抗CD3基因工程嵌合抗体IgG在哺乳动物细胞中的表达和活性测定
抗CD3基因工程嵌合抗体IgG在哺乳动物
细胞中的表达和活性测定 抗CD3基因工程嵌合抗体IgG在哺乳动物细胞中的表达和活性测定 邵晓枫徐展许元富熊冬生刘银星杨纯正
(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室.天津3oo02o)
擅要剃用基因工程方法将鼠源性扰CD3抗体HIT3a的可变区和入源抗体(Igc)的完整的恒定区连接起来.构建
全抗型抗CD3嵌合抗体,该型抗体具有较低的免疫源性可作为免疫抑制剂应用于器官移植.减少受体产生免疫捧
斥,提高移植器官的存活率.利用PCR方法从抗CD3ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB5E上扩增抗c抗体的
轻链和重链可变区.将轻链和重链可变区组装到古有人抗体(1gc)恒定区的表达载体中,构建抗CD3嵌合抗体Il;G
的轻链和重链表达载体PKN100和PGID105.并用脂质体法共转染ClIO细胞.结果
.抗c嵌合抗体的vI和
VH与HIT3a抗体的V和V完全相符.ELISA和Westernblvl检测结果证实转染细胞的培养上清中含有抗cDl嵌合
抗体IgG的表达.表达产物能与Jvrkat细胞结合.并能竞争性抑制H1T3a抗体和Jurkat细胞结合活性.'t1.TdR掺入实
验表明,抗CD3嵌合抗体与亲代抗体HIT3a?样,具有促进外周血单核细胞增殖的作用.我室构建的全抗型抗
CD3嵌合抗体分子表达载体可在CHO细胞中稳定表达.表达产物有较好生物活性,具有潜在的l临床应用价值.
美?词基因工程抗体.抗CD3抗体.嵌合抗体
中圈分类号R392文献标识码A文章铺号1000-3061(2003)Q5—0527—05 单克隆抗体以其高度的抗原结合特异性而倍受
研究者关注,但它自身的免疫原性又阻碍了在临床 的大量应用.本实验研究目的在于利用基因工程方 法将鼠源性抗CD,抗体HIT3a的可变区和人源抗体 的完整的恒定区连接起来,构建成抗CD3嵌合抗体 IgG全分子.以降低鼠源性抗体的免疫原性,发挥抗 体分子Fc端的生物学效应,可诱导免疫耐受有效防 止排斥反应.提高器官移植的存活时间和改善实验 性自身免疫疾病的病情.近年来,许多实验证明小剂 量CD3抗体在体内外具有活化T细胞的作用.生成 的CD3AK细胞在内外可有效杀伤肿瘤细胞?l. HIT3a是由我所免疫室制备的一株能分泌较高活性 抗CD3鼠源单抗【4],在此基础上我们设计构建了抗 CD3嵌合抗体的不同片段,本文构建的人源化抗 CD3嵌合抗体载体.在CHO(dhfr.)细胞中实现了稳 定分泌表达.其表达产物可与CD,的Jurkat细胞特 异性结合,保持了亲代抗体与抗原特异结合的能力. 在器官移植和肿瘤治疗上都具有良好的应用前景. 1材料与方法
1.1细胞与试剂
CHO(dlffr一)细胞由军事医学科学院微生物漉 行病研究所王海涛教授惠赠,培养在含有lit和 l0%的透析胎牛血清(Hyclono)的IMDM培养基 (GIBCOBRL)中,Jurkat细胞由本室保存,培养在 RPMRl64o培养基(GIBCOBRL)中.Plastr~dMiniKit
(QIAGEN公司),Lipofectamineplusreagent试剂盒和 Trizol试剂盒.PLATINUMDNAPMymeraseHigh
Fidelity,M—MLV逆转录酶,T4DNA连接酶,限制酶 BarnHI,HindUI(GIBCOBRL).Nitrocellulose膜(Phar— macia).ProteinA(GIBCOBRL),羊抗人Fc抗体,HRP
标记的羊抗人.c链抗体(晶美生物工程公司),羊抗 人IgG.FITC(鼎国生物试剂公司),羊抗人IHIuP (华美生物试剂公司),HRP.发光试剂盒(PIERCE). HRP标记的羊抗鼠抗体和Hrr3a(中国医学科学院 血液学研究所科技公司).
收罄日期:2003—04-17.謦回日期:2003—06.30. 基金项目:863计划(中试基金国科生字2000141和2001AA215341)和天津重大基
金(No.003119511).
*通讯作者.Tel:86*22.27230740;Fax:86.22-27230740:E-mail:czysag@public.tpt.tj.cn
参加率工作的还有:彭晖.桶馅.朱帧平
一
13—
1.2载体与菌体
抗cD|ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB5E 由本室构建.含有人的轻链恒定区(C)的轻链表
达载体pKNIO0和古有人的重链7恒定区(cH)的重 链表达载体PGlD105.由柬桢平教授馈赠.大肠杆 菌16(;9由本室保存.
1.3引袖
PI5'一CTAGTAGCAACTGCAACFGCACTACATTCA— GACATCGAGCT-3
P25-GATCTAGAAACTCACCA;GTCCCCG—
AGCC.3(BarnHlI)
5一CTAGTAGC从CTGCAACTGGAGTACATTCA- CAGGICACCI一3
P5一TCGAAAcrCAccI?躺AGGAGAc—
GGT-3(BamHI)
5'-GGTCAA丛ATGGGATGGTcATGTATc-
ATCaT不rI?TAGTAGCAACT.3'(胁,ld?) 下划线为酶切位点.
1.4抗clg抗体可变区的克隆及其表达载体的构建 以抗CD,ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB 5E为模板,以Pl和P2为引物进行PCR,扩增抗CD, 抗体VI.基因片段,以P3和P4为引物进行PCR,扩 增抗CD3抗体V基因片段,哺乳动物分泌蛋白的 信号肽序列由引物P5和P2,P5和P4,再次利用 PCR方法.分别加在V和V的5'端.扩增产物V., 和pKNIO0载体用BarnHl和,ld?进行酶切,连 接,构建成抗CD3抗体的轻链表达载体pKc3L;扩增 产物VH和pGlD】05载体用BarnH1和H/rid?进行 酶切,连接,构建成抗CD3抗体的重链表达载体 pGC3H
1.5CHo纲胞的转染及阳性克隆的筛选
CHO(dhfr)细胞的转染采用脂质体转染法,按 试剂
所推荐的方法进行.将载体pKN100. V和pGID105.V共转染cito(dhfr一)细胞,细胞被 转染24h后换新鲜的IMDM选择培养基(含10%的 透析胎牛血清,500mg/L的G418).每4天换一次液, 直至细胞克隆形成.
1.6药袖氯甲碟呤(MTXI的加压培养
将生长稳定的转染细胞系,在选择培养基中加 入10一mol/LMTX,培养23周后继续以lO倍的 MTX浓度梯度加压培养,MTX浓度达到10一mol/I, 血清浓度逐渐减少,直至用无血清培养基培养. 一
14一
1.7r-PCR
参照Trizol试剂盒说明书,提取细胞克隆的总 mRNA,在逆转录酶作用下反转录获得eDNA第一 链,以eDNA为模板,分别以P5和P2,P5和P4为引 物进行PCR扩增VL和VH片段,并进行爵切鉴定, 以验证在CHO细胞克隆中存在抗CD3抗体IgG的 轻链和重链mRNA表达.
1.8ELISA测定抗CD3抗体IgG的裹达
待细胞形成克隆后,收集细胞上清,用夹心 ELISA检测细胞上清中的抗CD3抗体I的表达. 以羊抗人Fc抗体为包被抗体,经1%脱脂奶封闭 后,加入细胞培养上清和不同浓度的标准人IgG, 4?过夜,PBS洗3次后,加入HRP标记的羊抗人,c 链抗体,室温孵育2h,PBS洗3次后,加入OPD底物 液显色,测A.帅值.
1.9抗CD3嵌台抗体IgG与抗原结合活性的蔫定 将浓度为2011g/mL的HIT3a溶液和所收集的 CHO细胞培养上清,加入lxlo6Jurkat细胞4?下孵 育lh.2000r/rain.4?离心lOmin,弃上清.PBS洗细胞 3次,将细胞重悬于3L按效价稀释好的羊抗鼠 IgGoFITC溶液,4~C放置lh,2000drain.4?离心 10min,弃上清,PBS洗细胞3次,FACS溯定Hn3曩结 合Jurkat细胞的阳性率
1.10Western.blot免疫印迹法鉴定扰CllO嵌台扰 体IgG
采用免疫共沉淀的方法,在培养上清中加入 ProteinA使其产生沉淀,用PBS离心洗3次.进行 SDSPAGE电泳及Westernblot免疫印迹.并采用 Folin酚法测定蛋白含量.
1.1lH.TdR掺入促周血单个核细胞增殖试验
分离新鲜正常人外周血单个核细胞.用RP- MI1640完全培养基调整细胞浓度为2xt0*/mL,将 抗cD,嵌合抗体IgG,HIT3a分别配成2ng,, 20rig/it【蓿液,加入96孔细胞培养板中,每孔50pL. 每个浓度设3个平行孔,4?孵育3h,阴性对照加 50/_tL培养基.每孔加入细胞悬液lx10e/50vL, 37c【=,5%CO培养4Oh,加入H.TdR(5~CilmL).每孔 0.5/~Ci.继续培养8h,用细胞收集器将细胞吸附在玻 璃纤维纸上.烘干,依次放入盛有2mL闪烁液的测 量瓶内,液体闪烁仪自动测定样品的放射性,计算 sI,抗CD3嵌合抗体刺激管cpm均值,对照管cpm均 值.
2结果
2.1抗CD3抗体可变区的克隆及其表达载体的构 建和鉴定
以抗CD3ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB 5E为模板,用相应的引物进行PCR扩增反应,扩增 产物和载体经过酶切,连接后,构建成抗CD3抗体 1gc轻重链表达载体pKN100一V和pG1D105-VH(图 1).双脱氧终止法测定显示,克隆的V和V与亲 代抗CD3抗体的V和V完全相符.
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图l抗CD3嵌合抗体表达载体构建流程图 Fig.1Constructionofexpressionvot2tor_订anti—CD3antibody
2.2抗CD3嵌合抗体IgG在CHO细胞中的表达
将纯化的轻,重链表达载体pKN100.vi和
pG1D105,V,用脂质体法共转染CHO【dlffr-)细胞,以 G418(500mg/L)作为选择药物,由于无血清培养基不 含次黄嘌呤和胸腺嘧啶【HT),所以只有同时含有二 氧叶酸还原酶dhfr与I'leO两种基因的细胞才能存 活.经2—3周的培养,细胞形成克隆,RT-PCR的实 验显示,在650bp的CL区和1000bp完整的k链,750 ?一
800hp之间的Fd段,1000bp的区,1700的完整 的重链,结果表明转染的CHO细胞中存在抗CD3抗 体IgG轻链和重链的mRNA(图2),扩增的片段经过 酶切得到的片段大小与预期相符.ELISA检测结果 亦证实细胞培养的上清中含有抗CD3抗体IgG的表 达.
图2抗CD3嵌合抗体mRNA的RT-PCR检测 Fig,2AssayofmRNAPCRofanti-CD3antibody
AI.WholeK曲m:A2.shtchahnCL B1.IleavychainFd:B2.Fe;B3.WholeHchain
2.3竞争性免疫荧光抑制实验
FACS测定结果显示,在无嵌合抗CD抗体存在 的条件下,fffF'3a结合Jurkat细胞的阳性率为 90.92%,而在嵌合抗CD3抗体存在的条件下,HIT3a 结合Jurkat细胞的阳性率仅为4.96%(图3A),表明 表达产物能抑制HIT3a和Jurkat细胞表面CD3抗原 结合,并具有CD3结合特异性.同时为了进一步检 验抗CD3嵌合抗体结合活性,用抗CD3嵌合抗体与 Jurkat细胞直接反应,FACS测定结合阳性率为 88.97%【图3B),表明表达产物与亲代抗体HIT3a 具有一样的结合活性.
2.4抗CID嵌台抗体IgG的鉴定
将培养上清做免疫共沉淀后,进行SDS.PAGE 电泳及Westren.blot免疫印迹后,结果显示,用羊抗 人IgG.HRP反应后,放射显像即得到一条识别带,同 时用人If;G作为阳性对照,在相同位置也有识别带, 而无血清培养基没有此识别带(图4).其表达量为 0.6t-mL培养上清.
2.5抗CD3嵌台抗体IgG体外促外周血单个榱细 胞增殖作用
'H.TdR掺入实验表明,抗CD3嵌合抗体与亲 代抗体HIT3a一样,具有促进外周血单核细胞增殖 的作用【图5).
3讨论
近年来,随着基因工程技术的发展,国内外许多 实验室纷纷对鼠源抗体进行改造,构建小分子抗体 或人.鼠嵌合抗体J.通过基因工程抗体的研翩, 开发和应用,嵌合抗体可保持鼠源抗体的特异性,又 降低了对人体的免疫原性.嵌合抗体是用人源抗体 的恒定区取代鼠源性抗体的恒定区而得来的一种组 一
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Marker%GatedMean AIl100.0023.56 Ml87.26323
M212.83l6l7l
图3抗CD3嵌合抗体免疫竞争实验 Fig.3Cmnpethlvc[mmunO['luore~,ccrluq:inhibition
AI.PBScontrol:2.1lrr3a;3.Hrl3a+anti-CD3antibody
Bl,Freerumculturemedium:2.anti-CD3antibody
合抗体,嵌合抗体去除了鼠源抗体中免疫原性较强
的恒定区,代之以人的恒定区,因而嵌合抗体的免疫
原性大为降低.我们通过基因工程技术,建立了稳
图4抗CD3嵌合抗体SDS~PAGE及We~m-blot免疫印迹图 Fig.4SDS-PAGEandWesternblotofantiCD3antibody
A.SDS-PlAGE
I.Anti-CD3antibody;2.HIT3a;3.ttumanIgG;
4.Flee琵n姗cIIIturerIlediLIII[I B.Wcstgrn-bht
I.1Ium?I;2.Frccn?cUltm~medium;3.Anti-CD3antibody
2O
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cIcentra【10nofantibody/(ng/mL) 图5H.TdR掺人促单核细胞增殖实验
F.5'H?TdRincorporationassayofproliferation
ofPBMCinthepresenceofantl?CD3antibody 一
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定分泌抗CD3嵌合抗体转染的细胞株.且经多次冻
存和复苏仍具有稳定分泌抗CD3嵌合抗体的能力. 从FACS测定及'H.TdR掺入体外刺激外周血单棱细 胞增殖反应试验来看,其结果显示.抗CD3嵌台抗 体与鼠源性抗体HIT3a竞争结合Jurkat细胞,结合 位点基本一致,并能促进外周血单核细胞的增殖,为 其在临床应用上提供了可靠的实验数据. 抗CD3抗体是细胞多克隆刺激剂,在低浓度 CD3抗体在体内外具有活化T细胞作用.并能通过 TCR途径刺激活化增殖,诱导PBMC和脾淋巴细胞 中多种细胞的细胞毒活性,在IL-2的协同下.杀伤 肿瘤细胞,促进细胞产生多种与机体免疫机制有关 的细胞因子.这也是人体内免疫系统控制和杀伤肿 瘤细胞的主要机制之一.'"】.因此,嵌合抗体 (I|;G)是完整的抗体分子,因其含有人抗体的Fc段, 所以能有效地与效应细胞上的Fc受体结合,嵌合抗 体可用于抗肿瘤,抗感染,抗自身免疫等疾病的治 疗.实验证明本文所构建的抗CD3嵌合抗体分子 表达载体可在CHO细胞中表达.且由于前导序列的 存在,抗体分子为分泌性表达.所表达的抗体分子具 有与CD3抗原特异性结合活性.使其今后有可能开 发成为一种可用于临床治疗的生物技术药物. REFERENCES(参考文献)
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myoi"Medicd
,&抽UnionMedlcalCoflege.300020.CMna)
Abstracteanti-CD3antibodycanimprovesuccessrateoforganstransplant.HIT3a,amotlg~anti-CD3antibody,waBchim-
erizedbyusinggeneengineeringmethodstodecreaseitsimmunogenity,II'leanti-CD3genes.heavychainandlightchain.忡
clonedusingPCRfromthevectorpCANTAB5Econta/ninganti-CD3scFvgenefragment.andtwoPCRfragmentswerel'L~,om-
binedintotheexpressionvectorpKN100withhumanantibodylightconstantdomainandPGlD105withhumanantibodyheavy
constantdomain,respectively..ntwovectorswereco-transfectedintoCHOcellsusingliposome.111eanti-CD3antibody懈
detectedbyELISAandWesternblotassayinsupernatantoftran~fectedCHOcelhculture.rheprimaryresultsofcompetitive暑s—
saysbyFACSshowedthatanti-CD3antibodycouldpartiallyblockthesitesthroughwhichparentantibody(HIT3a)bindtoCD3
Jurkatcells.TheresuhofHTdRincorporationshowedthatthechimericanti.CD3antibodycouldstimulatedproliferation0fpe-
nphere]bloodmononuclearcells(PBMC)舾
theltma'cntantibody.Inthisthesis.theresultsof8omeexperimentsindicatedthatthe chimericanti?CD3antibodyexpressedinClIOcellswa8anantibodywithnativebiologicalactivity.andit.玛possibletoapplyto
inclicinthehture.
Keywordsanti?CD3antibody,chimericantibody,geneexpression
Received:0417.20O3
Thisworkw鄄
supportedbyGrantsfromtheStateHightTechnologyResearchandDevelopmentPTog姗
(863n旧)oftheChineseffmvmt(No
21~0141sad2001AA215341)?dKeyFund0fTianjinCityGovernment(No.00311951I). C砸鹄pongamber.Tel:g6-22-27230740Fax:S6,2227230740;F.,qtmil:ezysag@public...
原文载于生物工程2003,19(5):527—531
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