4第三章、食品微生物检验的指标

4第三章、食品微生物检验的指标 30 食品卫生检验 第三章 食品微生物检验的指标 （1学时） 第一节 菌落总数 第二节 大肠菌群MPN 第三节 致病性微生物 黑龙江八一农垦大学食品学院 2005年2月22日 1 黑龙江八一农垦大学食品学院 王长远 助教 食品工程与科《食品卫生食品卫生检验 学 检验学》是食品 科学与工程的食工2003 食工2003（3） 选修课程。以食2004-2005 55 品的腐败变质第二学期 与控制、食品微 2 30 生物指标、食物 中毒微生物的20 10 检验、常见病原 食品微生物检验（刘兴友） 微生物的检验 为主要内容。 《食品卫生微生物检验手册》 《食品安全与卫生学》 第三章 食品微生物检验的指标 章节号 名称及内容 重点和难点 第三章 食品微生物检验的指标 细菌总数、大肠菌群MPN、致第一节 菌落总数 病性微生物卫生学意义及常规检 一、菌落总数的概念及卫生意义 验方法 二、菌落总数的常规检验方法 三、菌落总数的其它检验方法 第二节 大肠菌群MPN 一、大肠菌群MPN的概念及意义 二、大肠菌群MPN的常规检验方法 三、大肠菌群MPN的其它检验方法 第三节 致病性微生物 一、食品中常见的致病性微生物 1、能引起食物中毒的致病性微生物： 2、能产生毒襄并引起食物中毒的微生物： 二、食品中致病性微生物的检验 2 1 绪 论 1 微生物检验基本知识、常规鉴定技术 1 食品检验样品的采集与处理 1 食品微生物检验指标 8 食品中毒性微生物的检验 2 常见病原微生物的检验 2 肉与肉制品中的微生物及其检验 2 乳与乳制品中的微生物及其检验 2 罐头食品中的微生物及其检验 2 其它食品中的微生物及其检验 3 （1学时） 第三章 食品微生物检验的指标 使学生掌握食品检验的各项指标； 1）细菌总数 2）大肠菌群MPN 3）致病性微生物 细菌总数、大肠菌群MPN、致病性微生物卫生学意义及常规检验方法 第三章 食品微生物检验的指标 第一节 菌落总数 主要通过讲 授和演示等方式 一、菌落总数的概念及卫生意义 进行；采用先提 二、菌落总数的常规检验方法 问，引导学生探 索，并逐步得出三、菌落总数的其它检验方法 结论，互动式与第二节 大肠菌群MPN 启发式并用，讲 练结合，注重理一、大肠菌群MPN的概念及意义 论与实践的结二、大肠菌群MPN的常规检验方法 合。 三、大肠菌群MPN的其它检验方法 第三节 致病性微生物 一、食品中常见的致病性微生物 1、能引起人类疾病和食2、能产生毒襄并引起食物中毒的微生物： 物中毒的致病性微生物： 二、食品中致病性微生物的检验 4 食品在食用前的各个环节中，被微生物污染往往是不可避免的。评价食品被微生物 污染的程度，要采用微生物检验指标采进行。常采用的微生物检验指标为三项细菌指标， 即细菌数量(主要是菌落总数)、大肠菌群最近似数(MPN)和致病菌。 食品中细菌数量越多，则食品腐败变质的速度就越快，甚至可引起食用者的不良王 应．如有人认为细菌数量达到100—1000万个／g时食品就可能引起食用者的食物中毒。 菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数 以万计相同的细菌集合而成。 细菌数量的示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：菌落总数和细菌总数： 1、菌落总数 指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形 2成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。通常以lg或1ml或lcm 样品中所含的菌落数量来表示。 按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37?培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌， 由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的 所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌 数等。 2、细菌总数 指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计 数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常 2以1g或1m1或lcm—样品中的细菌总数来表示。 菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过 程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一 定程度上标志着食品卫生质量的优劣 菌落总数的常规检验方法(GB4789．2-84)： 5 一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出 1mL臵于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为 48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。 基本操作一般包括：样品的稀释——倾注平皿——培养48（24）小时——计数。 1．操作方法： 1）、以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的 灭菌玻璃瓶内（瓶内预臵适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好臵灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 2）、用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。 3）、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释 一次即换用1支1ml灭菌吸管。 2．无菌操作： 操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、 镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后 取样。 操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。 3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固 体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。 4．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食 品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。 1．操作方法： 1）、根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍 6 递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做 两个平皿。 2）将凉至46?营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将 营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 3）、待琼脂凝固后，翻转平板，臵36?1?温箱内培养48?2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 2．倾注用培养基应在46?水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于 凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。 倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌 落混淆而影响计数观察。 3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混 匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过 20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。。 4．培养温度一般为37?（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采 用30?）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。 5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨， 可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4?环境中放臵，以便计数时作对照观察。 在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯 四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。 1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要 时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均 菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。 2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放臵于0－4?， 但不得超过24h。 3．计数时应选取菌落数在30－300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30－300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小 7 于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平 均数报告）。 4．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数 乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。 如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。 5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数 应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现 象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应 作为检样计数报告的依据。 6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则 应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要 把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状 菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可 取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。 8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1－100时，按实有数字报告，如 大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g) 2为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。 还有涂布平板法、点滴平板法、螺旋平板法。螺旋平板法是由一台机器完成的。 1、涂布平板法 是将营养琼脂制成平板、经50?1—2小时或35?18～20小时干燥后，在上面滴加 检样稀释液0.2ml，用“L”棒涂布于整个平板的表现，放臵约10分钟，将平板翻转，放至36+1?温箱内培养24?2小时，（水产品用30C培养48?2小时)取出，进行菌落计数，然后乘以5(由0．2ml换算为1ml)，再乘以样品稀释液的倍数，即得每克或每升检 样所含菌落数。 这种方法比常规检验法效果好。因为菌落生长在表面，便于识别和检查其形态， 8 虽检样中含有食品颗粒，也不会发生混淆．但是本法取样量比常规检验法少。代表性会 受到一定影响。 2．点滴平板法 与涂布平板法相似。不同的是点滴平板法只是用标定好的微量吸管或注射器针头按 滴(使每滴相当于0．025m1)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域(预先在乎板背 面用标记笔划成四个区域)．每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。 滴加后，将平板放平约10分钟，然后翻转平板，如涂布平板法+样移入温箱中，培养6 —8小时后进行计数，将所得菌落数乘以40(由0．025m1换算为1ml)，再乘以样品的稀释倍数，即得每克或每毫升检样所含菌落数。 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一 属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清 学方面并非完全一致。 大肠菌群系指一群在37度能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴 性的无芽胞杆菌。 从种类上讲，大肠菌举包括许多生化及血清学特性均很不相同的细菌，其中有埃 希氏菌属，枸椽酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等．以埃希氏菌属为主，大肠菌群 MPN是指在100ml(或100g)食品检样中听含的大肠菌群的最近似或最可能数。 ?和肠道致病菌的来源相同，并且在相同的来源中普遍存在和数量甚多，以易于检 出。 ?在外界环境中的生存时间与肠道致病菌相当或稍长。 ?检验方法比较简便。 人们通过大量研究发现，大肠菌群在数量和检验方面均符合指示菌的三项要求，因 此，用大肠菌群作为标志食品是否已被肠道致病菌污染及其污染的程度的指标菌是合适 的。大肠菌群作为食品的指示菌即是说：在食品中存在的大肠菌群数量越多，表示该食 品受粪便污染的程度越大，也就相应地表示该食品被肠道致病菌污染的可能性也就越 9 大。 1）大肠菌群MPN 大肠菌群MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似 数值； 2）大肠菌群值。 大肠菌群值是指在食品中检出一个大肠菌群细菌时所需要的最少样品量。 故大肠菌群值越大，表示食品中所含的大肠菌群细菌的数量越少，食品的卫生质量 也就越好：在这两种表示方法中，目前国内外普遍采用大肠菌群MPN，而大肠菌群值逐渐趋于不用。 大肠菌群MPN常规的检验方法有三管系列、五管系列和其它系列，其原理相同， 区别在于样品滴度和各滴度的管数，三管系列接种三个滴度、每个滴度三管、五管系列 接种五个滴度、每个滴度五管。以三管系列较为简便。 我国现有两个大肠菌群检测标准，一个是国家标准(GB4789．3-84)，另一个是专业标准(ZBX09002-86)。 大肠菌群MPN的常规检验方法是将不同倍数的检样稀释液接种到乳糖胆盐发酵管 内，经一定的温度、时间发酵，若均不产气者则可报告为阴性；如有产气者，则需进行 分离培养，证实试验，然后查取MPN检索表，报告出每100nll(g)大肠菌群的最近似数。大肠菌群MPN的检验程序如下： (1)以无菌操作将检样25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水或其它稀释液的 灭菌玻璃瓶内(瓶内预臵适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作 成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用匀质器。以8000-10000转／分钟的速度处理1 分钟，做成 1：10的均匀稀释液。 (2)用1ml灭菌吸管吸取1：10稀轻液1m1．注入含有9ml灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀．作1：10的稀释液。 (3)另取1m1灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次， 10 换用 1支1m1灭菌吸管： (4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释 度接 种3管。 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒 还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠 菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。 如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁 上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管； 1m1及1m1以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，臵36+1? 温箱内，培养24+2小时，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。 如有产气者，按下列程序进行。 将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板上，臵36?1?温箱内培养18—24小 时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1—2个进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵 管，臵36?1?温箱内培养24+2小时，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气、革兰氏 染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 根据证实为大肠群阳性的管数，查MPN的检索表(见附录一)，报告每100ml(g) 大肠菌群的最近似数(MPN)。 大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、 孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准 中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。 抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对 大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。 11 大肠菌群MPN的其他测定方法有琉水网膜法、TTC（2、3、5、—氯化三苯四氮唑）显色法，DC(去氧胆酸钠)半固体法、纸片法等。 疏水网膜法是1974年加拿大的Sharp AN博士等人首次撰文介绍的，该方法最初 只能检验水中的大肠菌群和大肠杆菌，现在则几乎可检验所有食品中的细菌，如沙门氏 菌等。 TTC显色法使用的是含有TTC(2、3、5一氯化三苯四氮唑)的乳糖发酵培养基，接种方法和MPN的三管法相同，接种后于36?1?培养18—24小时。观察TTC乳糖培养基呈色和产气情况判定大肠菌群。按表4-2标准进行判定。 ， （1）选择三个稀释度的样品液，每个稀释度分别取1ml放入灭菌试管中。 (2)将溶化并冷至50?左右的DC半固体培养基加入上述试管中，每管3m1。立即混合)，凝固后于37?培养18－24小时。 (3)判定标准和记录： a培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂。记录为?； b培养基为桔红色，或有桔红色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为十； c培养基为绿色，有黄色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为?； d培养基为绿色，记录为—。 ’ (4)判定为a、d反应结果；记录阳性管数，查MPN表并报告之。若为b、c反应结果，可挑大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管，根据产酸产气管数查MPN表，并报告之。 食品首先是应考虑其安全性，其次才是可食性和其他，食品中一旦含有致病性微生 物，其安全性就随之丧失，当然其食用性也不复存在了；各国的卫生部门对致病性微生 物都作了严格的规定，把它作为食品卫生质量的最重要的指标。 食品生产是一个时间长、环节多的复杂过程。总之，与食品有直接和间接关系的 12 致病性微生物都可能污染食品。（以乳制品为例） 1、能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物： 等。 2、能产生毒襄并引起食物中毒的微生物： 。 1、致病性微生物的检验 按照国家统一的方法进行检验。 2、特例： 在加工食品中能够存活下来的致病性微生物注往受到了某种程度的损伤，它们会受 到增菌液中抑制剂的影响而不能被检测出来。因此，需要进行前增菌，以帮助致病菌恢 复到正常状态。前增菌的适宜方法和使用的培养基则因食品的理化性质、加工方法不同 而异。 以检验沙门氏菌为例，干蛋品中的细菌用缓冲蛋白胨水进行前增菌，脱脂乳粉中的 细菌用煌绿水进行前增菌，全脂乳粉则用灭菌蒸馏水进行前增菌，椰子用乳糖肉汤，干 酵母用胰酪胨大豆肉汤前增菌。 1、细菌相：指存在于某一物质中的细菌种类及其相对数量的构成。 食品中的各种细菌就构成了该食品的细菌相，水中的细菌构成了水的细菌相。细菌 相是对细菌的种类面言，在菌相中相对数量较大的一种或几种细菌被称为优势菌。 2、嗜冷菌：这类细菌在接近0?时生长得比较好，最适温度为10?一20?，最高温度在30?一35?。 3、嗜温菌：这类细菌都能在25?气40?迅速生长，在55?不生长。 4、嗜热菌：这类细菌生长范围为43?～75?，最适为50~C一55~C，在32C以下很难生长。 嗜温菌和嗜热菌的一些细菌在生长温度范围上有重迭，产生芽胞的细菌尤其如此。 主要是嗜温菌，包括大肠菌群、肠球菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌和沙门氏菌等。 13 新鲜肉类的细菌相以嗜温菌为主，在温度适宜时，嗜温菌会大量繁殖造成肉的变质， 同时发生臭味；在冷藏条件下，嗜温菌生长很慢甚至不生长，嗜冷菌开始大量繁殖，逐 渐成为优势菌，最后会导致肉表面形成粘液并产生气味；在冷冻条件下，所有的细菌都 不再生长繁殖，因而可以较长期保存而不变质。 主要是革兰氏阴性菌，包括假单胞菌属、产碱杆菌属、变形菌属和埃希氏菌属等。 以嗜冷菌为主，有假单胞菌属、黄色杆菌属和弧菌属等。 如在水产品中发现了沙门氏菌，一般认为是外来污染，应对该产品的生产，加工过 程进行分析、检测，从而找到污染源。 食品及原料都有正常的细菌相，它们因受多种因素的影响，其种类和数量有很大 差别。 3 1、鲜肉的细菌相以嗜温菌为主，其次为嗜冷菌。加工良好的鲜肉细菌数为10个 634／g左右，如加工不良会达到10个／g，肉制品的细菌数约为10—10个／g，大肠菌群 22MPN为10—10个／100g，金黄色葡萄球菌为10--10个／g。 2、鲜蛋的细菌相以革兰氏阳性球菌为主，革兰氏阴性杆菌数量很少。 3、液体蛋晶的细菌相是革兰氏阴性菌，包括假单胞菌属、产碱杆菌属、变形菌属 4635和埃希氏菌属，细菌数量一般为10～10个／g，大肠菌群为10～10个／100g，沙门氏菌为1—100个／g。 14