元的离解 参照pH— 常数的色谱条件,其中缓冲溶液采用0.1%磷酸水 溶液.但油水分配系数的测定是定量实验,进样量 为10L. 30 DH ?实验点一拟合曲线 图4Logistic数理模型拟合pH—k图 3.2.2不同pH条件流动相的配制 实验缓冲溶液的pH范围为3.0—9.0,此 范围的缓冲溶液按《中国药典》2005年版二部附 录XVD配制,经测定pH值为3.o0,3.50,4.00, 5.00,6.00,6.50,7.00,8.00,9.00.然后将不 同pH值的缓冲液与正辛醇按1:1的比例混匀, 分别饱和4,5h,再用分液漏斗萃取,所得上层溶 液为正辛醇,下层溶液为不同pH值的缓冲液. 3.2.3线性关系考察 精密称取灯盏花乙素苷元对照品适量,用甲醇 溶解并稀释制成0.2mg/mL的对照品溶液.精密称 吸取对照品溶液5,7,lO,12,15,20L,注人 液相色谱仪,以对照品进样量(g)为横坐标, 峰面积积分值为纵坐标,绘制曲线,计算回归 方程.异可利定和普罗托品的回归方程分别为: Y=40310x一269331r=0.9998 第5期张伟,等:灯盏花乙素苷元离解常数和油水分配系数测定 结果表明灯盏花乙素苷元在1txg,4txg范围内 线性良好. 3.2.4pH—HPLC测定灯盏花乙素苷元的油水分 配系数方法 取灯盏花乙素苷元适量,精密称定,置于 25mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配制 成浓度为0.4mg/mL的溶液作为母液.精密量取一 定量的母液置于10mL的容量瓶中,分别用3.00, 3.50,4.00,5.00,6.00,6.50,7.00,8.00, 9.00的等不同pH缓冲液,稀释至刻度,摇匀作为 供试液,按照规定的色谱条件,用注射器吸取溶液 10.01xL,经0.45微米微孑L滤膜过滤,注入高效液 相色谱仪检测. 精密量取各供试液适量与被饱和过的正辛醇置 于具塞试管中,实验前蒸馏水和正辛醇分别用正辛 醇和蒸馏水饱和.将具塞试管放人恒温振荡器中, 于37?振摇4h平衡,再以4000r/min离心10min, 使两相分离,取下层水溶液10.01xL,经0.45m 微孔滤膜过滤,注入高效液相色谱仪检测.两者之 差为灯盏花乙素苷元在正辛醇中的浓度也就是在油 相中药物的浓度,并按下式计算油水分配系数: Po/=C~/C, 式中P为油水分配系数;C正辛醇为分配后油 相中的药物浓度;C为水相中的药物浓度;然后 根据数据计算出logP的数值,做出一个曲线, 横坐标为pH值,纵坐标为logP的数值.通过结 果,我们可以看到灯盏花乙素苷元的油水分配系数 随pH的变化关系.结果见表4,图5. 结果表明,灯盏花乙素苷元在正辛醇一缓冲溶 液中的分配系数受溶液的pH值影响不大.pH在 3.0,8.0范围内,灯盏花乙素苷元的油水分配系 数P为0.99,logP趋近于零.表明:灯盏花乙 素苷元具有较好的亲脂性,透过生物膜的性能较 好,是灯盏花乙素在体内的主要吸收形式,故灯盏 花乙素苷元在体内的生物利用度较高. 4讨论 pH—HPLC法测定离解常数的关键在于:(1) 虽然准确配制了pH值不同的缓冲溶液,但由于固 定相十八烷基键合硅胶中的硅胶显弱酸性,所以需 要花较长时间平衡色谱柱,方可进样;(2)加人 离子强度调节剂;(3)流动相中有机溶剂与缓冲 溶液的比例应恒定. 表4pit—P表 5678g oH pH—logPo/w图 pH—HPLC法测定离解常数中,由于测定的是 流动相混合前的水溶液时pH值,严格地讲不能代 表混合后流动相的pH值,但是又由于含有机溶剂 的流动相pH难测定准确,经过比试实验流动相混 合前后pH值差别,混合后的pH变化范围不大, 可忽略. 油水分配系数的测定方法有很多,如摇瓶法, HPLC法等,本实验采用振荡一高效液相法.正辛 醇极性与多数有机体液的极性相差不大,其溶解度 参数与生物膜的溶解度参数一致,可以选用正辛醇 作为模拟生物膜相的有机溶剂,故本实验中采用正 辛醇一水体系.药物在正辛醇一水体系的分配系数 不等于药物在正辛醇中的溶解度和在水中的溶解度 之比.因为体系的有机相不是纯正辛醇,水相也不 是纯水,两相平衡时有机相含少量水,水相中含少 量正辛醇.因此,先用纯水饱和正辛醇,避免实验 过程中伴随正辛醇与水的分配过程. 31 2010钲云南中医学院第33卷 本实验测定了灯盏花乙素苷元的油水分配系 数,结果表明:不同pH的缓冲溶液对灯盏花乙素 苷元的油水分配系数的影响较小.体内胃肠道pH 值范围在1.4,8,本实验设计缓冲溶液的范围是 3.0—8.0,是为了较好的模拟生物体,故可初步认 为灯盏花乙素苷元在整个胃肠道均有较好的吸收. [参考文献] [1]徐莲英,毛展凯,叶娇云,等.灯盏花素的理化性质 及其稳定性影响因素研究[J].中国中药杂志2009, 04. [2]薛王景,贾晓斌,谭晓斌,等.雷公藤甲素表观油水 分配系数的测定及其对吸收预测的研究[J].中国药 学杂志,2009,20(44):156o一1563. [3]林春,刘鸿高,余选礼,等.药用植物灯盏花的研究 进展[J].中国野生植物资源,2003,22(1):8一 j1 [4]中国药典.一部[S].1977:245. [5]卫生部药品标准.中药成方制剂.[S].1990:103. [6]GEQH,ZHOUZ,ZHIXJ,etal1Pharmacokineticsand absolutebioavailabilityofbreviscapineinBeagledogs[J] 1ChinJPharm(中国医药工业杂志),2003,24(12): 6182—6201. [7]ZHANGJL,CHEQM,LIsZ1Studyonmetabolismof scutellarininratsbyHPLC2MSandHPLC2NMR[J]lJ NaturalProductsRes,2003,5(4):2492—2561 [8]葛庆华,周臻,支晓瑾,等.灯盏花乙素在犬体内的药 动学和绝对生物利用度研究[J].中国医药工业杂 志,2003,34(12):6181 [9]ZhangJL,CheQM,LiSZ1StudyONmetabolismof scutellarininratsbyHPLC2MSandHPLC2NMR[J]1J NatProd,2003,5(4):2491. (编辑:迟越) DeterminationofDissociationConstantand0i1/waterPartitionCoefficientofScutellarein ZHANGWei,RONGNa—Ha,CUIWen—bo., YANGZhao—xiang (1.InstituteforDrugResearchandDevelopmentofKunmingPharmaceuticalCorporation, KunmingYunnan650100,China;2.KunmingMedicalCollege,KunmingYunnan650031,China; 3.DaliUniversity,DaliYunnan671003,China) [ABSTRACT]Objective:Tostudythedissociationconstantandoi1/waterpartitioncoemcie ntofscut~lla. reinbypH— chromatography.Methods:Thedissociationconstantofscutellareiniscalculatedrespective lyfromthe retentionfactors—pHofmobilephaseinthepH— chromatography;Aoscillatemethodwasestablishedtodetermine n—octanol/waterpartitioncoefficientofscutellarein.Results:rI'hecurveofpH— chromatographyshowedtobe suitableforLogisticfit:ThepH3.0— 8.0ofbuffersolutionhadnoinfluenceonthedistributioncoemcientof scutellarein.Conclusions:pH— chromatographycanbeusedtodeterminethedissociationconstantofscutellarein accurately:Theoscillatemethodcanbeusedtodeterminetheoil/waterpartitioncoefficientof scutellarein. 1KEYwoItDSIscutellarein;HPLC;dissociationconstant;oil/waterpartitioncoemcient . H.H.H.H'HH' 山- 丰欢叩—/ q.}_{.}_{.}_{.}_{.}{.}_{. 32 中医学院 :64—43 唧;..工.工.}{.工.工.I.}_{.}_ 》 艮*者*一学一